專利名稱：檢測(cè)雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒的方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及用于檢測(cè)雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒的靶序列、熒光定量PCR引物和探針，本發(fā)明還涉及利用該靶序列進(jìn)行雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒檢測(cè)的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
雞產(chǎn)蛋下降綜合征(Egg drop syndrome, EDS)又稱為雞產(chǎn)蛋下降綜合征-76或減蛋綜合征-76(Egg drop syndrome-76,EDS-76)。雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒(EDSV)屬于腺病毒科禽腺病毒屬III群(Avian adenovirus Group III)。該病的特征是雞在性成熟前為隱性感染，雞開產(chǎn)后才表現(xiàn)出臨床癥狀，主要引起產(chǎn)蛋下降及卵殼形成不全等臨床癥狀，引起產(chǎn)蛋量的巨大損失。雞產(chǎn)蛋下降綜合征最初只局限于歐洲，隨后澳大利亞、比利時(shí)、法國(guó)、英國(guó)等國(guó)家發(fā)生該病。李剛等于1991年分離到EDSV，從而證實(shí)了 EDS在我國(guó)的存在。目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)EDS的方法主要為病原學(xué)方法、血清學(xué)方法、病毒核酸檢測(cè)法，其中常用的方法是血凝試驗(yàn)，常用的血凝試驗(yàn)對(duì)象常為鴨胚尿囊液，血清學(xué)檢測(cè)有特異性強(qiáng)，靈敏度高等特點(diǎn)，但是前期準(zhǔn)備工作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)、試驗(yàn)過程繁瑣，且需要有對(duì)應(yīng)的抗原或抗體。隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，PCR技術(shù)得到廣泛應(yīng)用，李文貴等報(bào)道了套式PCR檢測(cè)此病毒，其靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)PCR。Raue等用以六鄰體為基礎(chǔ)的PCR結(jié)合限制性酶切分析，成功檢測(cè)和鑒別診斷了 EDSV和12種禽腺病毒。王愛華等用膠體金顆粒為標(biāo)記物，制備了 EDSV膠體金試紙條并對(duì)該病毒進(jìn)行了檢測(cè)。董春娜等運(yùn)用等溫環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)EDSV，其靈敏度達(dá)60個(gè)拷貝，可準(zhǔn)確進(jìn)行雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒的檢測(cè)。但是傳統(tǒng)的PCR技術(shù)在應(yīng)用中還存在著不足，一是不能準(zhǔn)確定量，二是容易交叉污染，產(chǎn)生假陽性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)則可以結(jié)合傳統(tǒng)PCR的優(yōu)點(diǎn)并克服不足，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果和檢測(cè)樣品之間的定性和定量關(guān)系，從而可以根據(jù)需要對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量。另夕卜，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強(qiáng)、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無污染性、具實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。TaqMan熒光定量PCR方法有望在雞產(chǎn)蛋下降綜合征的診斷和預(yù)防提供了一種新的方法，同時(shí)也為該病毒在自然宿主體內(nèi)的致病性研究提供了一種新的技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供用于檢測(cè)雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒(EDSV)的熒光定量PCR方法，以提高對(duì)雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒的檢測(cè)能力。本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測(cè)雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒的試劑盒。本發(fā)明提供了用于檢測(cè)雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒的遺傳標(biāo)記物，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，該序列的特異性片段也可以作為檢測(cè)雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒的遺傳標(biāo)記物。
