專利名稱：一種櫛孔扇貝熱休克蛋白基因啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種櫛孔扇貝熱休克蛋白基因啟動(dòng)子。
背景技術(shù)：
櫛孔扇貝是我國重要的海水養(yǎng)殖種類，在我國北方有廣大的養(yǎng)殖面積，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。當(dāng)前，櫛孔扇貝的養(yǎng)殖業(yè)存在著種質(zhì)退化、病害頻發(fā)的難題，嚴(yán)重制約了我國櫛孔扇貝養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展(張福綏，楊紅生.櫛孔扇貝大規(guī)模死亡問題的對策及應(yīng)急措施.海洋科學(xué)，1999，2 :1-5.)。轉(zhuǎn)基因是物種種質(zhì)改良的重要手段，其一般指將人工構(gòu)建的基因功能元件導(dǎo)入到 生物體基因組中，達(dá)到改變生物體的性狀的目的。當(dāng)前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物的性狀改良中表現(xiàn)出了巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值，如轉(zhuǎn)抗病害基因農(nóng)作物，轉(zhuǎn)生長因子鮭魚以及可以在乳腺中分泌藥物的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(生物反應(yīng)器)等。轉(zhuǎn)基因技術(shù)在櫛孔扇貝中也有著廣闊的應(yīng)用前景，如將抗病基因?qū)肷蓉愔?，產(chǎn)生抗病品系，將有可能從根本上解決當(dāng)前扇貝養(yǎng)殖業(yè)中夏季病害頻發(fā)的頑疾；將生長因子類的基因?qū)肷蓉愔?，有希望培育出高產(chǎn)、低生長周期的品系，縮小養(yǎng)殖成本，增加養(yǎng)殖效益。當(dāng)前，在櫛孔扇貝中尚無轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用。除導(dǎo)入及整合方法的限制外，可用基因元件(包括扇貝源啟動(dòng)子和功能基因)的缺乏也是重要的限制因素之一。啟動(dòng)子是人工構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體的不可或缺的重要組成成份，它決定了所轉(zhuǎn)入的基因的表達(dá)情況，如表達(dá)時(shí)間、部位、強(qiáng)度等等。熱休克蛋白HSP70是一種重要的生物活性蛋白，參與了生物體內(nèi)眾多的生理過程。Hsp70基因表達(dá)的一個(gè)重要特征是呈誘導(dǎo)型表達(dá)，在高溫或病原刺激下有明顯的上調(diào)表達(dá)；而這種表達(dá)特征主要取決于hsp70基因的啟動(dòng)子組成。將hsp70基因的啟動(dòng)子元件應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因研究中，可以通過控制溫度的高低方便地改變導(dǎo)入基因的表達(dá)時(shí)機(jī)和表達(dá)量，使生物體的性狀按照人類的意志進(jìn)行改變，有重要的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種櫛孔扇貝熱休克蛋白基因啟動(dòng)子。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為—種櫛孔扇貝熱休克蛋白基因啟動(dòng)子櫛孔扇貝熱休克蛋白基因啟動(dòng)子為下述任一項(xiàng)(I)櫛孔扇貝熱休克蛋白基因啟動(dòng)子為序列表中SEQ ID NO. I堿基序列；(2)與序列表中SEQ ID NO. I限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列；(3)是序列表中SEQ ID NO. I的片段、遺傳變體或缺失體，且能控制下游基因轉(zhuǎn)錄的DNA分子。所述啟動(dòng)子作為啟動(dòng)海洋生物組織特異性地表達(dá)目標(biāo)基因的啟動(dòng)子的用途。所述啟動(dòng)子與與之進(jìn)行可操作的有效基因連接，而后插入載體中構(gòu)成表達(dá)載體。所述有效基因如免疫相關(guān)基因LGBP、hsp70、lectin、toll等，生長相關(guān)基因如myostatin、actin、tubulin、EGF等，其它重要生理基因如vasa、SOX、BMP、NOTCH等；載體為表達(dá)載體如pCMVp-NEO-BAN、pEGFP、pEGFT-Actin、pSV2、CMV4 等。。而后以可表達(dá)的方式將有效基因與所述的啟動(dòng)子連接，得重組片段；將上述重組片段插入載體中；用該載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)該細(xì)胞表達(dá)有效基因。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
