專利名稱：治療眼病的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疾病的治療，具體涉及治療眼病的方法和組合物。
背景技術(shù)：
在發(fā)達(dá)國(guó)家中，年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)是年齡相關(guān)性失明的主要原因。其發(fā)病率隨著壽命延長(zhǎng)和老年人口增多而增高(D. S. Friedman et al. , Arch Ophthalmol122,564(2004))。這是一種慢性疾病，特征在于視網(wǎng)膜中央?yún)^(qū)域(黃斑)的進(jìn)行性損壞，引起中央視野視力損失(J. Tuo, C. M. Bojanowski, C. C. Chan, Prog Retin Eye Res 23,229(2004))。AMD的一個(gè)關(guān)鍵特征是形成被稱為玻璃疣(drusen)的細(xì)胞外沉積，其集中在視網(wǎng)膜后面介于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)與脈絡(luò)膜之間的黃斑中及其周圍。迄今，尚未有這種疾病的治療被證明廣泛有效，尤其是對(duì)于其晚期形式。若干風(fēng)險(xiǎn)因素與AMD相關(guān)，包括年齡、吸煙和家族史(AREDS Research Group, Ophthamology 107, 2224 (2000)) 已進(jìn)行了候選基因關(guān)聯(lián)性研究和基因組范圍連鎖掃描來(lái)鑒定AMD的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子?；谂c其它視網(wǎng)膜疾病的關(guān)聯(lián)性或其已知功能，提出了許多候選基因。盡管有些這些基因中的一些稀有變體與疾病表型相關(guān)，但未觀察到可解釋大比例總體發(fā)病率的遺傳差異(J. Tuo,C. M. Bojanowski, C. C. Chan,Prog Retin Eye Res 23, 229 (2004)) 迫切需要關(guān)于 AMD 遺傳決定子的更多信息。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及鑒定與AMD易感性相關(guān)的人基因中的變異，其可用于鑒定或輔助鑒定有發(fā)生AMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體，并可用于診斷或輔助診斷AMD。其還涉及鑒定或輔助鑒定有發(fā)生AMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的方法，診斷或輔助診斷AMD的方法，用于這些方法中的多核苷酸(如，探針、引物)，包含探針或引物的診斷試劑盒，治療有AMD風(fēng)險(xiǎn)或患有AMD的個(gè)體的方法，以及用于治療有AMD風(fēng)險(xiǎn)或患有AMD的個(gè)體的組合物。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)或輔助檢測(cè)與人發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因的多核苷酸，以及在一些具體實(shí)施方案中，用于檢測(cè)或輔助檢測(cè)與人AMD相關(guān)的CFH基因的變異。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于鑒定或輔助鑒定有發(fā)生AMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的方法和組合物。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可用于治療患AMD或有發(fā)生AMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體。本公開(kāi)還提供用于檢測(cè)來(lái)自個(gè)體的樣品中變體CFH基因的診斷試劑盒。這樣的試劑盒可用于鑒定或輔助鑒定有患AMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體，以及用于診斷或輔助診斷個(gè)體中的AMD。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)變體CFH基因的分離多核苷酸；該分離多核苷酸包含特異性檢測(cè)與人發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因中的變異。分離多核苷酸可用于在來(lái)自個(gè)體的樣本中檢測(cè)與人AMD相關(guān)的變體CFH基因。本發(fā)明的多核苷酸進(jìn)一步可用于等 位基因-特異性分析(如，本領(lǐng)域已知的等位基因-特異性雜交，引物延伸，或連接分析)，從而檢測(cè)與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異。等位基因-特異性探針和引物可與一種基因的一種或多種等位基因特異性雜交而不與同一基因的其它等位基因雜交。例如，本發(fā)明的等位基因-特異性多核苷酸探針可與變體CFH基因雜交但不與野生型CFH基因雜交。在某些實(shí)施方案中，所述分離多核苷酸是在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與人發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因中變異相雜交的探針。在一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離多核苷酸探針在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含CFH基因的全部或部分、或其等位基因變體的核酸分子相雜交，其中所述核酸分子包含與人發(fā)生AMD相關(guān)的變異。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離多核苷酸探針在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含CFH基因的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸、或其等位基因變體的核酸分子相雜交，其中所述核酸分子包含與人發(fā)生AMD相關(guān)的變異。在另一些實(shí)施方案中，所述分離多核苷酸是在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與人發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異的鄰近、上游或下游相雜交的引物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離多核苷酸引物為至少10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度并雜交至與人發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異的一側(cè)或另一側(cè)。所述多核苷酸可含有變化形式，比如一個(gè)或多個(gè)核苷酸替換、增加或缺失，只要它們以相同的特異性程度與其靶標(biāo)變體CM基因相雜交。如本文所用，當(dāng)與核酸連用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“分離”是指已鑒定且與其天然來(lái)源中通常相伴的至少一種污染核酸分離開(kāi)的核酸序列。相反，非分離核酸是以天然存在狀態(tài)發(fā)現(xiàn)的核酸比如DNA和RNA。本文所述多核苷酸(如，多核苷酸探針或多核苷酸引物)可以是DNA或RNA。所述多核苷酸可以是單鏈或雙鏈的。本發(fā)明的多核苷酸探針和引物可以是約5個(gè)核苷酸-約3000個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸探針和引物為約8個(gè)核苷酸-約500個(gè)核苷酸。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸探針和引物為約10個(gè)核苷酸-約250個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸探針和引物為約20個(gè)核苷酸(如，15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸)。在另一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸探針和引物為約50-約100個(gè)核苷酸(如，45、50、55、60、65、75、85或100個(gè)核苷酸)。所述多核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)非天然或經(jīng)修飾的核苷酸。非天然或經(jīng)修飾的核苷酸包括但不限于放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記的核苷酸。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸引物雜交至與人發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異的上游或下游。在一種實(shí)施方案中，所述多核苷酸雜交至與人發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異的附近。例如，雜交可以以這樣的方式發(fā)生少于10個(gè)核苷酸將變異和鄰近該變異的雜交引物末端之間分離開(kāi)。在另一種實(shí)施方案中，雜交以這樣的方式發(fā)生1-3個(gè)核苷酸將變異和鄰近該變異的雜交引物末端之間分離開(kāi)。在某些其它實(shí)施方案中，所述多核苷酸引物雜交至緊鄰變異處。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸引物雜交時(shí)距與人發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異一定距離(如，至少10個(gè)核苷酸)。