進(jìn)一步，本發(fā)明還提供用于特異性擴(kuò)征上述靶序列的引物，以及與所述引物配合使用的突光探針。可以使用諸如Primer Express Version 3等軟件來設(shè)計(jì)探針和引物。通常引物長(zhǎng)度為15-30個(gè)堿基，一條引物序列與本發(fā)明提供的遺傳標(biāo)記物序列相同，另一條引物序列與該遺傳標(biāo)記物序列互補(bǔ)；通常Taqman探針長(zhǎng)度為20_50個(gè)堿基，其序列與上述遺傳標(biāo)記物相同或互補(bǔ)，其5’標(biāo)記熒光基團(tuán)FAM，3’標(biāo)記淬滅基團(tuán)BHQ1。本發(fā)明探針和引物不但適用于已報(bào)道的國(guó)外EDSV毒株擴(kuò)增還適用國(guó)內(nèi)EDSV毒株的檢測(cè)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選的引物序列為Taq-EHFP :5，-GACCGGTCACAAAAACTTCATCT-3，(SEQ ID NO. 2)，Taq-EHRP :5’ -CACAATCCTGTTATCACCCACATTT-3’ (SEQ ID NO. 3)。 探針序列為5’FAM-CGCATCGTCCCGATCCAAACAGA-BHQ3’ (SEQ ID NO. 4)。本發(fā)明提供了一種用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，其含有EDSV特異性片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，用于擴(kuò)增該序列的特異性引物為EHF :5’ -AAACGGTGTTACCACTGAC-3’ (SEQ ID NO. 6)，EHR :5’ -AGCTGCTACCCATATCCA-3’ (SEQ ID NO. 7)。上述EDSV特異性片段選自于EDSV六鄰體蛋白基因序列上高度保守的區(qū)域。將擴(kuò)增出的特異性片段連接至載體后，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期片段完全吻合。所述載體優(yōu)選為pEASY-Tl 載體。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒的熒光定量PCR方法，是以上述標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)模板，以樣品總DNA為模板，以上述遺傳標(biāo)記物(SEQ ID NO. I)為靶序列，利用引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果；所述引物序列為Taq-EHFP 5，-GACCGGTCACAAAAACTTCATCT-3，，Taq-EHRP :5，-CACAATCCTGTTATCACCCACATTT-3，。探針序列為5’ FAM-CGCATCGTCCCGATCCAAACAGA-BHQ3’。本發(fā)明提供的檢測(cè)雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，其實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的 20 μ I 反應(yīng)體系為Premix Ex Taq2 X buffer 12. 5 μ L，10 μ mol/L 上游引物Taq-EHFP 和 10 μ mol/L 下游引物 Taq-EHRP 各 O. 4 μ L，10 μ M 探針 O. 8 μ L, ROX 染料 O. 4 μ L，模板(質(zhì)粒DNA) 2 μ L，補(bǔ)ddH20至20 μ L ;所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性30s，I個(gè)循環(huán)；95°C變性3s 5s，58°C 60°C退火30s 35s，40個(gè)循環(huán)。所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)選反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性30s，I個(gè)循環(huán)；95°C變性5s，60°C退火30s，40個(gè)循環(huán)。本發(fā)明每次檢測(cè)標(biāo)本時(shí)必須設(shè)立NTC對(duì)照(無模板對(duì)照)和POS對(duì)照(陽性對(duì)照)，兩種對(duì)照對(duì)于結(jié)果判讀起決定性作用有效擴(kuò)增NTC(_)ANDP0S(+)無效擴(kuò)增NTC(+)AND POS (+)提示體系污染無效擴(kuò)增NTC(_)AND POS(-)提示體系錯(cuò)誤或者試劑失效。只有對(duì)照有效擴(kuò)增情況下的樣品檢測(cè)結(jié)果才可信，否者試驗(yàn)需要重復(fù)。
在檢測(cè)中兩種對(duì)照為有效擴(kuò)增時(shí)，樣本結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下Ct值小于等于38的標(biāo)本為陽性結(jié)果；Ct值大于40的標(biāo)本為陰性結(jié)果；Ct值在38-40之間的標(biāo)本需要重復(fù)，重復(fù)試驗(yàn)如Ct值依然低于40判定為陽性擴(kuò)增，超過40判定為陰性擴(kuò)增。本發(fā)明提供了一種用于雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒檢測(cè)的試劑盒，其包括上述Taq特異性引物以及配合引物使用的Taqman探針。
