專利名稱：氣泡發(fā)酵工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在工業(yè)規(guī)模上發(fā)酵生產有價值的化合物，其中總能量輸入的>50%是通過注入含氧氣體來遞送的。
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背景技術：
很多有價值的化合物是通過在大的工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵罐中發(fā)酵生產來制造的，·在所述發(fā)酵罐中，可以是絲狀真菌(比如針對像β -內酰胺的化合物是Penicilliumchrysogenum)的微生物在受控條件下生產有價值的化合物。為了在發(fā)酵液中獲得有價值的化合物的高生產力，需要高生物質濃度。大多數發(fā)酵工藝以帶有攪拌和通氣的浸沒式發(fā)酵進行。為了給微生物提供必要的氧氣，通氣是必要的，并且為了確保發(fā)酵液和氣泡的良好混合以實現從注入的空氣進入發(fā)酵液的有效氧傳遞，攪拌是必要的。氧傳遞的效率由于發(fā)酵液的高粘度而被減小，所述發(fā)酵液的高粘度是由發(fā)酵液中的高生物質濃度和/或由使用的微生物的形態(tài)學引起的。低效的混合導致具有降低的生物質形成的降低的氧傳遞，和因此降低的有價值化合物生產。在大多數常見工藝中，特別是用于生產β_內酰胺(比如青霉素G)的大多數常見工藝中，約30-40 %的能量輸入源自空氣注入并且大約60-70 %來自機械攪拌。攪拌和空氣注入都將大量的能量引入了發(fā)酵罐中，所述發(fā)酵罐增加由微生物生長產生的熱量并通常被迫(強迫)冷卻以將發(fā)酵工藝的溫度保持在期望值。在過去50年中，大量研究工作集中在改進例如內酰胺的發(fā)酵工藝，對青霉素 G 特別關注。1950-1984 年這段時期已被 G. J. M Hersbach, C. P van der Beek andP. ff. M van Dijk(The penicillins !properties, biosynthesis and fermentation.1n E. J Vandamme, Editor, Biotechnology of industrial antibiotics, Marcel Dekker,New York(1984),45 140)綜述過。通過增加攪動功率和通氣速率，增加最大氧傳遞。這些措施的缺點是，引入了更多的能量，其還需要改進的冷卻能力并因而增加了產物的成本費用(Hersbach等人，95頁)。或者，可選擇給予較低粘度發(fā)酵液的菌株和/或發(fā)酵條件(Hersbach 等人,51 頁，第 4 段)。最近，Burlingame和 Verdoes (BioPharm Int. , 2006,19 (I), 1-5)分離了Chrysosporium Iucknowense的低粘度突變體,所述突變體顯示了特征為菌絲碎片的形態(tài)學和命名為“繁殖體”的分散單元(element)的形成。這些繁殖體的培養(yǎng)物展示了更低的粘度、更好的營養(yǎng)物和氧傳遞以及更高的蛋白生產。當兩種菌株在類似條件下生長時，與親本菌株比較，低粘度突變體產生了約2倍的總蛋白產率。低粘度菌株允許進一步改進的培養(yǎng)條件，當應用所述條件時，其導致蛋白生產額外的3倍增加。還通過改變發(fā)酵罐中的進料策略，已獲得了粘度降低。例如，Bhargava等人(Biotechnol. Bioeng.，2003，82，111-117)表明，在使用產生重組葡糖淀粉酶的Aspergillus oryzae菌株的發(fā)酵中，限制碳源的脈沖_進料策略降低了粘度和平均菌絲體顆粒大小。