I.本發(fā)明獲得櫛孔扇貝熱休克蛋白基因啟動(dòng)子，其采用BAC克隆全測序及啟動(dòng)子預(yù)測方法，比傳統(tǒng)的染色體步移方法更簡單快捷。2.本發(fā)明將櫛孔扇貝熱休克蛋白基因啟動(dòng)子用于轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建的優(yōu)勢在于(I)熱休克蛋白hsp70是一種誘導(dǎo)表達(dá)的基因，其基因啟動(dòng)子在熱刺激后表現(xiàn)出高表達(dá)現(xiàn)象。相比于一些持續(xù)性表達(dá)的載體，其在表達(dá)某些對扇貝有害的基因時(shí)就體現(xiàn)出較強(qiáng)的優(yōu)勢，如caspase基因，可以誘導(dǎo)其在特殊時(shí)期表達(dá)，避免持續(xù)表達(dá)導(dǎo)致機(jī)體傷亡。另外，熱休克蛋白參與了扇貝體內(nèi)多種生理過程，必定為一個(gè)高效表達(dá)的調(diào)控元件；用熱休克蛋白基因啟動(dòng)子構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體，所攜帶的外源基因表達(dá)效率很可能會(huì)大大提聞。(2)在扇貝轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中使用扇貝自身啟動(dòng)子，不會(huì)帶入病毒等其他生物的核酸序列，具有更高的生物安全性，有利于將來轉(zhuǎn)基因扇貝進(jìn)入市場。3.本發(fā)明使用EGFP基因?yàn)閳?bào)告基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體的優(yōu)點(diǎn)在于EGFP是加強(qiáng)型綠色熒光蛋白，容易觀察和檢測，能極大地提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的篩選效率，有利于扇貝轉(zhuǎn)基因技
術(shù)的建立。


圖I為櫛孔扇貝轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pCfHs pPI-EGFP構(gòu)建示意圖。圖2為櫛孔扇貝熱休克蛋白基因啟動(dòng)子表達(dá)載體PCfHs pPl-EGFP轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞sf9的熒光觀察結(jié)果圖(其中，櫛孔扇貝熱休克蛋白基因啟動(dòng)子載體轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞sf9的熒光觀察。a為未熱激組熒光表達(dá)情況；b為熱激后6h突光表達(dá)情況；c為熱激后48h突光表達(dá)情況)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明利用BAC克隆篩選技術(shù)、啟動(dòng)子預(yù)測技術(shù)、DNA擴(kuò)增及測序技術(shù)克隆了櫛孔扇貝熱休克蛋白基因啟動(dòng)子；在此基礎(chǔ)上利用載體構(gòu)建技術(shù)將所克隆的啟動(dòng)子與攜帶加強(qiáng)型綠色突光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)的質(zhì)粒結(jié)合，構(gòu)建了攜帶櫛孔扇貝自源啟動(dòng)子和EGFP報(bào)告基因的表達(dá)載體。實(shí)施例I含櫛孔扇貝熱休克蛋白基因hs p70的BAC克隆的篩選根據(jù)柿孔扇貝hsp70基因序列(GenBank No. AY206871)設(shè)計(jì)Overgo 探針(正向引物 5' - TAGGAGATGCCGCCAAGAACCAA-3 '，反向弓丨物5' -GGGATTCATTGCCACTTGGTTCT-3')，對 BAC 文庫高密度 DNA 薄膜進(jìn)行 Overgo 探針雜交，篩選以確定含有hsp70基因的陽性克隆在文庫中的位置，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。步驟如下I.預(yù)雜交將高密度DNA薄膜正面向上放入雜交盒，雜交盒內(nèi)倒入預(yù)熱至50°C的雜交液，將雜交盒放到雜交爐中，50°C緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)，預(yù)雜交至少2h。2.探針制備將Overgo的兩條單鏈等摩爾數(shù)混合，95°C lOmin，然后室溫放置IOmin0
