專利名稱：一種檢測(cè)植物根際微生物的熒光原位雜交方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)植物根際微生物的熒光原位雜交方法。
背景技術(shù)：
根際微生物(rhizosphere microbe)是在植物根系直接影響的土壤范圍內(nèi)生長(zhǎng)繁殖的微生物，其種類有細(xì)菌、放線菌、真菌、藻類和原生動(dòng)物等，一般數(shù)量比根際外多幾倍至幾十倍。它們和植物間是互生關(guān)系，與植物根系相互作用、相互促進(jìn)。根據(jù)植物根系與根際微生物共存形式又分為多種形式，最常見(jiàn)的如豆科植物與相應(yīng)的根瘤細(xì)菌、外生菌根、內(nèi)生菌根以及病原菌復(fù)合體等。
近年來(lái)，隨著宏基因組學(xué)與分子生態(tài)技術(shù)迅速發(fā)展，微生物熒光原位雜交 (fluore·scence in situ hybridization,FISH)結(jié)合的顯微鏡觀測(cè)成為了解根際微生物的有力工具。熒光原位雜交是在20世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù)。它以熒光染料標(biāo)記的16S rDNA和16S rRNA寡核苷酸序列作為探針，按照兩個(gè)核酸的堿基序列互補(bǔ)原則，將熒光素標(biāo)記的探針直接原位雜交到染色體或DNA纖維切片上(也可使用生物素標(biāo)記的探針，再加入標(biāo)記有熒光素的生物素單抗)，通過(guò)熒光檢測(cè)系統(tǒng)和圖形分析技術(shù)對(duì)染色體或DNA纖維上的DNA序列進(jìn)行定位、定性和相對(duì)定量分析，實(shí)現(xiàn)原位樣品中的目標(biāo)細(xì)菌的探測(cè)。
熒光原位雜交技術(shù)已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用于植物根際微生物的觀察，但是目前普遍存在一些難點(diǎn)問(wèn)題，主要集中在兩個(gè)方面。第一個(gè)方面也是最大的一個(gè)難點(diǎn)是植物根系本身通常具有較強(qiáng)的自發(fā)熒光。植物樣本采集后的最初24小時(shí)之內(nèi)是觀測(cè)的最佳時(shí)機(jī)，之后由于植物本身逐漸加強(qiáng)的自發(fā)熒光現(xiàn)象嚴(yán)重干擾了微生物的觀測(cè)，但現(xiàn)實(shí)操作中很難保證采集植物樣本后能夠及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。第二個(gè)方面是根際微生物稀疏的分布使得顯微鏡觀測(cè)過(guò)程中難以尋找到目的微生物，并且隨著時(shí)間的推移，根系本身逐漸加強(qiáng)的自發(fā)熒光現(xiàn)象使觀測(cè)更加困難。這兩個(gè)難點(diǎn)為植物根際微生物FISH觀測(cè)的瓶頸。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)植物根際微生物的熒光原位雜交方法。
本發(fā)明提供的用于檢測(cè)植物根際微生物的熒光原位雜交方法，包括如下步驟
(I)植物根系片段的固定；
(2)熒光原位雜交；
其特征在于所述步驟(I)和所述步驟(2)之間還包括如下步驟甲將完成步驟 (I)的植物根系片段用O. 0001至O. lmol/L焦磷酸四鈉水溶液進(jìn)行處理，然后棄去所述植物根系片段。
所述步驟甲中的處理?xiàng)l件可為20-30°C、15-60分鐘。所述步驟甲中的處理?xiàng)l件具體可為22°C、20分鐘。所述步驟甲中，所述焦磷酸四鈉水溶液的濃度具體可為0. OOlmol/ L0
所述方法還可包括如下步驟乙將完成所述步驟甲的溶液體系(反應(yīng)習(xí)題)離心收集沉淀，用PBS緩沖液沖洗并懸浮。所述PBS緩沖液具體可為pH = 7. 4、IOmmol的PBS 緩沖液。每株植物的根系片段完成所述步驟甲的溶液體系得到的沉淀優(yōu)選采用2-5ml所述 PBS緩沖液進(jìn)行所述懸浮。所述兩步驟乙中的所述離心的條件具體可為16000g，30秒。