例如，雜交可以以這樣的方式發(fā)生鄰近變異的雜交引物末端距CFH基因中變異為10、25、50、100、250、1000、5000或高達(dá)10，000個(gè)核苷酸。本文所述的發(fā)明還涉及成對(duì)多核苷酸引物，其特異性檢測(cè)與人發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因中變異，其中第一多核苷酸引物雜交至該變異的一側(cè)而第二多核苷酸引物雜交至該變異的另一側(cè)。雜交至包含與人發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因中變異的DNA區(qū)域的一對(duì)多核苷酸引物可以以這樣的方式雜交至該區(qū)域鄰近變異的雜交引物末端距離約20-約10，000個(gè)核苷酸。作為替代，雜交至包含與人發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異的DNA區(qū)域的成對(duì)多核苷酸引物可以以這樣的方式雜交至該區(qū)域鄰近變異的雜交引物末端距離約100-約7，500個(gè)核苷酸，或距離約200-約5，000個(gè)核苷酸。在另一種實(shí)施方案中，本文所述的發(fā)明提供用于區(qū)分兩種CFH等位基因(例如，野生型等位基因和與人發(fā)生AMD相關(guān)的等位基因)的三種或更多種多核苷酸引物。第一引物雜交至兩種等位基因共同的核苷酸序列，比如與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異的上游或下游的非等位核苷酸序列。第二引物特異性雜交至第一等位基因獨(dú)特的序列(如，與人發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異)。第三引物特異性雜交至第二等位基因獨(dú)特的序列(如，野生型CFH基因)。三種引物的這種組合引起DNA區(qū)域的擴(kuò)增，這取決于樣品中存在何種Cm等位基因。例如，如果CFH基因具有與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異則擴(kuò)增一個(gè)DNA區(qū)域，如果樣品中存在野生型CHl基因則擴(kuò)增另一個(gè)區(qū)域。作為替代，該組合的兩種引物可雜交至CFH基因的兩種等位基因共有的核苷酸序列，比如處于與人發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異的上游和下游的非等位核苷酸序列，以及第三引物特異性雜交至CHl基因的兩種等位基因之一(比如野生型等位基因或與人發(fā)生AMD相關(guān)的等位基因)。通過(guò)本文所述的方法和組合物可檢測(cè)使個(gè)體易患AMD的許多CFH基因變異。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該變異在CFH蛋白質(zhì)第402位處編碼組氨酸以外的氨基酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該變異在CFH蛋白質(zhì)第402位處編碼酪氨酸。在另一種實(shí)施方案中，該變異在CFH蛋白質(zhì)第62位處編碼纈氨酸以外的氨基酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該變異在CFH蛋白質(zhì)第62位處編碼異亮氨酸。在另一些實(shí)施方案中，本文所述的方法和組合物可用于檢測(cè)使個(gè)體易患AMD的CFH基因變異，比如表4、5和7中所列的那些。例如，其它變異基因，比如所述變異位于編碼區(qū)的那些(例如編碼以下的變異在CHl蛋白第58位處編碼絲氨酸以外的氨基酸，比如丙氨酸蛋白第127位處編碼精氨酸以外的氨基酸，比如組氨酸；在CFH蛋白第400位處編碼谷氨酰胺以外的氨基酸，比如賴氨酸；在CFH蛋白質(zhì)第609位處編碼纈氨酸以外的氨基酸，比如異亮氨酸；在CFH蛋白第890位處編碼絲氨酸以外的氨基酸，比如異亮氨酸；在CFH蛋白第936位處編碼谷氨酸以外的氨基酸，比如天冬氨酸；在〇 !1蛋白第1007位處編碼纈氨酸以外的氨基酸，比如亮氨酸；在CFH蛋白第1050位處編碼天冬酰胺以外的氨基酸，比如酪氨酸蛋白第1166位處編碼脯氨酸以外的氨基酸，比如谷 氨酰胺；在CFH蛋白第1210位處編碼精氨酸以外的氨基酸，比如半胱氨酸。參見(jiàn)表4、5和7)可使用本文所述方法和組合物進(jìn)行檢測(cè)。作為替代，變異在非編碼區(qū)中的變異基因，t匕如表4、5和7中所列的那些，可使用本文所述的方法和組合物進(jìn)行檢測(cè)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“變體CFH基因”是指包括與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異的DNA。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“野生型CFH DNA”和“野生型CFH基因”表示不包括與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異的DNA。
本發(fā)明還涉及在從個(gè)體獲得的樣品中檢測(cè)與人發(fā)生AMD相關(guān)的變體CFH基因的方法。這樣的方法可包括(a)將樣品與多核苷酸探針相組合，所述探針在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與與人AMD相關(guān)的CFH基因變異雜交，但不與野生型CFH基因(野生型CFH DNA如上所述)雜交；和(b)確定是否發(fā)生雜交。發(fā)生雜交則指示樣品中存在與年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的變體CFH基因。用于本文所述方法中的樣品可包含來(lái)自以下的細(xì)胞眼、耳、鼻、牙、舌、表皮、上皮、血液、淚、唾液、粘液、尿道、尿液、肌肉、軟骨、皮膚或從中可獲得足夠DNA或RNA的任何其它組織或體液?？赏ㄟ^(guò)多種收集細(xì)胞的方式比如口腔拭子來(lái)收集樣品。必要時(shí)處理樣品以提供可用于本文所述方法中進(jìn)行分析的DNA或RNA。例如，可以處理樣品使得來(lái)自該樣品的DNA可用于擴(kuò)增或與另一種多核苷酸雜交。所處理的樣品可以是粗制裂解物，其中可用的DNA或RNA未從其它細(xì)胞物質(zhì)中純化，或可以純化所處理樣品以分離可用的DNA或RNA?？墒褂锰峁〥NA或RNA用于本文所述方法進(jìn)行分析的本領(lǐng)域已知的任何方式處理樣品。處理樣品的方法包括但不限于，裂解和/或純化細(xì)胞和細(xì)胞裂解物的機(jī)械、化學(xué)或分子學(xué)方式。處理方法例如可包括色譜法比如離子交換(如陽(yáng)離子和陰離子)、體積排阻、凝膠過(guò)濾、親合以及疏水相互作用色譜，或超濾、電泳、以及使用對(duì)所述多肽的特定表位有特異性的抗體進(jìn)行的免疫親合純化。 在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在從個(gè)體獲得的樣品中檢測(cè)與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的變體CHl基因的方法，其包括(a)將樣品(稱為測(cè)試樣品)與多核苷酸探針相組合，所述探針在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與與人發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異雜交，從而產(chǎn)生組合；(b)在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下維持步驟(a)中所產(chǎn)生的組合；和(C)將該組合中發(fā)生的雜交與對(duì)照中的雜交進(jìn)行比較。在所述組合中但不在對(duì)照中發(fā)生雜交指示樣品中存在與AMD相關(guān)的變體CFH基因。在另一實(shí)施方案中，在將所述組合中發(fā)生的雜交與對(duì)照中雜交進(jìn)行比較時(shí)確定雜交程度。對(duì)照與測(cè)試樣品相同并進(jìn)行與測(cè)試樣品同樣的處理，只是其多核苷酸探針不與與人發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異相結(jié)合。作為替代，所述多核苷酸探針僅結(jié)合野生型CFH基因。對(duì)照可以依次或與上述組合同時(shí)進(jìn)行測(cè)試。作為替代，對(duì)照的結(jié)果可以在上述組合之前或之后的參考測(cè)試中確立。用于對(duì)照的樣品通常與測(cè)試樣品為相同類型，并進(jìn)行與測(cè)試樣品同樣的處理，只是其所組合的多核苷酸不與CHl基因中與人發(fā)生AMD相關(guān)的變異雜交。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在從個(gè)體獲得的樣品中檢測(cè)與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的變體CHl基因的方法，其包括(a)將樣品的第一部分與多核苷酸探針相組合，所述探針在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與CHl基因中與人發(fā)生AMD相關(guān)的變異雜交；(b)將樣品的第二部分與多核苷酸探針相組合，所述探針在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與野生型CHl基因雜交；和(c)確定是否發(fā)生雜交。在第一部分中但不在第二部分中發(fā)生雜交指示樣品中存在與AMD相關(guān)的變體Ci7H基因。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在從個(gè)體獲得的樣品中檢測(cè)與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的變體CFH基因的方法，其包括(a)將樣品與一對(duì)多核苷酸引物相組合，其中第一多核苷酸引物雜交至編碼CFH蛋白第402位氨基酸的DNA的一側(cè)，第二多核苷酸引物雜交至編碼CFH蛋白第402位氨基酸的DNA的另一側(cè)；(b)擴(kuò)增樣品中的DNA，由此產(chǎn)生擴(kuò)增的DNA ； (c)測(cè)序擴(kuò)增的DNA ;和(d)檢測(cè)DNA中是否存在在CFH蛋白第402位處編碼組氨酸以外氨基酸的變異。