稀釋Overgo探針至25ng/li I,按照以下體系進(jìn)行探針標(biāo)記，37°C延伸Ih :LS012u I ；0. 5U/ul Klenow 2u I ； [32P]-dCTP 2u I ；Overgo probe DNA 6 u I ；ddH20 3u I ;總體積25 u Io3.標(biāo)記反應(yīng)體系中加入等體積(25 U I) 0. 4M NaOH,室溫放置IOmin ；4.將放射性同位素探針小心加入雜交液，50°C雜交爐內(nèi)緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)雜交48h。5.洗脫將含有放射性[32P]探針的雜交液小心倒入放射性廢液存儲(chǔ)罐中，加入預(yù)熱到50°C的雜交洗脫液，放回雜交爐緩慢洗脫30min ；6.將高密度DNA薄膜正面向上放到吸水紙上，待上表面多余洗脫液被吸水紙吸收后用塑料保鮮薄膜將高密度DNA薄膜密封包裹起來，在暗室中用X光底片曝光。7.對照X底片上的陽性信號(hào)位置，找到相應(yīng)的陽性克隆編號(hào)。8.挑取陽性克隆進(jìn)行活化、PCR驗(yàn)證并保種。根據(jù)公布的hsp70基因序列(GenBank No. DQ466080)設(shè)計(jì)正向引物5 ' - TCTCGACACTAGGCACTTC-3 ';反向引物:5' -AGCACTCAGGTAGGCGTTT-3'。以陽性克隆菌液為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物測序，證實(shí)確為扇貝熱休克蛋白基因hsp70序列。對確定含有柿孔扇貝熱休克蛋白基因序列的BAC克隆進(jìn)行全測序。櫛孔扇貝熱休克蛋白基因啟動(dòng)子，如SEQ ID NO I.所示序列I GCTCACTCTACAGTTGGTOGCCCCGATGTCCACACCMATACTOGTGGAOGGGCTGGTTT 6061 CAGTTTAGGAGCTATGTTGTTCATTCTCGTTATCTGTATTGATTACAAATCGCTGCAACA 12012 AACAGTTTTTTTTTGTTGACAAAAAGTGTCGATTTGAOGAAAGTGGGGAAAAAAGATGGG 180181 AAATTGTTTGGTGGACACAAGAAAACACTCTCAACAACTTTGAAAATGATTAATATACTT 240241 GGATTCAAAACTTTAGCATT0GCATTCACAAGTAGTC0GAATAAA0GTTATTCGA0GACA 300301 GGCCGATATTAAAAACAGTCGATATAACGTCAGAATAATTCGGACTAACTTACGTTGTAC 360361 ATGTGTTGTACAAATOGAAACACTGGACTGTGATATCTOGACACATATCCATAGTACTTC 420421 ATCCAOGAACTATTCTAGATTAGTACTCTATGTCAAATAAACGTTTTATTTAACTATTTT 480481 CAAGTCACAGACATACACAAGAATCAACCCAACCGCCAAATTTGTATCTAACCTGAAAGG 540541 TGTACAAAAAATGCTOGTCTAAATGGAAGTATAAOGCATGGTAAGAOGTTTTGAAATTTA 600601 ATTCTAATTCATCTTAAGGTAAATTCTTTTTACCTCAGGTTAAGTTTTTTTTTAAATTAA 660661 AAAATAGTTTTTACTTAAGTGAAACAAAAAAAATTATAATTTTACTCTGATACATTAGTT 720721 TAAATGGTCGAAAGTAAAACACACATGGACCCOGGTTTCATCAAOGTTCCTTAACTTAAA 780781 ATTTTCCATATGAAAGCATTACAGAATTTTAAGAAAAAGCCTTAGTTGAGGAACCTTCCT 840841 TAAATTATTTAATTATTTTTCTCTTAAATTTTAAGTTAAGGAGTTTCCTTAAGTTAATGA 900901 AOGTTGATGAAACOGGCTGATGATCAGTTAATAACTGGACTAGACCATTTTGTCTTATAA 960961 