本發(fā)明試劑盒含有的引物，其序列為Taq-EHFP 5，-GACCGGTCACAAAAACTTCATCT-3，，Taq-EHRP :5，-CACAATCCTGTTATCACCCACATTT-3，。本發(fā)明試劑盒含有的探針，其序列為5’ FAM-CGCATCGTCCCGATCCAAACAGA-BHQ3’。本發(fā)明提供的試劑盒，還包括熒光定量反應(yīng)液，陰性模板和陽性模板，所述陰性模板為去核酸水，所述陽性模板EDSV總DNA，陽性模板優(yōu)選為為本發(fā)明制得的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了上述Taq特異性引物以及配合引物使用的Taqman探針在制備檢測(cè)雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒試劑盒或檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的熒光定量PCR所使用的探針及配套引物特異性強(qiáng)且非常穩(wěn)定，反應(yīng)過程中能夠收集到很好的信號(hào)，且與其他病毒沒有交叉反應(yīng)的情況，發(fā)揮了很好的“雙保險(xiǎn)”作用。在組內(nèi)及組間重復(fù)性試驗(yàn)中，結(jié)果顯示濃度為lX108copies/y L和I X IO1Copies/μ L的模板CV值相對(duì)偏高,但仍低于2. 5%,其它濃度模板的CV值均小于I. 2%該方法最小檢出量達(dá)10拷貝/yL，在I.OXlO2 I.OXlO8拷貝/yL檢測(cè)范圍間有良好的的線性關(guān)系，R2 = 0.992。本發(fā)明方法檢測(cè)所有樣本的模板濃度均在建立方法的動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)，不必作對(duì)樣本做任何的稀釋和濃縮。EDSV人工感染雞群試驗(yàn)分離樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示，熒光定量PCR方法的陽性檢出率達(dá)到90. 6%，而常規(guī)PCR檢出率為56. 3%。本發(fā)明方法具有檢測(cè)準(zhǔn)確，靈敏度高、特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)，具有良好的標(biāo)本檢測(cè)能力。本發(fā)明方法的建立能夠解決雞產(chǎn)蛋下降綜合征早期診斷的問題，并且能夠?qū)崟r(shí)地反映病毒DNA的擴(kuò)增情況，動(dòng)態(tài)地反映出病毒在機(jī)體組織中的分布情況。


圖I為EDSV熒光定量PCR的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線，其中N :陰性對(duì)照；I 8 :I. OXlO1 I. OX IO8Copies/μ L標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的擴(kuò)增曲線。圖2為熒光定量PCR檢測(cè)EDSV的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2 = O. 992。圖3為常規(guī)PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果，I =DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DNA2000plus Marker ；2 7 :1. OX IO8 I. OX IO3Copies/μ L標(biāo)準(zhǔn)模板的擴(kuò)增；8 :陰性對(duì)照。圖4EDSV熒光定量PCR的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，I 3 :標(biāo)準(zhǔn)模板的擴(kuò)增曲線；4 6 :I. OX IO2Copies/μ L標(biāo)準(zhǔn)模板的擴(kuò)增曲線;7 9 CIAV, DEV、MDV的擴(kuò)增曲線；10 :陰性對(duì)照；11:陽性對(duì)照。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例I EDSV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建I實(shí)驗(yàn)材料I. I菌株、毒種和載體 雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒(EDSV) NE4株、雞傳染性貧血病毒(CIAV)CUX-I株、鴨瘟病毒(DEV)CV株、馬立克氏病毒(MDV) 814株為本實(shí)驗(yàn)室保存；DH5 α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；pEASY-Tl克隆試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。I. 2主要儀器與試劑ABI7900HT型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI);熒光定量PCR
2XEx premix Taq試劑盒、DNA片段回收試劑盒均購(gòu)于大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。2方法與結(jié)果2. I引物與探針設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank 登錄的 EDSV AV-127 株基因(Accession No. Y09598. I)序列，通過序列比對(duì)選擇高度保守的六鄰體蛋白編碼區(qū)基因作為擴(kuò)增區(qū)域，應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計(jì)I對(duì)特異引物，并由上海生工公司合成，EHF : 5 ’ -AAACGGTGTTACCACTGAC-3 ’，EHR :5’ -AGCTGCTACCCATATCCA-3’，其 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為 140bp，核苷酸序列如 SEQ ID No. 5 所示，上述引物用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。2. 2病毒的增殖與鑒定將本實(shí)驗(yàn)保存的EDSVNE4株毒液I : 100倍稀釋接種于10日齡鴨胚，O. 2mL/只，120h后收取尿囊液，以此方法，連傳3代，獲取的新鮮尿囊液用于血凝試驗(yàn)，選取血凝效價(jià)在214以上的尿囊液存于_70°C，備用。