所述變異的存在指示在樣品中檢測(cè)到與人發(fā)生AMD相關(guān)的變體CFH基因。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在從個(gè)體獲得的樣品中檢測(cè)與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的變體CFH基因的方法，其包括(a)將樣品與一對(duì)多核苷酸引物相組合，其中第一多核苷酸引物雜交至編碼Cm蛋白第62位氨基酸的DNA的一側(cè)，第二多核苷酸引物雜交至編碼Cm蛋白第62位氨基酸的DNA的另一側(cè)；(b)擴(kuò)增樣品中的DNA，由此產(chǎn)生擴(kuò)增的DNA ； (c)測(cè)序擴(kuò)增的DNA ;和(d)檢測(cè)DNA中是否存在在CFH蛋白第62位處編碼組氨酸以外氨基酸的變異。所述變異的存在指示在樣品中檢測(cè)到與人發(fā)生AMD相關(guān)的變體CFH基因。本領(lǐng)域用于擴(kuò)增核酸的任何已知方法均可用于本文所述方法。例如,樣品中的DNA可使用下列方法擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( 00、奶- 0 、定量？0 、實(shí)時(shí)？0 、快速擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析、快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)或滾環(huán)擴(kuò)增。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒定或輔助鑒定有患AMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的方法。在一種具體實(shí)施方案中，這樣的方法包括分析從所述個(gè)體獲得的樣品中是否存在與人發(fā)生 AMD有關(guān)的變體CFH基因。變體CFH基因的存在指示該個(gè)體有患AMD的風(fēng)險(xiǎn)。在另一種實(shí)施方案中，鑒定或輔助鑒定有患AMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的方法包括(a)組合來(lái)自個(gè)體的樣品與多核苷酸探針，該探針在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與CFH基因中與人發(fā)生AMD相關(guān)的變異雜交，但不與野生型CHl基因雜交；以及(b)確定是否發(fā)生雜交。若發(fā)生雜交則表明個(gè)體有患AMD的風(fēng)險(xiǎn)。在另一種實(shí)施方案中，鑒定或輔助鑒定有患AMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的方法包括(a)從個(gè)體獲得DNA ； (b)測(cè)序包含編碼CFH蛋白第402位氨基酸的核苷酸的DNA區(qū)域；和(c)確定該DNA中是否存在這種變異，該變異在CFH蛋白第402位編碼組氨酸以外的氨基酸。所述變異的存在指示個(gè)體有患AMD的風(fēng)險(xiǎn)。在另一種實(shí)施方案中，鑒定或輔助鑒定有患AMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的方法包括(a)從個(gè)體獲得DNA ； (b)測(cè)序包含編碼Cm蛋白第62位氨基酸的核苷酸的DNA區(qū)域；和(c)確定該DNA中是否存在這種變異，該變異在CFH蛋白第62位編碼纈氨酸以外的氨基酸。所述變異的存在指示個(gè)體有患AMD的風(fēng)險(xiǎn)。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在從個(gè)體獲得的樣品中檢測(cè)與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的變體CHl多肽的方法。這樣的方法包括(a)將樣品與抗體相組合，該抗體結(jié)合與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的變體CHl多肽；和(b)確定是否發(fā)生結(jié)合。若發(fā)生結(jié)合則指示樣品中存在與發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的變體CFH多肽。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)來(lái)自個(gè)體的樣品中的變體CFH基因的診斷試劑盒。診斷試劑盒例如可包含(a)其中放置多核苷酸探針的至少一個(gè)容器裝置，該多核苷酸探針在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與CFH基因中與人發(fā)生AMD相關(guān)的變異雜交；和(b)使用診斷試劑盒用于檢測(cè)樣品中變體CFH基因的標(biāo)簽和/或指導(dǎo)。在另一種實(shí)施方案中，用于檢測(cè)來(lái)自個(gè)體的樣品中變體CFH基因的診斷試劑盒例如可包含(a)其中放置多核苷酸引物的至少一個(gè)容器裝置，該多核苷酸引物在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交至與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的CHl基因變異的一側(cè)附近；和(b)使用診斷試劑盒用于檢測(cè)樣品中變體CFH基因的標(biāo)簽和/或指導(dǎo)。任選地，該診斷試劑盒還包含第二多核苷酸引物，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交至與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的CHl基因變異的另一側(cè)。本發(fā)明還涉及用于治療患AMD的對(duì)象的組合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，用于治療患AMD的對(duì)象的組合物包含有效量的分離或重組制備的CFH多肽或其片段、以及藥學(xué)可接受的載體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該CHl多肽或其片段抑制C3的活化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療患AMD的對(duì)象的方法，其包括向該對(duì)象施用有效量的分離或重組制備的CFH多肽或其片段、以及藥學(xué)可接受的載體在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療患AMD的對(duì)象的方法，其包括向該對(duì)象施用有效量的分離或重組制備的編碼CFH多肽或其片段的核酸分子、以及藥學(xué)可接受的載體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“有效量”是指分離或重組制備的CFH核酸或多肽或包含CFH核酸或多肽的組合物的量，其量足以治療對(duì)象或治療所述疾病本身。例如，有效量足以延遲、減緩或預(yù)防AMD或相關(guān)癥狀的發(fā)作或進(jìn)展。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療患AMD的對(duì)象的方法，其包括向該對(duì)象施用有效量的分離或重組制備的編碼CFH多肽或其片段的核酸分子、以及藥學(xué)可接受的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療患有年齡相關(guān)黃斑變性或有此風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象的組合物，其包含(a)包含反義序列的核酸分子，所述反義序列與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的變體CHl基因或mRNA雜交；和(b)藥學(xué)可接受的載體。在某些實(shí)施方案中，反義序列與變體CFH基因的雜交降低了從該變體CFH基因轉(zhuǎn)錄的RNA的量。在某些實(shí)施方案中，反義序列與變體CFH mRNA的雜交降低了從該變體CFH mRNA翻譯的蛋白質(zhì)的量，和/或改變了變體CFH mRNA的剪接。包含與變體CFH基因或mRNA雜交的反義序列的核酸分子可包含一個(gè)或更多個(gè)修飾核苷酸或核苷，其增強(qiáng)體內(nèi)穩(wěn)定性、跨細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)、或與變體CFH基因或mRNA的雜交。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療患年齡相關(guān)黃斑變性或有此風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象的方法，其包括向所述對(duì)象施用有效量的核酸分子、以及藥學(xué)可接受的載體，所述核酸分子包含與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的變體CFH基因或mRNA相雜交的反義序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療患年齡相關(guān)黃斑變性或有此風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象的組合物，其包含(a)包含siRNA或miRNA序列或者其前體的核酸分子，其與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的變體CFH基因或mRNA雜交；和(b)藥學(xué)可接受的載體。在某些實(shí)施方案中，包含siRNA或miRNA序列或者其前體的核酸分子與變體CFH基因的雜交降低了從變體CFH基因轉(zhuǎn)錄的RNA的量。