GAAAGAACAAAGATATTATTTGCATATTCACTTAAGOGAAAAAGAATTCCTAATAAGGTT 10201021 ATAAAACATATTTAACTTAAATGAAATTCATTTGACTTAAGCAGAATTTAACATAATGCA 10801081 AATTATAATGATTATTTACATTCGTTTAAAATGGAAAAAAAATATGOGAATAATTTAACC 11401141 TAATGGTGAAAACGGTTTGCCATAATTACGCAACATTAAAAGAAAAGAATACAACACATC 12001201 AGCACAAGCTATTACAATGTAGATATCTTAGGTGGATTCCCTGAAAACCAACTTACATCT 1260、
1261 TACAAOGATGTGTTTTGATAATGTAGTTAGTCAGTGCAACCTGCCAAGTCTAAACTTTTG 13201321 GTTATCTATAAATGTAAAAGTGGAGAGTATAAAGTCATCTTACTAGCTCAGTCTAGOGGG 1380
1381 AATTTCCCTTTAGCCTAGTTTGTCATTAGTGAGATGTCGTAGTAGTTTGAACCAOGGCAC14401441 GAACAGGCCGGGTTTTTTCATTACTCCTTTAATTACTAATCCTATTACATAAGAAATACA15001501 TTTGTACACTGTGCTAGTCAACCTCOGATTOGAAAATTAAATTCCTTATTGCCAAAACAC15601561 CATTCAAGTAGCTATAGGTTACATCCACACACACACATCCACACATTTACACACATATCA16201621 CATACACAGGTATGAGCTTTATTGCATACATGTAGATCTATGTGTGTTCATTTCAAATAC16801681 ATACTAGGCCTAATACACTTTGGACTGTCACAAAATGACAAACAGAAAOGTACATATATA17401741 TACTAACATGTCATCTTGTTAGTCTOGTCTTATATTATGACTTTCCGCGTCCTAATCTTG1800
1801 CCTTTTTTTAACATAGTACCTGTACGTTTCTTATTTACCTGTATOGGTCCTTGTTTGTTG18601861 ACATGTTGCCAAGTCACATAATTCTGTTAGAGTTGTTTCCCTTCAAATOGTTATTTGGGG19201921 TGCACGGGTTCATGCATCATCGAACAAATTAAGAAAACCATACTGATAACTGAGTTTGAG19801981 TAAOGGCTTTATTTTGTTATTTTACTTTCATAAAAAACACGATTAATCTACTACAGAAAA20402041 AATGATGCATGGATACTATGTTTTCTTATATTAAATCATTGATTTGCTOGGTGACAATTT21002101 TTTTATTGATCTAAGCCTAOGTTATTACCTGTTAAATTTATCCAATTTGGATACTAATCC21602161 AATTTGATTACTGCTTCCTTGTTAAGTTGTACAATGOGATATTATGAAAGAAATTTTATT22202221 ATGATGATAGGGAATCAAGTATTTTTCTTCTAATAGGCTTAGTTATGGTCACGAATATTC22802281 GCCAAGTTTCAOGAAGTAGGCOGATTATTTAACATAATTGAGCAOGTGACTTACTTCTCT23402341 TCTCTGATTGGTACATTGATTGTGTTCTGGAATCTTCCAGAAGTGATGTCATATCCTCOG24002401 GTGOiCATAAAAAOGAGTCGCATAAOGCCGGGAACCAAGAACAGACOGGAGCGAGGGGTT24602461 TAAGCTGTGATAAGAACATATAATATTTGGCTCTACTATTCAAGTAAACTCATCAAAACA25202521 CAGGTAAGATAOGTAAATCATCCCAAGGAACATTTGATTATATTTGAAGAATOGGGAATA25802581 ATATTGAGAAATCAAATTAAAATTGAATTATTTTCTGGGGAGTAGTGCTCTCATGCATTG26402641 ATGGGGTGTTACCACAATGGCOGCACCAACGCGAAACCGTGTAATTATTAGAAGAAAGTT27002701 CAATGAAAGGCAAACTAATTCA 2722(a)序列特征*長度2722堿基對*類型核苷酸*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源柿孔扇貝(Chlamys farreri)(f)特異性名稱Promoter實(shí)施例2櫛孔扇貝熱休克蛋白基因啟動(dòng)子片段的克隆分析測得的BAC克隆全長，將編碼熱休克蛋白基因hsp70的第一個(gè)堿基記為+1。