伴隨這些改變，由這些菌株的葡糖淀粉酶生產量得以增加。已發(fā)現在發(fā)酵工藝中使用固定化細胞時高粘度的另一解決方案?，F有技術中有很多公開，其中已在搖瓶、小規(guī)模實驗室發(fā)酵罐、鼓泡塔和氣升罐中用固定化細胞進行發(fā)酵，見 B. Konig 等人(Biotechnol. Bioeng.，1982, 24 (2)，259-280)、Gbewonyo 等人(Biotechnol. Bioeng.，1983,25 (12)，2873-2887)、Al-Qodah Zakaria(App1. Biochem.Biotechnol.，2000，87 (I)，37-55)、M. Gavrilescu 等人(Acta Biotechnologica, 1998,18 (3)，201-229)、ff. Zhou 等人(J. Biotechnol.，1993，28 (2-3)，165-177)、Punita Mishra等人(World J. Microbiol. Biotechnol. , 2005, 21 (4), 525-530) > P. Srivastava 等人(Process Biochem. , 1999, 34 (4), 329)、M. Kawagoe 等人(J. Ferm. Bioeng. , 1997,84 (4)，333-336)和 M. Kawagoe 等人(J. of Bioscience and Bioeng. , 1999,87 (I), 116-118)。例如 Gbewonyo 等人(Biotechnol. Bioeng.，1983, 25 (12)，2873-2887)表明了，通過固定化Penicillium chrysogenum并將菌絲體生長限于微珠粒,較之自由懸浮的菌絲體結構，在3升鼓泡塔中的青霉素生產量被改進了許多。作者已建議當細胞以球狀球團的形式生長時，培養(yǎng)發(fā)酵液保留較小的粘性并能保持更好的氣液 質量傳遞性質。但是，使用固定化細胞的缺點是細胞生長減少。結果，發(fā)酵液中的產物水平也非常低。在Gbewonyo等人的具體的例子中，每升發(fā)酵液僅獲得5. 5g的青霉素G。盡管該值比在鼓泡塔中的用懸浮細胞的對照實驗高出10倍，但其比在攪拌且通氣的發(fā)酵罐中的青霉素G的工業(yè)生產期間獲得的水平(> 25g/l)低得多。而且，為技術人員所熟知的是，在小規(guī)模發(fā)酵罐中獲得的生產力通常不完全代表在較大規(guī)模下獲得的那些生產力，特別是當有某一程度的粘度時。例如，大規(guī)模的混合時間通常比小規(guī)模的混合時間長得多，其可導致限制生產力的營養(yǎng)物的濃度中的梯度的存在。當應用至大規(guī)模的發(fā)酵，比如10m3規(guī)?；蚋笠?guī)模的發(fā)酵時，在小規(guī)模上論證的現有技術中提出的建議因而不是必然成功的?，F有技術從未公開也沒有建議通常在攪拌的通氣的發(fā)酵罐中進行的有價值化合物的工業(yè)規(guī)模粘性發(fā)酵工藝可在鼓泡塔中以高生物質濃度有利地進行。發(fā)明詳述在第一方面中，本發(fā)明提供了生產化合物的工藝，所述工藝使用能產生所述化合物的藻類、細菌或真菌，其中反應培養(yǎng)基的體積從IOm3至5000m3并且反應培養(yǎng)基的粘度從10厘泊至200厘泊，所述工藝的特征在于總能量輸入的> 50%是通過注入含氧氣體來遞送的并且總能量輸入的< 50%是通過機械手段來遞送的。優(yōu)選地，總能量輸入的> 75%并且更優(yōu)選地> 95%是通過注入含氧氣體來遞送的并且總能量輸入的< 50%、優(yōu)選地< 25%、更優(yōu)選地< 5%是通過機械手段來遞送的。在最優(yōu)選的實施方式中，100%的總能量輸入是通過注入含氧氣體來遞送的并且沒有能量輸入是通過機械手段來遞送的。