在另一些實(shí)施方案中，包含siRNA或miRNA序列或者其前體的核酸分子與變體CFH mRNA的雜交降低了從變體CFH mRNA翻譯的蛋白質(zhì)的量和/或改變了變體CFH mRNA的剪接。包含與變體CFH基因或mRNA雜交的反義序列的核酸分子可包含一個(gè)或更多個(gè)修飾核苷酸或核苷，其增強(qiáng)體內(nèi)穩(wěn)定性、跨細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)、或與變體CHl基因或mRNA的雜交。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療患年齡相關(guān)黃斑變性或有此風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象的方法，包括向所述對(duì)象施用有效量的含siRNA或miRNA序列或者其前體的核酸分子、以及藥學(xué)上可接受的載體，所述核酸分子與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的變體CFH基因或mRNA雜交。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療患年齡相關(guān)黃斑變性或有此風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象的組合物，其包含(a)與變體CFH多肽結(jié)合的適配體，所述變體CFH多肽與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)；和(b)藥學(xué)可接受的載體，其中適配體與變體CFH多肽的結(jié)合降低了變體CFH多肽的活性。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療患年齡相關(guān)黃斑變性或有此風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象的方法，其包括向所述對(duì)象施用有效量的適配體、以及藥學(xué)上可接受的載體，所述適配體與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的變體CFH多肽相結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療患年齡相關(guān)黃斑變性或有此風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象的組合物，其包含(a)與變體CFH多肽結(jié)合的適配體，所述變體CFH多肽與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)；和(b)藥學(xué)可接受的載體。在某些實(shí)施方案中，該小分子與變體CHl多肽的結(jié)合降低了變體CHl多肽的活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療患年齡相關(guān)黃斑變性或有此風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象 的方法，包括向所述對(duì)象施用有效量的小分子、以及藥學(xué)可接受的載體，所述小分子與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的變體CFH多肽相結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療患年齡相關(guān)黃斑變性或有此風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象的組合物，其包含(a)與變體CFH多肽結(jié)合的抗體，所述變體CFH多肽與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)；和(b)藥學(xué)可接受的載體。該抗體與變體CHl多肽的結(jié)合降低了變體CFH多肽的活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供用于治療患年齡相關(guān)黃斑變性或有此風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象的方法，包括向所述對(duì)象施用有效量的抗體、以及藥學(xué)可接受的載體，所述抗體與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的變體CFH多肽相結(jié)合。本文所述用于治療患AMD的對(duì)象的方法和組合物可用于預(yù)防性治療已診斷或預(yù)測(cè)有患AMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體。例如，所述組合物以足以延遲、減緩或預(yù)防AMD或其相關(guān)癥狀發(fā)作的量和劑量施用。作為替代，本文所述方法和組合物可用于治療患AMD的個(gè)體。例如，所述組合物以足以完全或部分地延遲和減緩病情進(jìn)展的量和劑量施用，或者以足以逆轉(zhuǎn)該病情的量和劑量來(lái)施用。如本文對(duì)CFH所描述，人CFH-樣基因(如CFHLl、CFHL3和CFHL4)的變異也可用于鑒定或輔助鑒定有患AMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體。CFHL1、CFHL3和CFHL4中的變異還可用于診斷或輔助診斷AMD，鑒定或輔助鑒定有患AMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體，診斷或輔助診斷AMD的方法，用于這些方法的多核苷酸(如探針，引物)，包含探針或引物的診斷試劑盒，治療患AMD或有此風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的方法，以及用于治療患AMD或有此風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的組合物。表8-10中可見(jiàn)與發(fā)生AMD相關(guān)的CFHLl、CFHL3和CFHL4中變異的實(shí)例。這些變異可在CFHL基因(即CFHLl、CFHL3和CFHL4)的編碼區(qū)或非編碼區(qū)，其可用于本文所述的方法和組合物。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)或輔助檢測(cè)與人發(fā)生AMD相關(guān)的CFHL基因(即CFHL1、CFHL3和CFHL4)的多核苷酸，在具體實(shí)施方案中，檢測(cè)或輔助檢測(cè)與人AMD相關(guān)的CFHL基因的變異。本文還提供用于檢測(cè)來(lái)自個(gè)體的樣品中變體CFHL基因的診斷試劑盒。這些試劑盒可用于鑒定或輔助鑒定有患AMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體，以及用于診斷或輔助診斷個(gè)體中的AMD。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)來(lái)自個(gè)體的樣品中變體CFHL基因比如CFHLl、CFHL3或CFHL4的分離多核苷酸，包括特異性檢測(cè)與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的CFHL基因變異的核酸分子。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供多核苷酸引物，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交至人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性的CFHL基因變異的鄰近。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一對(duì)多核苷酸引物，其特異性檢測(cè)與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的CFHL基因變異，其中第一多核苷酸引物雜交至變異的一側(cè)而第二多核苷酸引物雜交至該變異的另一側(cè)。該對(duì)多核苷酸引物可以如下方式雜交至CFHL基因區(qū)域接近該變異的雜交引物末端距離約100-約10，000個(gè)核苷酸。本發(fā)明還涉及在從個(gè)體獲得的樣品中檢測(cè)與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的變體CFHL基因的方法。這樣的方法可包括(a)將樣品與多核苷酸探針相組合，所述探針在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與人發(fā)生AMD相關(guān)的CFHL基因變異相雜交但不與野生型CFHL基因雜交；和(b)確定是否發(fā)生雜交。若發(fā)生雜交則指示樣品中存在與年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的變體CFHL基因。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“野生型CFHL基因”表示與發(fā)生AMD不相關(guān)的CFHL基因，比如CFHLl、 CFHL3 或 Ci7HLL在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在從個(gè)體獲得的樣品中檢測(cè)與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的變體CFHL基因的方法，其包括(a)將樣品(稱為測(cè)試樣品)與多核苷酸探針相組合，所述探針在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與人發(fā)生AMD相關(guān)的CFHL基因變異雜交，從而產(chǎn)生組合；(b)在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下維持步驟(a)中所產(chǎn)生的組合；和(c)將該組合中發(fā)生的雜交與對(duì)照中的雜交相比較。若對(duì)照中無(wú)雜交而該組合中發(fā)生雜交則指示樣品中存在與AMD相關(guān)的變體CFHL基因。