取-4000至0位置的堿基序列進(jìn)行啟動(dòng)子預(yù)測。在-1700和-2400堿基處分別預(yù)測到兩個(gè)分值很高(分別是I. 008和I. 116)的啟動(dòng)子區(qū)域。因該基因在-1400堿基處還有轉(zhuǎn)錄，故將-3900至-1200間的堿基序列定為熱休克蛋白基因的啟動(dòng)子區(qū)。在該啟動(dòng)子區(qū)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，并加上不同的酶切位點(diǎn)(Xho I和BamH I)，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增啟動(dòng)子區(qū)。設(shè)計(jì)正向引物Fl 5/ -CTCGAGGCTCACTCTACAGTTGGTCGCC-3';及反向引物Rl:5' -GGATCCTGAATTAGTTTGCCTTTCATTGAAC-3'，并在以下的反應(yīng)體系中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增SEQ ID NO I.所示序列表中啟動(dòng)子區(qū)，PCR產(chǎn)物電泳并進(jìn)行膠回收。反應(yīng)體系模板(BAC質(zhì)粒)IiU ;正向引物(IOpmo I/Ul) 0. 5 ;反向引物(10pmol/u 1)0. 5u I ； IOxTaq DNA 聚合酶緩沖液 2. 5 y I ；MgCl 2 (2. 5 u mol /L) I. 5 u I ;脫氧核苷酸混合物dNTP (IOmmoI/L) 0. 5 u I ；Taq DNA聚合酶0. 25 U I ;滅菌水18. 25 U I ;總體積 25 u I0將膠回收純化所得PCR產(chǎn)物連接pMD19-T simple載體過夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5ci大腸桿菌菌株，涂布含氨芐青霉素的平板，37°C培養(yǎng)過夜；挑選含重組子的陽性克隆，利用載體引物M13 (正向引物5 ' -GTTTTCCCAGTCACGAC-3 ,;反向引物5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3')及啟動(dòng)子序列特異引物PCR擴(kuò)增并測序驗(yàn)證，具體為步驟如下挑取10個(gè)單克隆，并以挑取的單克隆細(xì)菌為模板，分別用上述兩組引物對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為模板(單克隆菌液)lu I ;正向引物(10pmol/u 1)0. 5 u I ;反向引物(lOpmol/u 1)0. 5u I ； IOxTaq DNA 聚合酶緩沖液 2. 5 u I ；MgCl2 (2. 5 u mol/L) I. 5u I ;脫氧核苷酸混合物dNTP (IOmmoI/L) 0. 5 u I ；Taq DNA聚合酶0. 25 U I ;滅菌水18. 25 U I ;總體積 25 u I0兩組引物都有擴(kuò)增、且電泳條帶大小與序列長度一致的的單克隆視為陽性克隆。提取陽性克隆的質(zhì)粒(用TIANGEN普通質(zhì)粒小提試劑盒，目錄號(hào)DP103)，對提取的質(zhì)粒進(jìn)行測序，證實(shí)質(zhì)粒中所含的序列為目標(biāo)啟動(dòng)子序列。實(shí)施例3啟動(dòng)子表達(dá)載體與轉(zhuǎn)基因載體pCfHspPl-EGFP的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Xho I和BamH I對提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，并回收SEQ ID NO