所述步驟(I)具體可為將所述植物根系片段浸泡于溶液甲中12小時(shí)；所述溶液甲是將3體積份固定液和I體積份3XPBS緩沖液混合得到的；所述固定液的pH為7.0-7. 4，含有4g/100ml多聚甲醛。所述固定液的配制方法具體如下(以IOOml體積為例) (I)取66ml超純水在水浴中加熱至600C ； (2)加入4g多聚甲醛；(3)加入2mol/L的NaOH 水溶液至多聚甲醛充分溶解；⑷用3XPBS緩沖液補(bǔ)足至IOOml ； (5)室溫下放置冷卻，用 lmol/L的HCl水溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0-7. 4; (6)用注射器通過(guò)濾頭(O. 22 μ m)過(guò)濾。所述 3XPBS緩沖液具體可為pH = 7. 4、30mmol的PBS緩沖液。
所述突光原位雜交的條件具體可為46°C雜交1. 5小時(shí)。
所述熒光原位雜交所用的探針上具有熒光素標(biāo)記。所述熒光素具體可為FLUOS熒光素。所述熒光原位雜交所用的探針的核苷酸序列具體可如序列表的序列I所示。所述熒光素可位于所述探針的5’端或3’端。在所述熒光原位雜交中，所述探針的濃度優(yōu)選為8.3pmol/ μ I或5pmol/μ I。所述植物根際微生物具體可為真細(xì)菌。
所述植物具體可為燈芯草(Juncus acutiflorus)。本發(fā)明提供的方法具體可包括如下步驟
①將植物的根系組織切割成1. 5-2. 5cm(2cm左右)長(zhǎng)度的根系片段；
②將所述根系片段浸泡于所述溶液甲(以足夠?qū)⑺龈灯瓮耆蜎](méi)為準(zhǔn)，2-5ml均可)中進(jìn)行10-15小時(shí)(如12小時(shí))的固定；
③將步驟②的反應(yīng)體系離心(具體可為16000g，30秒)收集沉淀并用所述PBS 緩沖液沖洗兩次，然后用所述焦磷酸四鈉水溶液(以足夠?qū)⑺龈灯瓮耆蜎](méi)為準(zhǔn)，5-10ml均可)懸浮，在22°C水浴中培養(yǎng)20分鐘(為使作用完全每5分鐘漩渦振蕩一次，每次振蕩約10-20秒);
④將步驟③的反應(yīng)體系中的植物根系取出后離心(如16000g，30秒)收集沉淀并用所述PBS緩沖液沖洗兩次，然后用所述PBS緩沖液(以足夠?qū)⑺龈灯瓮耆蜎](méi)為準(zhǔn),2-5ml均可)懸??；
⑤將10 μ I步驟④得到的懸浮液滴加至載玻片上，使其干燥(可用氮?dú)獯蹈桑部稍诳諝庵凶匀伙L(fēng)干)；
⑥將步驟⑤得到的載玻片依次在50%乙醇水溶液、80%乙醇水溶液和100%乙醇浸泡3分鐘；
⑦將10μ I雜交緩沖液滴至載玻片的樣品上，加入1μ I所述探針并與雜交緩沖液混合均勻，46°C雜交1. 5小時(shí)；
⑧用淋洗緩沖液沖洗掉載玻片上的雜交緩沖液，然后將載玻片浸泡于所述淋洗緩沖液中，48°C水浴靜置20分鐘；用蒸餾水沖洗后使其干燥(可放置于46°C烘箱中進(jìn)行干燥，也可利用氣體吹干)；
⑨進(jìn)行DAPI染色后用熒光顯微鏡觀察。
所述雜交緩沖液的制備方法具體可為將180 μ I 5Μ NaCl水溶液、300微升的甲酰胺、2 μ I 10g/100ml SDS水溶液依次加入并混勻，并用milliQ超純水定容至I毫升。所述雜交緩沖液由水和如下濃度的各個(gè)溶質(zhì)組成=NaCl O. 9M、SDS O. 02g/100ml、甲酰胺30% (體積比)。
所述淋洗緩沖液的制備方法具體可為將Iml Tris-HCl緩沖液(1M、pH = 8. O)、 1020 μ I 5Μ NaCl 水溶液、500 μ I O. 5Μ EDTA 水溶液(pH = 8. O)混勻，并用 milliQ 超純水補(bǔ)足至50ml。所述淋洗緩沖液由水和如下濃度的各個(gè)溶質(zhì)組成=Tris-HCl O. 02M、NaCl O. 102Μ、0· 005Μ EDTA0
所述DAPI染色時(shí),可以加入抗粹滅劑。所述抗淬滅劑具體可為Vectorshield。
本發(fā)明提供的方法可以對(duì)采集后的樣本進(jìn)行即時(shí)檢測(cè)，也可以允許采集后將樣本放置保存一定時(shí)間后再進(jìn)行檢測(cè)，特別是對(duì)于放置24小時(shí)以上的樣本，避免了自發(fā)熒光， 具有突出良好的效果。