該實施方式包括鼓泡塔，所述鼓泡塔特征在于通過注入含氧氣體來實現發(fā)酵罐的內含物的混合。本發(fā)明的優(yōu)勢是，通過注入含氧氣體來減少或替代用于能量輸入的機械手段，增加了在發(fā)酵工藝中的有價值的化合物對能量的產率(例如，被定義為在發(fā)酵工藝中每單位量的消耗的能量所產生的內酰胺的量)。在本發(fā)明上下文中，術語“總能量輸入”被定義為通過壓縮氣體或機械手段引入發(fā)酵罐中的組合能量并且排除通過進料至發(fā)酵罐中的氣體或液體所引入的化學能或熱能。在本發(fā)明上下文中，術語“機械手段”在本文中被定義為能將能量直接(即不是間接地經由氣相)輸入液相的任何手段。合適的手段是本領域技術人員所熟知的攪拌設備。用于發(fā)酵罐的攪拌設備在本領域中詳細記載并且是商業(yè)上廣泛可得到的。
在本發(fā)明上下文中，術語“鼓泡塔”是指由垂直排列的圓柱形柱組成的用于氣液反應的裝置，所述圓柱形柱可以以許多構建形式構造。氣體引入在柱的下半部發(fā)生并引起紊流以確保最佳氣體交換。通過氣體鼓泡(gas sparging)以及由上升的氣泡而產生的液體轉移和夾帶，發(fā)生混合。鼓泡塔的特征在于高液體含量和適度相界面并被用在各種類型的發(fā)酵中。“工業(yè)規(guī)?！痹诒疚闹斜欢x為在下述發(fā)酵罐中進行的發(fā)酵工藝，所述發(fā)酵罐具有彡10m3、優(yōu)選地彡25m3、更優(yōu)選地彡50m3、最優(yōu)選地彡IOOmM尤選地小于5000m3的體積?；蛘?，工業(yè)規(guī)模在本文中可被定義為具有至少4米、更優(yōu)選地至少5米、更優(yōu)選地至少6米、更優(yōu)選地至少7米、更優(yōu)選地至少8米、更優(yōu)選地至少9米、更優(yōu)選地至少10米的高度的發(fā)酵罐。優(yōu)選地，發(fā)酵罐具有小于15米的高度。工業(yè)規(guī)模還可被定義為在發(fā)酵液中發(fā)酵結束時的產物比如脂肪酸或β -內酰胺的濃度為至少5g/l、優(yōu)選地至少10g/l、更優(yōu)選地至少15g/1、更優(yōu)選地至少20g/l和最優(yōu)選地至少25g/l。含氧氣體可以是任何含氧氣體，比如空氣、富集氧的空氣、純氧或其混合物。優(yōu)選地，含氧氣體是空氣。當含氧氣體以在4cm/sec和30cm/sec之間、優(yōu)選地在7cm/sec和 25cm/sec之間、更優(yōu)選地在10cm/sec和20cm/sec之間的壓力校正的表面氣速在發(fā)酵罐的下半部釋放時，獲得最佳結果。本發(fā)明的工藝適用于對感興趣的任何有價值的化合物的發(fā)酵生產，所述化合物包括初級或次級代謝產物、藥物蛋白或藥物肽、或工業(yè)酶。初級代謝產物是對生長、發(fā)育或繁殖來說必需并且是許多物種所共有的生物分子。初級代謝產物例如是主要代謝途徑(比如糖酵解途徑或TCA循環(huán))的中間產物。初級代謝產物的例子是氨基酸和核酸。次級代謝產物對生長、發(fā)育或繁殖來說不是必需的，但其具有生態(tài)功能。次級代謝產物的例子是抗生素或β_內酰胺化合物，特別是β_內酰胺抗生素。一種優(yōu)選的有價值的化合物是β_內酰胺化合物。β -內酰胺化合物的例子是克拉維酸(clavulanic acid)、青霉素(例如青霉素G、青霉素V或6-氨基青霉烷酸)和半合成青霉素，比如阿莫西林，和頭孢菌素(比如頭孢菌素C)。在一個非常優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了使用能產生青霉素G的Penicilliumchrysogenum菌株生產青霉素G的工藝,而且所述工藝的特征在于100%的總能量輸入是通過注入含氧氣體來遞送的并且發(fā)酵罐是鼓泡塔。