I.所示序列表中啟動(dòng)子片段；再用限制性內(nèi)切酶Xho I和BamH I對載體pEGFP_l進(jìn)行雙酶切，并回收被線性化的pEGFP-1載體；用T4連接酶過夜連接回收的啟動(dòng)子片段和PEGFP-I載體。連接體系如下，PEGFP-I與啟動(dòng)子片段的摩爾比控制在I : 2-6之間。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌菌株，涂布含卡那霉素的平板，37°C培養(yǎng)過夜。挑選含重組子的陽性克隆。利用pEGFP-1載體引物和啟動(dòng)子特異引物同時(shí)檢測。連接體系T4連接酶 IiU ; IOx Buffer I yl ;pEGFP_ll iU ;啟動(dòng)子片段 7 iU ;總計(jì)，10 u I。其中pEGFP-1載體引物如下正向引物FI : 5' -CTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGG-3'反向引物R 1:5' -CCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTC-3'。實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因載體pCfHspPl-EGFP的活性驗(yàn)證(I)昆蟲細(xì)胞sf9的培養(yǎng)及傳代，將對數(shù)生長期的sf9細(xì)胞經(jīng)計(jì)數(shù)，以6xl05/ml的細(xì)胞密度傳代至6孔板中，27°C過夜培養(yǎng)。(2)轉(zhuǎn)染，在細(xì)胞密度達(dá)到鋪板面積80-90%時(shí)開始轉(zhuǎn)染。
轉(zhuǎn)染mix的配制用超純水配制IOOul濃度為20ng/ul轉(zhuǎn)染載體?；旌暇鶆蚝蠹覨ugene HD轉(zhuǎn)染試劑7ul，混合均勻。室溫放置15分鐘。加入到6孔板中，培養(yǎng)基液面以下，混合均勻。(3)轉(zhuǎn)染18小時(shí)后對一組進(jìn)行熱激42°C 30分鐘，另一組不做處理。熱激后6小時(shí)觀察兩組熒光表達(dá)情況，未熱激組沒有發(fā)現(xiàn)熒光，熱激組有熒光表達(dá)。熱激后48小時(shí)觀 察熒光表達(dá)情況，未熱激組還是未發(fā)現(xiàn)熒光，熱激組有熒光表達(dá)(參見圖2)。
權(quán)利要求
1.一種櫛孔扇貝熱休克蛋白基因啟動(dòng)子，其特征在于櫛孔扇貝熱休克蛋白基因啟動(dòng)子為下述任一項(xiàng) (1)櫛孔扇貝熱休克蛋白基因啟動(dòng)子為序列表中SEQID NO. I堿基序列； (2)與序列表中SEQID NO. I限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列； (3)是序列表中SEQID NO. I的片段、遺傳變體或缺失體，且能控制下游基因轉(zhuǎn)錄的DNA分子。
2.—種權(quán)利要求I所述的櫛孔扇貝熱休克蛋白基因啟動(dòng)子的應(yīng)用，其特征在于所述啟動(dòng)子作為啟動(dòng)海洋生物組織特異性地表達(dá)目標(biāo)基因的啟動(dòng)子的用途。
3.按權(quán)利要求2所述的櫛孔扇貝熱休克蛋白基因啟動(dòng)子的應(yīng)用，其特征在于所述啟動(dòng)子與與之進(jìn)行可操作的有效基因連接，而后插入載體中構(gòu)成表達(dá)載體。
4.按權(quán)利要求3所述的櫛孔扇貝熱休克蛋白基因啟動(dòng)子的應(yīng)用，其特征在于以可表達(dá)的方式將有效基因與所述的啟動(dòng)子連接，得重組片段；將上述重組片段插入載體中；用該載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)該細(xì)胞表達(dá)有效基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種櫛孔扇貝熱休克蛋白基因啟動(dòng)子。采用BAC克隆篩選及測序分析、啟動(dòng)子預(yù)測、DNA擴(kuò)增及測序、載體構(gòu)建等技術(shù)得到櫛孔扇貝熱休克蛋白基因啟動(dòng)子，具有序列表中SEQ ID NO.1堿基序列；在此基礎(chǔ)上用所克隆的啟動(dòng)子與攜帶加強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的質(zhì)粒結(jié)合，構(gòu)建了櫛孔扇貝自源啟動(dòng)子的EGFP基因表達(dá)載體。本發(fā)明獲得櫛孔扇貝熱休克蛋白基因啟動(dòng)子，其采用含目的基因的BAC克隆全測序及啟動(dòng)子預(yù)測方法，比傳統(tǒng)的染色體步移方法更簡單快捷。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102757963SQ201110334969
公開日2012年10月31日 申請日期2011年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月23日
發(fā)明者張曉軍, 李富花, 相建海, 趙翠, 郇聘 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所