本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)焦磷酸四鈉水溶液可達(dá)到使植物根系與表面微生物發(fā)生解離的現(xiàn)象。在此基礎(chǔ)上，對(duì)現(xiàn)有FISH方法進(jìn)行改進(jìn)，在現(xiàn)有FISH方法的固定與熒光原位雜交兩個(gè)步驟之間，增加了焦磷酸四鈉水溶液處理的步驟。本發(fā)明中的技術(shù)方案為將簡(jiǎn)單清洗去除土壤及沉積物顆粒之后的植物根系片段進(jìn)行固定；用焦磷酸四鈉水溶液處理固定之后的樣品，通過(guò)焦磷酸四鈉對(duì)根際微生物與其附著物(根系或土壤、沉積物顆粒)的解離作用，達(dá)到將二者分離的效果，去除原有附著物后，對(duì)包含解離脫落的微生物的所余溶液進(jìn)行離心與再懸??；繼續(xù)進(jìn)行接下來(lái)的熒光原位雜交。本發(fā)明解決了植物根系FISH觀測(cè)中植物本身常發(fā)生的自發(fā)熒光現(xiàn)象和根系本身附著根際微生物含量較小不便于觀測(cè)的難點(diǎn)問(wèn)題。


圖1為實(shí)施例1中的FISH結(jié)果圖；橫線代表10微米，圓圈內(nèi)為目標(biāo)微生物。
圖2為實(shí)施例2中的FISH結(jié)果圖；橫線代表10微米，圓圈內(nèi)為目標(biāo)微生物。
圖3為實(shí)施例3中的FISH結(jié)果圖；橫線代表10微米，圓圈內(nèi)為目標(biāo)微生物。
圖4為對(duì)比例中的FISH結(jié)果圖；圓圈內(nèi)為目標(biāo)微生物。
具體實(shí)施方式
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。
實(shí)施例中所用的PBS緩沖液為pH = 7. 4U0mmol的PBS緩沖液；該P(yáng)BS緩沖液 (pH = 7. 4)由溶質(zhì)和水組成，溶質(zhì)及其濃度如下=NaCl 137mmol · L-1，Na2HPO4IOmmol · L-1， KH2PO41. 76 · mmol. L、
實(shí)施例中所用的3XPBS緩沖液為pH = 7. 4、30mmol的PBS緩沖液；該P(yáng)BS緩沖液 (pH = 7. 4)由溶質(zhì)和水組成，溶質(zhì)同PBS緩沖液，各個(gè)溶質(zhì)的濃度均為PBS緩沖液的三倍。
燈芯草(Juncus acutiflorus)為常見(jiàn)濕地植物，參考文獻(xiàn)成水平人工濕地廢水處理系統(tǒng)的生物學(xué)基礎(chǔ)研究進(jìn)展湖泊科學(xué)，1996,8(3) =268-273.;吳建強(qiáng)，阮曉紅，王雪人工濕地中水生植物的作用和選擇水資源保護(hù)，2005，21 (I) :1-6。
實(shí)施例1、采用本發(fā)明的方法進(jìn)行熒光原位雜交
1、自濕地中取一株燈芯草(Juncus acutiflorus)的根系組織,取樣48小時(shí)后,用去離子水清洗去除表面附著的過(guò)多濕地沉積物與土壤殘余；然后將根系組織切割成2cm左右長(zhǎng)度的根系片段。
2、將步驟I獲得的根系片段浸泡于2_5ml (足夠?qū)⒏灯瓮耆蜎](méi)為準(zhǔn))溶液甲中進(jìn)行12小時(shí)的固定。
所述溶液甲是將3體積份固定液和I體積份PBS緩沖液混合得到的。
固定液的配制方法如下(以IOOml體積為例)(I)取66ml超純水在水浴中加熱至60°C;⑵加入4g多聚甲醛至水中，混合液會(huì)變渾濁；(3)緩緩加入2mol/L的NaOH水溶液至混合液中直至溶液清澈；(4)用3XPBS緩沖液補(bǔ)足至IOOml ； (5)室溫下放置冷卻，用 lmol/L的HCl水溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0-7. 4 ； (6)用注射器通過(guò)濾頭(O. 22 μ m)過(guò)濾。
3、將步驟2的反應(yīng)體系離心(16000g，30秒)，收集沉淀并用PBS緩沖液沖洗兩次， 然后用5-10ml (足夠?qū)⒏灯瓮耆蜎](méi)為準(zhǔn))O. OOlmol/L焦磷酸四鈉水溶液懸浮(為使作用完全可先漩渦振蕩I分鐘)，在22°C水浴中培養(yǎng)20分鐘(為使作用完全每5分鐘振蕩一次，每次振蕩約10-20秒)。
4、將步驟3的反應(yīng)體系中的根系片段取出，剩余的反應(yīng)體系(溶液體系)離心 (16000g, 30秒)，收集沉淀并用PBS緩沖液沖洗兩次，然后用2-5ml (足夠?qū)⒏灯瓮耆蜎](méi)為準(zhǔn))PBS緩沖液懸浮。
實(shí)際應(yīng)用時(shí)，可以根據(jù)實(shí)際需要確定本步驟中最后加入的PBS緩沖液體積，小量的PBS緩沖液可起到富集作用。本步驟得到的樣本如需長(zhǎng)期保存可保存于100%乙醇和PBS 緩沖液等體積混合得到的混合液中，_20°C保存。