在另一實(shí)施方案中，在將所述組合中發(fā)生的雜交與對(duì)照中雜交進(jìn)行比較時(shí)確定雜交程度。對(duì)照與測(cè)試樣品相同并進(jìn)行與測(cè)試樣品同樣的處理，只是其多核苷酸探針不與CFHL基因中與人發(fā)生AMD相關(guān)的變異結(jié)合。作為替代，該多核苷酸探針僅結(jié)合野生型Ci7HL基因。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在從個(gè)體獲得的樣品中檢測(cè)與人發(fā)生AMD有關(guān)的變體CFHL基因的方法，其包括(a)將樣品的第一部分與多核苷酸探針相組合，所述探針在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與CFHL基因中與人發(fā)生AMD相關(guān)的變異雜交；(b)將樣品的第二部分樣品與多核苷酸探針相雜交，所述探針在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與野生型CFHL基因雜交；和(c)確定是否發(fā)生雜交。若第一部分發(fā)生雜交而第二部分未雜交則指示樣品中存在與AMD相關(guān)的變體CFHL基因。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒定或輔助鑒定有發(fā)生AMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的方法。在一種具體實(shí)施方案中，這樣的方法包括分析從該個(gè)體獲得的DNA中是否存在與人發(fā)生AMD相關(guān)的變體CFHL基因。存在變體CFHL基因指示該個(gè)體有發(fā)生AMD的風(fēng)險(xiǎn)。在另一種實(shí)施方案中，鑒定或輔助鑒定有發(fā)生AMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的方法包括(a)將從個(gè)體獲得的樣品與多核苷酸探針相組合，所述探針在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與CFHL基因中與人AMD相關(guān)的變異雜交；和(b)確定是否發(fā)生雜交。發(fā)生雜交指示該個(gè)體有發(fā)生AMD的風(fēng)險(xiǎn)。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)來(lái)自個(gè)體的樣本中變體CFHL基因的診斷試劑盒。診斷試劑盒例如可包含(a)其中放置多核苷酸探針的至少一個(gè)容器裝置，該探針在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與CFHL基因中與人發(fā)生AMD相關(guān)的變異雜交；和(b)使用診斷試劑盒用于檢測(cè)樣品中變體CFHL基因的標(biāo)簽和/或指導(dǎo)。在另一種實(shí)施方案中，用于檢測(cè)來(lái)自個(gè)體的樣品中變體CFHL基因的診斷試劑盒例如可包含(a)其中放置多核苷酸引物的至少一個(gè)容器裝置，該引物在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交至鄰近與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的CFHL基因變異的一側(cè)；和(b)使用所述診斷試劑盒用于檢測(cè)樣品中變體CFHL基因的標(biāo)簽和/或指導(dǎo)。任選地，該診斷試劑盒還包含第二多核苷酸引物，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交至與人發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的CFHL基因變異的另一側(cè)。根據(jù)說(shuō)明書、隨后的附圖和權(quán)利要求書，本發(fā)明的實(shí)施方案和實(shí)施、其它實(shí)施方案以及它們的特性和特征將是顯而易見(jiàn)的，所有的權(quán)利要求在此通過(guò)參考而并入本發(fā)明內(nèi)容部分中。


圖1A-1B表示與AMD相關(guān)基因的基因組范圍關(guān)聯(lián)性研究的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。圖IA表示基因組范圍關(guān)聯(lián)性掃描的P-值。
以染色體順序(chromosomal order)對(duì)每個(gè)SNP的-Iogltl (p)進(jìn)行作圖。圖上SNP之間的間距是均勻的且不反映SNP在染色體上的距離。水平虛線表示經(jīng)Bonferroni校正后對(duì)P = O. 05的截?cái)嘀?。垂直線表示染色體邊界。圖IB表示病例與對(duì)照之間基因型頻率的變異。 圖2A-2D表示與AMD相關(guān)SNP的數(shù)據(jù)。圖2A表示跨CFH區(qū)域的連鎖不平衡(LD)，作為成對(duì)的D'值作圖。圖2B表示在數(shù)據(jù)中具有兩種相關(guān)SNP的強(qiáng)LD中的區(qū)域。垂直條代表數(shù)據(jù)組中可獲得SNP的大概位置。陰影區(qū)域是在HapMap數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)的單倍型塊。圖2C表示跨該區(qū)域的HapMap CEU數(shù)據(jù)中的單倍型塊。較暗的陰影表示較高的D'值。較亮的陰影表示具有低LOD評(píng)分的高D'。黑線表示單倍型塊的邊界。圖2D表示來(lái)自跨所述
6-SNP區(qū)域的單倍型的最大簡(jiǎn)約性進(jìn)化樹(shù)(maximum parsimony c I ado gram)。各線的數(shù)字表示6個(gè)SNP中的哪個(gè)沿著該分枝變化。SNP 4是rs380390而SNP 6是rsl329428，其是最先鑒定的與AMD相關(guān)的兩個(gè)SNP。圖3A-3C表示CFH蛋白在人視網(wǎng)膜中的免疫熒光定位。圖3A表示用抗-人CFH抗體染色的人視網(wǎng)膜切片。圖3B表示用與CFH蛋白一起預(yù)孵育的抗-人CFH抗體染色的人視網(wǎng)膜切片作為陰性對(duì)照。細(xì)胞核通過(guò)DAPI染色識(shí)別。圖3A中圈定區(qū)域的放大圖示于圖3C中。從各圖像中采集熒光和DIC通道并在各圖板(panel)中分別表現(xiàn)為左和右照片(picture)。圖3A和圖3B中的熒光照片是來(lái)自CFH標(biāo)記和DAPI染色細(xì)胞核的合成圖像。圖3C中的DIC照片是CFH標(biāo)記和DIC通道的合成圖像。DIC圖像中的黑點(diǎn)對(duì)應(yīng)RPE和脈絡(luò)膜中的黑色素顆粒。抗-CHl抗體主要染色脈絡(luò)膜(圖3A)，在管腔壁和鄰近RPE的區(qū)域尤為強(qiáng)烈(附圖3C)，使用純化的人CFH蛋白可競(jìng)爭(zhēng)除去免疫反應(yīng)性(如圖3B)。來(lái)自RPE的熒光信號(hào)源自脂融合(Iipofusion)的自發(fā)熒光，其不能被人因子H蛋白競(jìng)爭(zhēng)性除去。GC:神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，INL :內(nèi)核層，ONL :外核層，RPE :視網(wǎng)膜色素上皮。比例尺圖3A和3B為40μπι，圖 3C 為 20 μ m。圖4A-4E表示已活化補(bǔ)體C5b_9的免疫組化。舉例說(shuō)明了來(lái)自三名患者的組織。圖4A和4B分別表示來(lái)自患者I和2的死后眼底圖像。組織學(xué)例示的位點(diǎn)用星號(hào)指示。圖4C表示來(lái)自患者I的組織，其遍及玻璃膜(Bruch' s membrane)且在毛細(xì)管間支柱(pillar)(細(xì)黑箭頭)中對(duì)C5b-9是免疫陽(yáng)性。上面的視網(wǎng)膜色素上皮是肥大的，相關(guān)的視網(wǎng)膜證明市場(chǎng)光感受器損失(market photoreceptor loss)。補(bǔ)體沉積也存在于脈絡(luò)膜動(dòng)脈的彈性膜內(nèi)(雙頭黑箭頭)，以及脈絡(luò)膜靜脈壁內(nèi)(白箭頭)。圖4D表明在患者2中在玻璃膜、毛細(xì)血管間支柱(箭頭)和玻璃疣(星號(hào))中的C5b-9沉積。脈絡(luò)膜靜脈內(nèi)面也是免疫陽(yáng)性的(白箭頭)。圖4E表示來(lái)自患者3的組織，其是具有早期AMD組織學(xué)證據(jù)的86歲老者。遍及玻璃膜、在玻璃疣 (星號(hào))中和在脈絡(luò)膜靜脈內(nèi)壁(白箭頭)中注意到已活化補(bǔ)體的沉積。比例尺圖4C和4D中為20 μ m，圖4E中為15 μ m。圖5表示人補(bǔ)體因子H的多肽序列(GenBank登記號(hào)CAA68704)。
具體實(shí)施例方式為了提供對(duì)本發(fā)明的全面理解，現(xiàn)將描述某些例示性的實(shí)施方案，包括用于鑒定或輔助鑒定有發(fā)生AMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體以及用于診斷或輔助診斷AMD的組合物和方法。但是，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解到，本文所述的組合物和方法可以被改變和修飾以適于待解決應(yīng)用并且本文所述的組合物和方法可用于其它適當(dāng)?shù)膽?yīng)用，這些另外的增加和修飾沒(méi)有偏離其范圍。