其他優(yōu)選的實施方式是用于生產β_內酰胺的工藝，其中β_內酰胺是β_內酰胺中間產物的N-?；苌?，比如7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢烯-4-羧酸(7ACCCA)、7_氨基頭抱燒酸(7-ACA)、7_氨基-3-氯-3-頭抱烯-4-羧酸(7-ACCA)、7-氨基脫乙酰氧-頭孢烷酸(7-ADCA)、7-氨基脫乙?；^孢烷酸(7-ADAC)、7-氨基-3-[(Z/E)-1-丙烯-1-基]-3-頭孢烯-4-羧酸(7-PACA)等等。如在 WO 93/05158、WO 93/08287或WO 2004/106347中公開的，在7-氨基位置上的?；鶅?yōu)選是產生相應己二酰衍生物的己二酸。其他的合適側鏈已在 WO 95/04148、WO 95/04149、WO 96/38580、WO 98/48034 和 WO98/48035中公開。用于本發(fā)明工藝的合適的微生物菌株可以是生產感興趣的有價值的化合物的任何野生型菌株。此外，本發(fā)明的合適的微生物菌株可以是這樣的菌株，所述菌株是通過使感興趣的親本菌株或野生型菌株經歷經典誘變處理或經歷重組DNA轉化而獲得和/或改進的菌株。在一個優(yōu)選的實施方式中，適用于本發(fā)明的工藝的微生物菌株是藻類、酵母、真菌、原生動物或細菌。微生物菌株可包括絲狀菌株或非絲狀菌株。優(yōu)選地,微生物菌株是藻類、細菌或真菌。優(yōu)選的細菌是Actinomycete。優(yōu)選地，Actinomycete是Streptomyces clavuligerus,其優(yōu)選產生作為有價值的化合物的克拉維酸。優(yōu)選地，真菌選自由 Aspergillus、Trichoderma、Penicillium 和 Acremonium 構成的組。優(yōu)選的例子是，用于生產青霉素G或青霉素V的Penicillium chrysogenum,用于生產頭抱菌素 C 的 Acremonium chrysogenum,以及 Aspergilli ( I匕如 Aspergillus niger 或Aspergillus oryzae),其作為野生型菌株或經經典改進的菌株,所述菌株生產酶(比如淀粉酶、脂肪酶、磷脂酶、半乳糖脂肪酶、半纖維素酶、木聚糖酶、纖維素酶、蛋白酶和已知在工業(yè)中使用的其它酶)或者經遺傳修飾以過量表達編碼這類酶的基因。在一種優(yōu)選的實施方式中，真菌是Penicillium chrysogenum,并且次級代謝產物是己二酰-7-ADCA、己二酰-7-ACA、己二酰-7-ADCA、己二酰-7-ACCA、己二酰 7-PACA 或己二酰-7-ACCCA，最優(yōu)選的是己二酰-7-ADCA。如在W093/05158中公開的，Penicilliumchrysogenum菌株被用編碼擴環(huán)酶的基因轉化并表達編碼擴環(huán)酶的基因。該經工程改造的 Penicillium chrysogenum菌株在存在作為側鏈前體的己二酸時于發(fā)酵容器中生長時,產生并排出己二酰-7-ADCA。可由本發(fā)明的發(fā)酵工藝生產的青霉素的例子是青霉素G、青霉素V或如在WO2008/040731中公開的阿莫西林以及許多其他青霉素。頭孢菌素的例子是頭孢菌素C，但優(yōu)選地是如上述的7-ADCA的N-?；苌?。出乎意料地發(fā)現，在其中100%的總能量輸入是通過注入含氧氣體來遞送的并且沒有能量輸入是通過機械手段來遞送的工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵工藝中，甚至在相對高的粘度下獲得了高生產力。