2. 3病毒DNA的提取參照李剛等[16]周錦萍，李剛，鄭明球，等.雞源和鴨源減蛋綜合征病毒DNA酶切圖譜分析[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，22 (2) :71 75提取尿囊液病毒DNA的方法，將純化的病毒用SDS (10% )(終濃度為1% )-蛋白酶K(20mg/mL)消化，飽和酚/氯仿/異戊醇(25 24 I)抽提，沉淀用無水乙醇洗滌，并用TE緩沖液溶解DNA，存于-20°C保存，備用。2. 4標(biāo)準(zhǔn)模板的建立以EDSV的DNA為模板，用特異性引物EHF和EHR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μ L，其中 CldH2O 16. 25 μ L, 10XPCR buffer2. 5 μ L, dNTP (2. 5mmol/L) 2 μ L，引物 EHF和弓丨物 EHR (均為 10 μ mol/L)各為 I μ L, EasyTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L) O. 25 μ L，DNA 模板 2 μ L。PCR 反應(yīng)條件預(yù)變性 94°C 3min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。PCR產(chǎn)物用1.5.%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定后，用引物EHF和EHR進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增出的特異性片段為140bp，與預(yù)期的目的片段大小相符。用膠回收試劑盒回收并純化基因片段。將純化好的基因片段連接到pEASY-Tl載體上，轉(zhuǎn)化至E. coli DH5 α中，經(jīng)PCR鑒定后，挑取陽性克隆測(cè)序，經(jīng)測(cè)序鑒定，插入的目的基因序列與已公布EDSV的AV-127毒株的六鄰體蛋白基因保守序列的一致性達(dá)100%。用質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒，通過紫外分光光度儀測(cè)定pEASY-Tl-edsv-h質(zhì)粒濃度為O. 17μ g/μ L，A260A280 = I. 75，根據(jù)公式拷貝數(shù)=質(zhì)粒濃度(g/μ L) X加樣體積X阿弗加德羅常數(shù)/(質(zhì)粒總長(zhǎng)度X —個(gè)堿基對(duì)的平均分子量)，阿弗加德羅常數(shù)(每mol的微粒數(shù))是6. 02X 1023拷貝/mol，得到質(zhì)粒樣品拷貝數(shù)為3. 94XlOicVyL,然后倍比稀釋至1.0X10 I. OX IO8拷貝/ μ L共8個(gè)稀釋度作為標(biāo)準(zhǔn)模板，_20°C保存?zhèn)溆谩Ｒ源俗鳛闊晒舛縋CR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，該質(zhì)粒命名為pEASY-Tl-edsv-h。實(shí)施例2EDSV TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法所用引物和探針的設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)GenBank 登錄的 EDSV AV-127 株基因(Accession No. Y09598. I)序列，通過序列比對(duì)選擇高度保守的六鄰體蛋白編碼區(qū)基因作為擴(kuò)增區(qū)域，確定用于檢測(cè)EDSV的遺傳標(biāo)記物，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示,進(jìn)一步通過序列比對(duì)設(shè)計(jì)taqman探針及其配套使用的引物設(shè)計(jì)，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示。所述引物序列為Taq-EHFP 5，-GACCGGTCACAAAAACTTCATCT-3，，Taq-EHRP :5，-CACAATCCTGTTATCACCCACATTT-3，。探針序列為 5，F(xiàn)AM-CGCATCGTCCCGATCCAAACAGA-BHQ3，。雖然引物和探針與靶序列完全互補(bǔ)是優(yōu)選的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在引物與模板存在一定的不互補(bǔ)(尤其是引物的5’端)的情況下，也能夠特異性的擴(kuò)增出所需的片段。含有這些引物的試劑盒和使用這些引物的方法都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，只要該引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物含有本發(fā)明的靶序列或其片段。實(shí)施例3雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立I、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的 20 μ I 反應(yīng)體系為Premix Ex Taq 2Xbufferl2. 5 μ L,10 μ mol/L 上游引物 Taq-EHFP 和 10 μ mol/L 下游引物 Taq-EHRP 各 0. 4 μ L，10 μ M 探針