5、將10 μ I步驟4得到的懸浮液滴加至載玻片上，用氮?dú)獯蹈?也可在空氣中自然風(fēng)干)。
實(shí)際應(yīng)用時(shí)，如果樣品顆粒較大可使用0.1 %瓊脂糖膠點(diǎn)在樣品上后干燥，起到固定作用。
6、將步驟5得到的載玻片依次在50%乙醇水溶液、80%乙醇水溶液和100%乙醇浸泡3分鐘。
實(shí)際應(yīng)用中，本步驟處理后可將樣品可以儲(chǔ)藏于_20°C條件下。
7、將10μ I雜交緩沖液滴至載玻片的樣品上，加入1μ I雜交探針，用移液器槍頭輕輕攪動(dòng)用以混合；46°C雜交1. 5小時(shí)。
本實(shí)施例中所用的雜交探針為針對(duì)真細(xì)菌的EUB338探針，核苷酸序列為(序列表的序列I) :5’ -GCTGCCTCCCGTSGGAGT-3’(5’末端標(biāo)記FLUOS熒光素)，雜交探針濃度為 8.3pmol/μ I。
實(shí)施例中所用的雜交緩沖液的制備方法將180 μ I 5Μ NaCl水溶液、300微升的甲酰胺、2 μ I 10g/100ml SDS水溶液依次加入并混勻，并用milliQ超純水定容至I毫升。 雜交緩沖液中各溶質(zhì)的濃度如下=NaCl 0.9M、SDS 0. 02g/100ml、甲酰胺30% (體積比)。
實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)具體的探針選擇合適的雜交緩沖液。實(shí)際應(yīng)用中，如果采用 Cy3或者Cy5標(biāo)記的雜交探針，雜交探針濃度最好為5pmol/ μ I。
8、用少量淋洗緩沖液沖洗掉載玻片上的雜交緩沖液，然后將載玻片浸泡于淋洗緩沖液中，48°C水浴靜置20分鐘；將載玻片表面的淋洗緩沖液用預(yù)冷卻的蒸餾水沖洗掉，放置于46°C烘箱中進(jìn)行干燥(也可利用氣體吹干)。
實(shí)施例中所用的淋洗緩沖液的制備方法將Iml Tris-HCl緩沖液(1Μ、ρΗ = 8.0),1020 μ I5M NaCl水溶液、500 μ I O. 5Μ EDTA水溶液(pH = 8. O)混勻，并用milliQ超純水補(bǔ)足至50mlO淋洗緩沖液中各溶質(zhì)的濃度如下=Tris-HCl O. 02M、NaCl O. 102Μ、0· 005Μ EDTA。
實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)具體的探針選擇合適的淋洗緩沖液。
9、將預(yù)混有DAPI染料的Vectorshield(抗淬滅劑)滴加至載玻片的樣本上，蓋上蓋玻片，用突光顯微鏡(Zeiss Axioplan 2microscope ；Zeiss, Jena, Germany)觀察。
見(jiàn)圖1。可以清晰觀察到帶有熒光的目的微生物。
實(shí)施例2、采用本發(fā)明的方法進(jìn)行熒光原位雜交
1、同實(shí)施例1的步驟I。
2、同實(shí)施例1的步驟2。
3、采用O. 0001mol/L焦磷酸四鈉水溶液，在20°C水浴中培養(yǎng)15分鐘，其它同實(shí)施例I的步驟3。
4、同實(shí)施例1的步驟4。
5、同實(shí)施例1的步驟5。
6、同實(shí)施例1的步驟6。
7、同實(shí)施例1的步驟7。
8、同實(shí)施例1的步驟8。
9、同實(shí)施例1的步驟9。
見(jiàn)圖2?？梢郧逦^察到帶有熒光的目的微生物。
實(shí)施例3、采用本發(fā)明的方法進(jìn)行熒光原位雜交
1、同實(shí)施例1的步驟I。
2、同實(shí)施例1的步驟2。
3、采用0. lmol/L焦磷酸四鈉水溶液，在30°C水浴中培養(yǎng)60分鐘，其它同實(shí)施例1的步驟3。
4、同實(shí)施例1的步驟4。
5、同實(shí)施例1的步驟5。
6、同實(shí)施例1的步驟6。
7、同實(shí)施例1的步驟7。
8、同實(shí)施例1的步驟8。
9、同實(shí)施例1的步驟9。
見(jiàn)圖3。可以清晰觀察到帶有熒光的目的微生物。
對(duì)比例、采用現(xiàn)有方法(無(wú)焦磷酸四鈉水溶液解離處理)進(jìn)行熒光原位雜交
1、同實(shí)施例1的步驟I。
2、同實(shí)施例1的步驟2。
3、將步驟2的反應(yīng)體系(含根系片段)滴加至載玻片上，用氮?dú)獯蹈伞?br> 4、同實(shí)施例1的步驟6。
5、同實(shí)施例1的步驟7。
6、同實(shí)施例1的步驟8。
7、同實(shí)施例1的步驟9。