I、總覽發(fā)現(xiàn)CFH基因變異與AMD相關(guān)可用于早期診斷和治療易患AMD的個(gè)體。確定個(gè)體內(nèi)CFH基因的遺傳組成可用于在早期階段或者甚至在個(gè)體表現(xiàn)出任何AMD癥狀之前治療AMD。此外，基因型CFH的診斷測(cè)試可使得個(gè)體改變它們的行為從而最大程度減小患AMD的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)(如吸煙)。因此，本發(fā)明涉及鑒定與易患AMD相關(guān)的變體CFH基因，其可用于鑒定或輔助鑒定有發(fā)生AMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體以及可用于診斷或輔助診斷AMD。其還涉及用于鑒定或輔助鑒定有發(fā)生AMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的方法、診斷或輔助診斷AMD的方法、用于這些方法的多核苷酸(如探針、引物)、包含探針或引物的診斷試劑盒、治療患AMD或有此風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的方法以及用于治療患AMD或有此風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的組合物。根據(jù)本發(fā)明，CFH基因的共有變異已顯示與AMD高度相關(guān)。本發(fā)明涉及用于檢測(cè)這些使人易患AMD的變異的方法和組合物。CFH基因可以是該基因的cDNA或基因組形式，其可包括上游和下游調(diào)控序列。CHl多肽可由全長(zhǎng)編碼序列或該編碼序列的任意部分編碼，只要保留所述全長(zhǎng)或片段的期望活性或功能(如，酶促活性、配體結(jié)合、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等)即可。Cm核苷酸序列的實(shí)例包括人核苷酸序列(SEQ ID NO :1或2)、小鼠核苷酸序列(SEQ IDN03)以及大鼠核苷酸序列(SEQ IDNO :4)。本發(fā)明的多核苷酸探針和引物可與Cm基因的任意連續(xù)部分雜交，比如SEQ ID NO :1-4中所示的CFH基因。CFH多肽序列的實(shí)例包括人多肽序列(SEQ ID NO :5或6和圖5)、小鼠多肽序列(SEQ IDNO 7)和大鼠多肽序列(SEQ IDNO 8) 0 CHI基因還可包括位于5'和3'末端兩端鄰近編碼區(qū)并距每端約l_2kb的序列，使得該基因?qū)?yīng)全長(zhǎng)mRNA的長(zhǎng)度。位于編碼區(qū)5'端且存在于mRNA上的序列稱為5'非翻譯序列。位于編碼區(qū)3'端或下游且存在于mRNA上的序列稱為3'非翻譯序列。CFH基因是補(bǔ)體激活調(diào)節(jié)因子(RCA)基因簇的成員且編碼具有二十個(gè)短共有重復(fù)(SCR)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，每個(gè)所述結(jié)構(gòu)域有60個(gè)氨基酸。該蛋白質(zhì)被分泌到血流中，在補(bǔ)體激活調(diào)控中起關(guān)鍵作用(Rodriguez de Cordoba et al. , Mol Tmmunol. 41 355-67(2004))。補(bǔ)體系統(tǒng)防止感染并攻擊疾病和發(fā)育異常的細(xì)胞，通常不攻擊健康細(xì)胞。參與免疫監(jiān)督和疾病應(yīng)答的細(xì)胞被募集以增強(qiáng)活化補(bǔ)體成分的裂解作用。當(dāng)C3轉(zhuǎn)化酶被激活時(shí)，其導(dǎo)致產(chǎn)生C3a和C3b，然后產(chǎn)生終末C5b-9復(fù)合物。細(xì)胞上和循環(huán)中的CFH通過(guò)抑制C3活化成C3a和C3b、以及通過(guò)滅活存在的C3b來(lái)調(diào)節(jié)補(bǔ)體活性。早前已經(jīng)報(bào)道CFH基因變異與溶血尿毒綜合征(HUS)以及慢性低補(bǔ)體血性腎病相關(guān)。還已經(jīng)表征了選擇性轉(zhuǎn)錄剪接變體，其編碼不同的亞型。2、CFH多核苷酸探針和引物在某些實(shí)施方案中，提供了分離和/或重組的多核苷酸，其特異性檢測(cè)與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異。本發(fā)明的多核苷酸探針以特異性方式雜交至這種CFH基因中的變異(稱為感興趣變異)及其旁側(cè)序列，并由此通常具有與所述變異及旁側(cè)區(qū)序列完全或部分互補(bǔ)的序列。本發(fā)明的多核苷酸探針可雜交至靶DNA的一段，使得變異匹配探針的中心位置，或者變異匹配探針的末端位置。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離多核苷酸探針在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含變體CFH基因、或其等位基因變體一部分的核酸分子雜交，該基因與人發(fā)生AMD相關(guān)。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離多核苷酸探針在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含CFH基因或其等位基因變體的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸分子雜交，其中所述核酸分子包含與人發(fā)生AMD相關(guān)的變異。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸探針是等位基因特異性探針。用于分析多態(tài)性的等位基因特異性探針的設(shè)計(jì)和應(yīng)用例如描述于Saiki et al. , Nature 324 163-166(1986) ；Dattagupta, EP 235726 ;以及 Saiki WO 89/11548。等位特異性探針可設(shè)計(jì)成與來(lái)自某一個(gè)體的一段靶DNA雜交但不與來(lái)自另一個(gè)體的對(duì)應(yīng)區(qū)段相雜交，這是因?yàn)樵谒鰞蓚€(gè)個(gè)體的對(duì)應(yīng)區(qū)段中存在不同的多態(tài)性形式或變異。雜交條件應(yīng)足夠嚴(yán)謹(jǐn)，從而在等位基因之間有顯著不同的雜交強(qiáng)度。在某些實(shí)施方案中，探針僅與一種等位基因雜交。使個(gè)體易患AMD的Ci7H基因中的許多變異可通過(guò)本文所述方法和多核苷酸檢測(cè)。例如，可檢測(cè)與AMD相關(guān)的編碼區(qū)、外顯子、外顯子-內(nèi)含子邊界、信號(hào)肽、5’-非未翻譯區(qū)、啟動(dòng)子區(qū)、增強(qiáng)子序列、3’-非翻譯區(qū)或內(nèi)含子的任何核苷酸多態(tài)性。這些多態(tài)性包括但不限于以下變化改變由era基因所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，產(chǎn)生選擇性剪接產(chǎn)物，創(chuàng)建截短型產(chǎn)物，引入過(guò)早終止密碼子，引入隱藏(cryptic)外顯子，或大或小地改變表達(dá)程度，改變CFH表達(dá)的組織特異性，在由CFH所編碼蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中弓I入變化，在由CFH所表達(dá)蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力或特異性方面引入變化，或改變由CHl所編碼蛋白質(zhì)的功能。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，CFH基因變異在CFH蛋白質(zhì)第402位編碼組氨酸以外的氨基酸(如酪氨酸)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，CFH基因變異在CFH蛋白質(zhì)第62位編碼纈氨酸以外的氨基酸(如異亮氨酸)。在表4和5中記載了使個(gè)體易患AMD的CFH基因變異的其它實(shí)例。例如，其它變體基因，比如變異在編碼區(qū)中的那些(如編碼下列的變異在(!^蛋白第58位編碼絲氨酸以外的氨基酸，比如丙氨酸；在CFH蛋白第127位編碼精氨酸以外的氨基酸，比如組氨酸蛋白第400位編碼谷氨酰胺以外的氨基酸，比如賴氨酸；在0 !1蛋白第609位編碼纈氨酸以外的氨基酸，比如異亮氨酸；在CFH蛋白第890位編碼絲氨酸以外的氨基酸，比如異亮氨酸；在CFH蛋白第936位編碼谷氨酸以外的氨基酸，比如天冬氨酸；在0 !1蛋白第1007位編碼纈氨酸以外的氨基酸，比如亮氨酸；在CFH蛋白第1050位編碼天冬酰胺以外的氨基酸，比如酪氨酸；在CFH蛋白第1166位編碼脯氨酸以外的氨基酸，比如谷氨酰胺；在CFH蛋白第1210位編碼精氨酸以外的氨基酸，比如半胱氨酸。參見(jiàn)表4和5)可使用本文對(duì)其它變異描述的方法和組合物進(jìn)行檢測(cè)。或者，變異在非編碼區(qū)的變體基因，比如表4和5中所示的那些，可使用本文所述方法和組合物檢測(cè)。所述多核苷酸可進(jìn)一步理解為包 括作為本文所述多核苷酸之變體的多核苷酸，條件是該變體多核苷酸保留它們特異性檢測(cè)與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異的能力。變體多核苷酸例如可包括差異為一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代、增加或缺失的序列。