0.8 μ L，ROX 染料 0. 4 μ L，模板(質(zhì)粒 DNA) 2 μ L，補(bǔ) ddH20 M 20 μ L0實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性30s，I個(gè)循環(huán)；95°C變性5s，60°C退火30s，40個(gè)循環(huán)。2、體系標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將實(shí)施例I制得的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板按照上述條件和體系進(jìn)行熒光定量PCR，通過對(duì)條件的優(yōu)化，精確配比模板濃度，選擇最合適的退火溫度，縮短加樣時(shí)間，得出EDSV的熒光定量擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線(圖I)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。EDSV熒光定量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板的濃度范圍在I. OX IO2 I. OX IO8拷貝/ μ L之間有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2 = O. 992，擴(kuò)增效率為 103. 1%ο3、結(jié)果的判定本發(fā)明每次檢測(cè)標(biāo)本時(shí)必須設(shè)立NTC對(duì)照(無模板對(duì)照)和POS對(duì)照(陽性對(duì)照)，兩種對(duì)照對(duì)于結(jié)果判讀起決定性作用有效擴(kuò)增NTC(_)ANDP0S(+)無效擴(kuò)增NTC(+)AND POS (+)提示體系污染
無效擴(kuò)增NTC(_)AND POS(-)提示體系錯(cuò)誤或者試劑失效。只有對(duì)照有效擴(kuò)增情況下的樣品檢測(cè)結(jié)果才可信，否則試驗(yàn)需要重復(fù)。在檢測(cè)中兩種對(duì)照為有效擴(kuò)增時(shí)，樣本結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下Ct值小于等于38的標(biāo)本為陽性結(jié)果；Ct值大于40的標(biāo)本為陰性結(jié)果；Ct值在38-40之間的標(biāo)本需要重復(fù)，重復(fù)試驗(yàn)如Ct值依然低于40判定為陽性擴(kuò)增，超過40判定為陰性擴(kuò)增。 實(shí)施例4 EDSV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的敏感性、特異性、重復(fù)性及穩(wěn)定性評(píng)價(jià)I、敏感性試驗(yàn)選取10倍倍比稀釋，濃度分別為I X IO1 I X IO8Copies/ μ L的標(biāo)準(zhǔn)模板，同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR和常規(guī)PCR，觀察兩者的最低檢出率，比較其敏感性。常規(guī)PCR反應(yīng)體系為20 μ L 10 XPCR buffer2. 5 μ L, dNTPs (2. 5mmol/L) 2 μ L，上下游引物(10 μ mol/L)各 I μ L，上下游引物序列分別如SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7所示，模板2 μ L，EasyTaq酶O. 25 μ L，加 ddH20 補(bǔ)足 20 μ L。以10倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板參照實(shí)施例3的方法進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)，得出擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線(圖I)，顯示本實(shí)驗(yàn)所建立的方法最低能檢測(cè)到初始濃度為I. OX IOcopies/ μ L的DNA。以相同的模板進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，用I. 5%瓊脂糖凝膠電泳顯示(圖3)，能檢測(cè)到初始濃度為1.0X104COpies/yL的DNA。結(jié)果說明本發(fā)明建立的熒光定量PCR方法比常規(guī)PCR方法檢測(cè)EDSV敏感度高1000倍。2、特異性試驗(yàn)提取雞傳染性貧血病毒(CAIV)、鴨瘟病毒(DEV)、馬立克氏病毒(MDV)的DNA，取等量的模板用實(shí)施例3建立的方法進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)，同時(shí)以ddH20作陰性對(duì)照，以實(shí)施例I制得的EDSV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作陽性對(duì)照，鑒定本發(fā)明方法的特異性。挑選I. O X IO6Copies/μ L^P I. O X IO2Copies/μ L 的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，CIAV、DEV、MDV 的DNA同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。結(jié)果見圖4，顯示標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒有良好的擴(kuò)增曲線及特異性，而CIAV、DEV、MDV三個(gè)陰性對(duì)照以及空白對(duì)照僅有輕微熒光信號(hào)可忽略，陽性對(duì)照有良好的擴(kuò)增曲線，從而表明本實(shí)驗(yàn)所建立的熒光定量RT-PCR檢測(cè)EDSV的方法具有良好的特異性。3、重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)組間重復(fù)性試驗(yàn)需用相同的樣品在同一反應(yīng)條件下進(jìn)行3次獨(dú)立的熒光定量PCR檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)則需每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，在同一反應(yīng)條件下進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，分別計(jì)算CT值的變異系數(shù)，變異系數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均數(shù)，比較重復(fù)性和穩(wěn)定性。