一種小麥基因組dna提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物基因組DNA提取方法，具體涉及一種小麥基因組DNA提取方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著分子生物學(xué)不斷的發(fā)展，眾多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的樣本需求量都很大，簡便快 捷高效穩(wěn)定的DNA提取技術(shù)是從分子水平上推進(jìn)小麥相關(guān)研宄發(fā)展的必要前提，也是研宄 效率的關(guān)鍵。小麥基因組的DNA提取一般須經(jīng)過破碎細(xì)胞壁、裂解細(xì)胞膜、除去多糖和多 酚等次生物質(zhì)、變性分離蛋白質(zhì)、沉淀核酸、去除RNA和濃縮DNA等幾個步驟。一般來說， CTAB(十六烷基三乙基溴化銨）法對處理含多糖成分的植物組織有獨(dú)特的優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用 于植物基因組DNA的提取，而SDS(十二烷基硫酸鈉）法在植物基因組DNA的提取中應(yīng)用較 少，主要應(yīng)用于對模板DNA質(zhì)量要求不太嚴(yán)的RAH)分析。但傳統(tǒng)的CTAB法操作繁瑣，試劑 消耗量大，并且使用器皿多，研磨器皿等需要重復(fù)利用，易造成樣品污染，產(chǎn)率也較低。
[0003] 目前，關(guān)于植物DNA提取方法的報(bào)道絕大部分都是在SDS法和CTAB法基礎(chǔ)上進(jìn)行 改良，但都無法擺脫用研磨棒或玻璃棒對樣品逐個研磨的操作步驟，且提取步驟繁瑣耗時。 近年來也出現(xiàn)了植物DNA其他的簡易提取方法，如高鹽低pH值法、堿處理法、高溫水煮法 等，雖然這些方法步驟簡單、速度快、成本低，避免使用液氮、苯酚等試劑，但是往往存在著 DNA提取質(zhì)量較差、一天能夠提取300份樣品左右，不能滿足要求較高的PCR擴(kuò)增等諸多問 題。因此，迫切需要建立一個快速經(jīng)濟(jì)高通量高質(zhì)量的DNA提取方法，為PCR擴(kuò)增、分子標(biāo) 記輔助育種、基因定位和轉(zhuǎn)基因植物檢測等多種分子實(shí)驗(yàn)提供有效手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種簡便、快速、高通量、高質(zhì)量的小麥基因 組DNA提取方法。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，一種小麥基因組DNA提取方法，將待 提取小麥材料樣品分別置于96孔板中，接著在每孔中放入鋼珠，開蓋置于真空冷凍干燥器 中在-100~-120°C冷凍干燥20~28h，然后利用研磨儀對小麥材料樣品進(jìn)行研磨；最后采 用改良的SDS法利用排槍從研磨后的粉末中提取DNA。
[0006] 進(jìn)一步，所述小麥材料為小麥種子播種發(fā)芽，第一片真葉展開后的新鮮真葉；所述 每孔待提取小麥材料樣品的用量為50~100mg。
[0007] 進(jìn)一步，所述新鮮真葉的長度為4~6cm。
[0008] 進(jìn)一步，所述96孔板為96孔聯(lián)體試管板，使用96孔聯(lián)體試管板，而不是單個離心 試管，對葉片進(jìn)行冷凍干燥后粉碎，無需使用液氮。
[0009] 進(jìn)一步，每孔放入1個無水酒精清洗的鋼珠，每個小試管中放入一個鋼珠保證各 個樣品單獨(dú)研磨避免了其他方法研磨時出現(xiàn)研磨器具重復(fù)使用造成交叉污染的可能性。
[0010] 進(jìn)一步，所述采用改良的SDS法利用排槍從研磨后的粉末中提取DNA的方法，包括 以下步驟：
[0011] (1)將研磨后的粉末樣品在2~6°C，4000rpm，離心lOmin后，利用排槍向管中加 入SDS提取液，勻質(zhì)化后，加入等體積酚、氯仿和異戊醇的混合液搖勻，其中酚：氯仿：異 戊醇的體積比為25 : 24 : 1，在-20°C冰箱冷凍lOmin后，接著在4°C環(huán)境中靜置lOmin;
[0012] (2)取出樣品稱量配平，在2~6°C，4000rpm，離心20~25min，利用排槍自上往 下緩慢吸取上清液于96孔板中，并在96孔板中加入與上清液體積比為1 : 10的NaAc和 1 : 1的-20 °C預(yù)冷的異丙醇，蓋上96孔蓋子混勻，放入-20 °C冰柜冷凍30~50min，直至 DNA沉析出；
[0013] (3)將冷凍過的樣品取出稱量配平在2~6°C，4000rpm，離心lOmin后，打開96孔 蓋子，迅速翻轉(zhuǎn)96孔板傾倒管中的全部液體，將96孔板倒置在干燥的吸水紙上吸濕2~ 3次，將96孔板翻轉(zhuǎn)朝上，加入與上清液等體積的75 %的酒精洗滌沉淀一次，在2~6°C， 4000rpm，離心5min，迅速傾倒全部清洗液，將96孔板倒置在干燥的吸水紙上吸濕2~3次， 將96孔板翻轉(zhuǎn)朝上，加入與上清液等體積的無水乙醇洗絳沉淀一次，在2~6°C，4000rpm， 離心5min，迅速傾倒全部清洗液，將96孔板倒置在干燥的吸水紙上吸濕2~3次，將96孔 板翻轉(zhuǎn)朝上，在超凈工作臺內(nèi)干燥2~3h，加入與上清液等體積的TE或ddH20。