在某些實(shí)施方案中，所述分離多核苷酸是探針，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與人發(fā)生AMD相關(guān)的CHl基因變異雜交。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜交”用于指互補(bǔ)核酸的配對(duì)。術(shù)語(yǔ)“探針”是指可雜交至另一感興趣核酸的多核苷酸。多核苷酸可天然存在，如在純化的限制性消化物中，或可以經(jīng)合成、重組或核酸擴(kuò)增(如PCR擴(kuò)增)制備。本領(lǐng)域公知如何使用核酸分子進(jìn)行雜交試驗(yàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知本發(fā)明所需的雜交條件并易于理解促進(jìn)DNA雜交的適當(dāng)嚴(yán)謹(jǐn)性條件可以變化。這樣的雜交條件可參見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)教科書，比如 Molecular Cloning ALaboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory(2001);和Current Protocols in Molecular Biology,eds. Ausubel et al.,John ffiley& Son s (1992) 0特別適用于本發(fā)明方法的是在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與變體CFH基因或變體CFH基因的區(qū)域雜交的多核苷酸。在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與變體CFH基因雜交的多核苷酸不與野生型CFH基因雜交。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解，核酸雜交受很多條件影響，比如鹽濃度、溫度、有機(jī)溶齊 、堿基組成、互補(bǔ)鏈的長(zhǎng)度、和雜交核酸之間核苷酸堿基錯(cuò)配數(shù)。嚴(yán)謹(jǐn)溫度條件一般包括超過(guò)30°C的溫度，或可超過(guò)37°C或45°C。嚴(yán)謹(jǐn)性隨溫度而增加。例如，超過(guò)45°C的溫度是高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件。嚴(yán)謹(jǐn)?shù)柠}條件通常是低于IOOOmM,或可低于500mM或200mM。例如，可在約45°C、6. Ox氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)下進(jìn)行雜交，隨后于50°C用2. OxSSC洗滌。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可選自50°C、約2. OxSSC的低嚴(yán)謹(jǐn)性至50°C、約O. 2xSSC的高嚴(yán)謹(jǐn)性。此外，洗滌步驟的溫度可由室溫約22°C的低嚴(yán)謹(jǐn)條件升高至約65°C的高嚴(yán)謹(jǐn)條件。溫度和鹽均可改變，或者溫度或鹽濃度中一種可維持恒定而另一種變量發(fā)生變化。特別適用于本發(fā)明方法的是能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與變體CFH基因或變體CFH基因之區(qū)域雜交的多核苷酸。但應(yīng)理解到，本發(fā)明中的適當(dāng)嚴(yán)謹(jǐn)性條件可以改變以促進(jìn)DNA雜交。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸在高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下與變體CFH基因或變體CFH基因之區(qū)域雜交。在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與CFH基因變異雜交的多核苷酸不與野生型CFH基因雜交。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的核酸，該條件是室溫下6. OxSSC、室溫隨后用2. OxSSC在室溫洗漆。但是，參數(shù)的組合較任何單一參數(shù)更為重要。例如參見(jiàn)Wetmur andDavidson, 1968。探針序列還可在某些條件下與雙鏈DNA特異性雜交從而形成三鏈或更高級(jí)的DNA復(fù)合物。這些探針的制備和適宜的雜交條件為本領(lǐng)域所公知。獲得編碼本文所公開(kāi)生物合成構(gòu)建體的一種方法是通過(guò)組裝在常規(guī)自動(dòng)化寡核苷酸合成儀中制備的合成寡核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸探針或引物可被標(biāo)記，從而可在多種檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行檢測(cè)，包括但不限于，酶(如ELISA，以及基于酶的組化分析)、熒光、放射性、化學(xué)和發(fā)光系統(tǒng)。本發(fā)明的多核苷酸探針或引物還可包括猝滅劑部分，當(dāng)其置于標(biāo)記(如熒光標(biāo)記)附近時(shí)，使得標(biāo)記物沒(méi)有或幾乎沒(méi)有信號(hào)?？赏ㄟ^(guò)直接或間接方式進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè)(如通過(guò)生物素/親合素或生物素/鏈親合素連接)。本發(fā)明不意圖受限于任何具體的檢測(cè)系統(tǒng)或標(biāo)記。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離多核苷酸是一種引物，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交至與人發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異的鄰近、上游或下游。所述分離多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與一種核酸分子雜交，該核酸分子包含全部或部分的與人發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異。作為替代，該分離多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與包含與人發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異的至少50個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸分子雜交。例如，本發(fā)明的多核苷酸引物可雜交至編碼CFH蛋白第402位氨基酸的CFH基因區(qū)域的鄰近、上游或下游。作為替代，本發(fā)明的多核苷酸引物可雜交至編碼CFH蛋白第62位氨基酸的CFH基因區(qū)域的鄰近、上游或下游。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“引物”是指一種多核苷酸，當(dāng)其處于合成與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的條件(例如，存在核苷酸、誘導(dǎo)劑比如DNA聚合酶、以及適宜的溫度、pH、和電解質(zhì)濃度)下時(shí)能作為核酸合成的起始點(diǎn)。作為替代，當(dāng)處于兩種非連接核酸發(fā)生連接(例如，存在鄰近的核酸、誘導(dǎo)劑比如DNA連接酶、以及適宜的溫度、pH、和電解質(zhì)濃度)的條件下時(shí)，引物可連接至鄰近的核酸。本發(fā)明的多核苷酸引物可天然存在，如在純化的限制性消化物中，或可通過(guò)合成制備。為了擴(kuò)增的最大效率，引物優(yōu)選是單鏈的，但也可以是雙鏈的。如果是雙鏈的，在使用前首先處理引物以分離其鏈。優(yōu)選地，引物是寡聚脫氧核糖核甘酸。引物的確切長(zhǎng)度取決于許多因素，包括溫度，引物來(lái)源和所用方法。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸引物至少為10個(gè)核苷酸長(zhǎng)并雜交至與在人發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異的一側(cè)或另一側(cè)。所述多核苷酸可包含改變，比如一個(gè)或多個(gè)核苷酸的替換、增加或缺失，條件是它們以相同的特異性程度與目標(biāo)變體CFH基因雜交。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性檢測(cè)與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異的一 對(duì)引物。在此情況下，第一引物雜交至該變異的上游，第二引物雜交至該變異的下游。應(yīng)該理解，引物之一雜交至包含與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異的DNA區(qū)域的一條鏈，而第二引物雜交至包含與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異的DNA區(qū)域的互補(bǔ)鏈。如本文所述，術(shù)語(yǔ)“DNA區(qū)域”是指DNA的亞染色體長(zhǎng)度。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供雜交至靶DNA上位點(diǎn)的等位基因-特異性引物，其與與人發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異相重疊。本發(fā)明的等位基因特異性引物僅引發(fā)與該引物完美互補(bǔ)的等位基因形式發(fā)生擴(kuò)增。該引物例如可與在遠(yuǎn)端位點(diǎn)雜交的第二引物聯(lián)合使用。由此可從兩種引物開(kāi)始擴(kuò)增，得到可檢測(cè)的產(chǎn)物，其指示是否存在與人發(fā)生AMD相關(guān)的變體CFH基因。