將1\101 1父108(叩化8/^14示準(zhǔn)質(zhì)粒用于組內(nèi)及組間重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果(表I)顯示所有樣本的重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)(CV)均小于2. 5%，說明本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)EDSV的熒光定量PCR方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。表I熒光定量PCR檢測(cè)樣品組間及組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒的遺傳標(biāo)記物，其具有SEQ ID No. I所示的序列或其特異性片段。
2.用于擴(kuò)增權(quán)利要求I所述遺傳標(biāo)記物的特異性引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物，其核苷酸序列為Taq-EHFP :5’ -GACCGGTCACAAAAACTTCATCT-3’，Taq-EHRP :5’ -CACAATCCTGTTATCACCCACATTT-3’。
4.與權(quán)利要求2或3所述引物配合使用的熒光探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的熒光探針，其核苷酸序列為 . 5’ FAM-CGCATCGTCCCGATCCAAACAGA-BHQ3’。
6.一種用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，其含有EDSV特異性片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，用于擴(kuò)增該序列的特異性引物為EHF :5’ -AAACGGTGTTACCACTGAC-3’，EHR :5’ -AGCTGCTACCCATATCCA-3’。
7.一種雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，以權(quán)利要求6所述的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)模板，以樣品總DNA為模板，以權(quán)利要求I所述的遺傳標(biāo)記物為靶序列，利用權(quán)利要求書2或3所述的引物和權(quán)利要求4或5所述探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。
8.如權(quán)利要求7所述的雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的 20 μ I 反應(yīng)體系為=Premix Ex Taq2 Xbuffer 12. 5 μ L，10 μ mol/L 上游引物 EHFP和10 μ mol/L下游引物EHRP各O. 4 μ L，10 μ M探針O. 8 μ L，ROX染料O. 4 μ L，模板(質(zhì)粒DNA) 2 μ L，補(bǔ)ddH20至20 μ L ;所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性30s，I個(gè)循環(huán)；95°C變性58，601退火308，40個(gè)循環(huán)。
9.含有權(quán)利要求2或3所述引物和/或權(quán)利要求4或5所述探針的試劑盒。
10.權(quán)利要求2或3所述引物和/或權(quán)利要求4或5所述探針在制備檢測(cè)雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒試劑盒或檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒的方法及其試劑盒。通過對(duì)雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒基因測(cè)序和比對(duì)，提供了用于檢測(cè)雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒的遺傳標(biāo)記物、實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物和探針，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4所示，本發(fā)明還提供了對(duì)雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法和檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的檢測(cè)方法最小檢出量達(dá)10拷貝/μL，在1.0×102～1.0×108拷貝/μL檢測(cè)范圍間有良好的的線性關(guān)系，R2＝0.992本發(fā)明方法具有檢測(cè)準(zhǔn)確，靈敏度高、特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)，具有良好的標(biāo)本檢測(cè)能力。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102634605SQ20121008682
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月28日
發(fā)明者李剛, 李文超, 馬震原 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所