見(jiàn)圖4。根系顯示很強(qiáng)的自發(fā)英冠，不能清晰觀察到帶有熒光的目的微生物。
序列表〈110〉中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心〈120〉一種檢測(cè)植物根際微生物的熒光原位雜交方法<130> CGGNAY1120856〈160〉 I〈210〉 I<211〉18 〈212〉 DNA <213〉人工序列〈220〉 <223>〈400〉 Igctgcctccc gtsggagt18
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)植物根際微生物的熒光原位雜交方法，包括如下步驟(1)植物根系片段的固定；(2)熒光原位雜交；其特征在于所述步驟(I)和所述步驟(2)之間還包括如下步驟甲將完成步驟(I)的植物根系片段用O. 0001至O. lmol/L焦磷酸四鈉水溶液進(jìn)行處理，然后棄去所述植物根系片段。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟甲中的處理?xiàng)l件為20-30°C、 15-60分鐘。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟甲中的處理?xiàng)l件為22°C、20分鐘； 所述焦磷酸四鈉水溶液的濃度為O. 001mol/L。
4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括如下步驟乙將完成所述步驟甲的溶液體系離心收集沉淀，用PBS緩沖液沖洗并懸浮。
5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(I)為將所述植物根系片段浸泡于溶液甲中12小時(shí)；所述溶液甲是將3體積份固定液和I體積份3XPBS緩沖液混合得到的；所述固定液的PH為7. 0-7. 4，含有4g/100ml多聚甲醛。
6.如權(quán)利要求1至5中任一所述的方法,其特征在于所述突光原位雜交的條件為 46°C雜交1. 5小時(shí)。
7.如權(quán)利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于所述熒光原位雜交所用的探針上具有熒光素標(biāo)記；所述熒光素優(yōu)選為FLUOS熒光素。
8.如權(quán)利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于所述熒光原位雜交所用的探針的核苷酸序列如序列表的序列I所示。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述熒光原位雜交所用的探針的濃度為 8.3pmol/μ I。
10.如權(quán)利要求1至9中任一所述的方法，其特征在于所述植物為燈芯草。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)植物根際微生物的熒光原位雜交方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟(1)植物根系片段的固定；(2)熒光原位雜交；其特征在于所述步驟(1)和所述步驟(2)之間還包括如下步驟甲將完成步驟(1)的植物根系片段用0.0001至0.1mol/L焦磷酸四鈉水溶液進(jìn)行處理。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)焦磷酸四鈉水溶液可達(dá)到使植物根系與表面微生物發(fā)生解離的現(xiàn)象。在此基礎(chǔ)上，對(duì)現(xiàn)有FISH方法進(jìn)行改進(jìn)，在現(xiàn)有FISH方法的固定與熒光原位雜交兩個(gè)步驟之間，增加了焦磷酸四鈉水溶液處理的步驟。本發(fā)明解決了植物根系FISH觀測(cè)中植物本身常發(fā)生的自發(fā)熒光現(xiàn)象和根系本身附著根際微生物含量較小不便于觀測(cè)的難點(diǎn)問(wèn)題。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102994614SQ20111026685
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者祝貴兵, 王雨, 尹澄清 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心