3、檢測(cè)分析在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)與發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的CFH基因變異的多核苷酸。優(yōu)選地，這些多核苷酸可在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下雜交至包含與發(fā)生年齡相關(guān)黃斑變性有關(guān)的CFH基因變異的DNA區(qū)域。本發(fā)明的多核苷酸可用于檢測(cè)與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異的任何分析中。這些方法例如可包括DNA測(cè)序、雜交、連接、或引物延伸方法。此外，這些方法的任何聯(lián)合可用于本發(fā)明。在一種實(shí)施方案中，通過(guò)DNA測(cè)序檢測(cè)和/或確定是否存在與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異。DNA序列測(cè)定可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法完成，比如雙脫氧鏈終止技術(shù)和凝膠電泳，或通過(guò)其它方法比如焦磷酸測(cè)序(Biotage AB, Uppsala, Sweden)。例如,通過(guò)雙脫氧鏈終止法的DNA測(cè)序可使用未標(biāo)記的引物和標(biāo)記的(如熒光或放射性)終止子進(jìn)行。作為替代，可使用標(biāo)記的引物和未標(biāo)記的終止子進(jìn)行測(cè)序。樣品中DNA的核酸序列可與野生型DNA的核酸序列相比較，以鑒定是否存在與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異。在另一種實(shí)施方案中，通過(guò)雜交檢測(cè)和/或確定與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異。在一種實(shí)施方案中，多核苷酸探針與與AMD相關(guān)的CFH基因變異及旁側(cè)核苷酸雜交，但不與野生型CFH基因雜交。該多核苷酸探針可包含熒光、放射性或化學(xué)標(biāo)記的核苷酸以便于檢測(cè)雜交。可通過(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法比如Northern印跡、Southern印跡、突光原位雜交(FISH)或通過(guò)與固定于固相載體上的多核苷酸(比如DNA陣列或微陣列)雜交來(lái)實(shí)施并檢測(cè)雜交。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“DNA陣列”和“微陣列”是指可雜交陣列元件的有序排列。陣列元件可安排成優(yōu)選至少一種或多種不同的陣列元件固定于襯底表面。各陣列元件的雜交信號(hào)可獨(dú)立區(qū)分。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述陣列元件包含多核苷酸，盡管本發(fā)明還可與cDNA或其它類型的核酸陣列元件一起使用。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用多核苷酸探針用于通過(guò)FISH雜交基因組DNA。FISH例如可用于中期相細(xì)胞中以檢測(cè)基因組DNA的缺失。使基因組DNA變性以分離開(kāi)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的互補(bǔ)鏈。然后將本發(fā)明的多核苷酸探針加入到變性基因組DNA中。若存在與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異，則該探針與基因組DNA雜交。然后可通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)探針信號(hào)(如熒光)以確定是否存在信號(hào)。不存在信號(hào)則指示不存在與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH 基因變異。在另一具體實(shí)施方案中，將標(biāo)記的多核苷酸探針施用于DNA陣列上的固定化多核苷酸。例如可通過(guò)測(cè)量洗滌后保留在DNA陣列上的標(biāo)記探針的強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)雜交。本發(fā)明的多核苷酸還可用于商業(yè)分析，比如Taqman分析(AppliedBiosystems,Foster City,CA)。在另一種實(shí)施方案中，通過(guò)使用DNA聚合酶的引物延伸來(lái)檢測(cè)和/或確定是否存在與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸引物在緊鄰變異處雜交?？墒褂貌捎脴?biāo)記雙脫氧核苷酸終止子的單堿基測(cè)序反應(yīng)來(lái)檢測(cè)變異。若存在變異則導(dǎo)致標(biāo)記終止子的摻入，而不存在變異則不導(dǎo)致?lián)饺胨鼋K止子。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸引物雜交至與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異。該引物或其部分將不與野生型CFH基因雜交。若存在變異則導(dǎo)致引物延伸，而不存在變異則不導(dǎo)致引物延伸。所述引物和/或核苷酸可進(jìn)一步包括熒光、放射性或化學(xué)探針?？赏ㄟ^(guò)測(cè)量延伸產(chǎn)物的強(qiáng)度以檢測(cè)由引物延伸所標(biāo)記的引物，比如通過(guò)凝膠電泳、質(zhì)譜，或檢測(cè)熒光、放射性或化學(xué)標(biāo)記的任何其它方法。在另一種實(shí)施方案中，通過(guò)連接來(lái)檢測(cè)和/或確定與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸引物雜交至與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異。該引物或其部分將不與野生型CHl基因雜交。還提供在緊鄰第一引物處與CFH基因區(qū)域雜交的第二多核苷酸。這兩種多核苷酸引物之一種或二種可以被熒光、放射性、或化學(xué)標(biāo)記。若存在與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異，在DNA連接酶存在下將發(fā)生兩種多核苷酸引物的連接作用。連接作用可通過(guò)凝膠電泳、質(zhì)譜檢測(cè)，或通過(guò)測(cè)量熒光、放射性或化學(xué)標(biāo)記的強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)。在另一種實(shí)施方案中，通過(guò)單堿基延伸(SBE)來(lái)檢測(cè)和/或確定與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異的存在。例如，可使用熒光標(biāo)記的引物，其與在添加堿基的標(biāo)記和引物的標(biāo)記之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)相偶聯(lián)。典型地，該方法，比如Chen et al.，(PNAS94 :10756-61 (1997)，在此引入作為參考)所述的方法，使用在Y末端標(biāo)記有5-羧基熒光素(FAM)的基因座特異性多核苷酸引物。該標(biāo)記引物被設(shè)計(jì)成3’端緊鄰感興趣多態(tài)性位點(diǎn)。標(biāo)記引物與基因座雜交，使用熒光標(biāo)記的雙脫氧核糖核苷酸(ddNTPs)以染料終止子測(cè)序方式進(jìn)行標(biāo)記引物的單堿基延伸，只是不存在脫氧核糖核苷酸。作為對(duì)標(biāo)記引物波長(zhǎng)處激發(fā)的響應(yīng)而使添加ddNTP的熒光增強(qiáng)被用于推斷所添加核苷酸的身份。與發(fā)生AMD相關(guān)的CFH基因變異的檢測(cè)方法可包括擴(kuò)增含該變異的DNA區(qū)域?？墒褂萌魏螖U(kuò)增方法。在一種具體實(shí)施方案中，含該變異的DNA區(qū)域通過(guò)使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。PCR 最早由 Mullis 描述(參見(jiàn)如 U. S. Pat. Nos. 4，683，195，4，683，202 和 4，965，188，在此引入作為參考)，其描述了在基因組DNA混合物中無(wú)需克隆或純化而增加 DNA區(qū)域的濃度的方法。其它PCR方法也可用于核酸擴(kuò)增，包括但不限于RT-PCR、定量PCR、 實(shí)時(shí)PCR、快速擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析、快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)或滾環(huán)擴(kuò)增。例如，本發(fā)明的多核苷酸引物可與DNA混合物(或可用本發(fā)明多核苷酸引物擴(kuò)增的任何多核苷酸序列) 相合并，其中該DNA包含era基因。該混合物還包括熱循環(huán)反應(yīng)所必需的擴(kuò)增試劑(如，脫氧核糖核苷三磷酸，緩沖劑，等)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR方法，混合物經(jīng)歷一系列變性、引物退火和聚合酶延伸步驟以擴(kuò)增包含CFH基因變異的DNA區(qū)域。所擴(kuò)增DNA區(qū)域的長(zhǎng)度由引物之間的相對(duì)位置決定，因此，該長(zhǎng)度是可以控制的參數(shù)。例如，該引物的雜交可以如下方式發(fā)生， 使得鄰近變異的引物末端間隔有1-10，000個(gè)堿基對(duì)(如，10個(gè)堿基對(duì)(bp)、50bp、200bp、 500bp、l, 000bp、2, 500bp、5, OOObp 或 10, OOObp)。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)儀器擴(kuò)增和檢測(cè)所擴(kuò)增的DNA。例如，已開(kāi)發(fā)了許多儀器用于進(jìn)行核酸擴(kuò)增，尤其是PCR，例如Johnsonet al，美國(guó)專利號(hào)5，038，852 (計(jì)算機(jī)控制的熱循環(huán)儀)；ffittwer et al, Nucleic Acids Research, 17 :4353-4357 (1989) (毛細(xì)管PCR) ;Hallsby，美國(guó)專利號(hào)5，187，084(基于空氣的溫度控制)；Garner et al, Biotechniques, 14 :112-115 (1993)(在 864-孔板中的高通量 PCR) ；ffilding et al, International application No. PCT/US93/04039 (在微-加工結(jié)構(gòu)中的 PCR)； Schnipelsky et al，歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?0301061. 9 (
發(fā)明者約瑟芬·赫, 羅伯特·J·克萊因 申請(qǐng)人:洛克菲勒大學(xué), 耶魯大學(xué)