[0014] 本發(fā)明通過真空冷凍干燥后用研磨儀對組織葉片進(jìn)行粉碎，1分鐘能同時研磨出 192個樣品，與傳統(tǒng)液氮研磨相比，極大地解放了人力并提高了工作效率。同時冷凍離心機(jī) 一次能夠離心4X96個即384個樣品，通過使用96孔板及排槍，使得加樣抽提效率大大提 高，同時，簡化了SDS法提取DNA的步驟，只需加一次提取液抽提一次上清，其余步驟均為洗 滌除雜，一輪下來即完成一次384樣品的DNA制備大概2小時；所提樣品DNA依據(jù)其濃度 完全可供100次PCR的使用。實(shí)驗(yàn)證明，在小麥拔節(jié)期采樣的葉片進(jìn)行DNA提取同樣能獲 得質(zhì)量較好的DNA，也能滿足SSR、STS、SCAR等分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，并且成功將約 10000個F2代植株進(jìn)行了分子標(biāo)記篩選，將2000個轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了檢測。
【附圖說明】
[0015] 圖1為瓊脂糖電泳檢測基因組DNA。
[0016] 圖2為WMC419標(biāo)記在親本及后代群體中的電泳圖。
[0017] 圖3為GWM11標(biāo)記在親本及后代群體中的電泳圖。
[0018] 圖4為WE173標(biāo)記在親本及后代群體中的電泳圖。
[0019] 圖5為小麥再生植株Bar基因的PCR結(jié)果。其中，3M:Marker;1:陽性對照；2:野 生型；3~23:陰性植株；黃色方框中為陽性植株。
[0020] 圖6為小麥再生植株載體序列（含Bar和LTP)PCR結(jié)果。其中，M:Marker;1:陽 性對照；2:野生型；3~22:陽性植株。
[0021] 圖7為小麥再生植株載體序列NW-22PCR結(jié)果。其中，M:Marker;1:野生型；2:陽 性對照；3~17:陰性植株；黃色方框中為陽性植株。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步加以說明。
[0023] 1、實(shí)驗(yàn)材料：小麥感病品種AvocetS和載體品種92R137以及兩者雜交的F2代群 體（10000株左右）；小麥轉(zhuǎn)基因材料西農(nóng)1376和小偃22 (2000株左右）
[0024]2、主要儀器設(shè)備和耗材：冷凍干燥器（CoolSafeTM110-4L，丹麥）、研 磨儀（QIAGEN)、通風(fēng)櫥、離心機(jī)（eppendorf5810R)、紫外分光光度儀NanoDrop ND2000/2000C(ThermoSCIENTIFIC)、電泳儀（北京六一DYY-6)、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-rad GelDoc)、96孔聯(lián)體試管盒（武漢儀興試驗(yàn)儀器設(shè)備廠）、96孔PCR板、排槍、鋼珠等。
[0025]3、試劑：SDS提取液（DSbuffer)配方：0?lmol/LTris-HCl(pH8. 0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)，2%SDS(pH8.0) ;3mol/LNaAC(PH5.2);酚：氯仿：異戊醇（25 : 24 : 1); 異丙醇；乙醇（70% 和 95%) ;1XTE緩沖液（10mmol/LTris-HCl，lmmol/LEDTA，pH8.0);瓊 脂糖（〇. 8%、1. 5% );丙烯酰胺凝膠（8% );溴化乙錠；硝酸銀。
[0026] 實(shí)施例1
[0027] 1、DNA提取
[0028] (1)將兩個F2代群體的種子播種發(fā)芽，待苗子高5cm，一般需要5~7天第一片真 葉展開后，取小麥幼葉5cm左右（干重約50mg)，將其分割成數(shù)段，按照對應(yīng)次序放入八連排 管中（每個試管容量為lml)，每個96孔試管盒裝有12排八連管。
[0029] (2)取樣完畢后，用置珠器在每個試管放入1個事先用無水酒精清洗好的鋼珠（直 徑4mm)，然后將樣品開蓋放置真空冷凍干燥器中，-110°C干燥24h。
[0030] (3)取出試管盒，迅速蓋上管蓋和磨樣盒蓋，將試管盒固定于研磨儀上，注意保持 兩側(cè)平衡，進(jìn)行研磨，一般25~30次/秒，1分鐘左右，示樣品而定。
[0031] (4)將磨好的樣品需進(jìn)行4°C，4000rpm，離心10min，以期粉狀樣品落入管底，然后 放置于_20°C冰箱中保存待提取DNA。
[0032] (5)樣品離心后打開管蓋，利用300ul排槍向管中加入220uLDSbuffer，勻質(zhì)化 后，加入等體積（220uL)酚、氯仿和異戊醇的混合液，其中酚：氯仿：異戊醇的體積比為 25 : 24 : 1〇
[0033] (6)對應(yīng)蓋上蓋子，用力搖勻后，振蕩動作不宜太劇烈，否則可能會導(dǎo)致DNA斷裂， 在-20°C冰箱冷凍10分鐘后，再在4°C環(huán)境中靜置10分鐘。
[0034](7)取出樣品并稱量配平，4°C，4000rpm，離心20~25min。
[0035] (8)用排槍自上往下緩慢吸取上清100ul于96孔板（帶帽）中，注意不要吸到分