因而，反應培養(yǎng)基中的合適的粘度是從5厘泊至500厘泊，優(yōu)選地從10厘泊至200厘泊，更優(yōu)選地從15厘泊至150厘泊，最優(yōu)選地從25厘泊至75厘泊。為了使發(fā)酵罐中的發(fā)酵液充分混合以及氧從注入的含氧氣體(比如空氣)傳遞進入發(fā)酵液，發(fā)酵液的粘度不應該過高并且優(yōu)選地在80厘泊以下。粘度通常主要由兩個因素確定，即發(fā)酵液中的生物質濃度和微生物的形態(tài)(稱為“生物質比粘度”)本發(fā)明的工藝不涉及面包酵母生產并因而排除面包酵母生產。面包酵母的工業(yè)生產可以在通氣而不用攪拌的鼓泡塔中進行。但是，在該工藝中，產生的生物質本身是生產工藝的目的，并且根據本發(fā)明的工藝，不能通過面包酵母生產有價值的化合物。本發(fā)明的工藝可用但不限于下述建議的實施例來闡釋。將具有正常開管鼓風機和Rushton渦輪的IOOm3攪拌釜發(fā)酵罐改型來測定在粘性真菌發(fā)酵工藝中減少通過攪拌器的能量輸入的作用。如期望地，降低能量輸入將減少發(fā)酵罐底部的氣泡分散，鼓風機被在發(fā)酵罐底部的全部表面積上分布空氣的鼓風機所替代。通過改變攪拌器速率改變攪拌器的能量輸入?？諝饬魉俦３趾愣āＴ跊]有能量輸入是通過攪拌完成的情況下，將攪拌器從容器中去除。用通過空氣流的能量輸入相對于通過攪拌的能量輸入的各種比率(40、50、75、95和100% ),進行具有從10厘泊逐漸增加至200厘泊的粘度的用Penicillium chrysogenum的青霉素發(fā)酵，以測定攪拌器能量輸入的作用。在氧傳遞限制生產時的發(fā)酵階段期間，實現所述比率。結果在

圖1和2中給出。當通過葉輪的能量輸入減少時，產物的量減少，這是因為氧傳遞減少。其在通過空氣的從95%至100%能量輸入的最后步驟中增加。這種作用被認為是由去除攪拌器引起的，攪拌器的存在和慢的動作可妨礙發(fā)酵罐中的氣泡流。能量輸入減少比生產量減少要多，因此每產物所需的能量的量減少(見圖2)。這些圖顯示了當通過通氣輸入所有的能量時，發(fā)現了最佳作用。這導致每產物量的總花費減少以及每產物量的碳足跡更小。圖例圖1展示了在用Penicillium chrys ogenum的青霉素發(fā)酵中每次發(fā)酵產生的產物量。X-軸是通過空氣的能量輸入的量(總能量輸入的％)。Y-軸是產生的產物量(相對于攪拌釜發(fā)酵)。圖2展示了在改變攪拌器速度時，用Penicillium chrysogenum的青霉素發(fā)酵中的比功率消耗。X-軸是通過空氣的能量輸入的量(總能量輸入的％)。Y-軸是消耗的能量的量(相對于攪拌釜發(fā)酵)。
權利要求
1.生產化合物的工藝，所述工藝使用能產生所述化合物的藻類、細菌或真菌，其中反應培養(yǎng)基的體積從IOm3至5000m3并且反應培養(yǎng)基的粘度從10厘泊至200厘泊，所述工藝的特征在于總能量輸入的> 50%是通過注入含氧氣體來遞送的并且總能量輸入的< 50%是通過機械手段來遞送的。
2.根據權利要求1的工藝，其中所述總能量輸入的>75%是通過注入含氧氣體來遞送的并且所述總能量輸入的< 25 %是通過機械手段來遞送的。
3.根據權利要求1的工藝，其中100%的所述總能量輸入是通過注入含氧氣體來遞送的。
4.根據權利要求1至3的任一項的工藝，其中所述注入含氧氣體的壓力校正表面氣速是在 7cm/sec 和 25cm/sec 之間。
5.根據權利要求1至4的任一項的工藝，所述工藝在鼓泡塔中進行。
6.根據權利要求1至5的任一項的工藝，其中所述化合物是β-內酰胺。
7.根據權利要求1至6的任一項的工藝,其中所述藻類、細菌或真菌是Acremonium種或 Penicillium 種。
8.根據權利要求6至7的任一項的工藝，其中所述化合物是己二酰-7-ACA、己二酸-7-ADCA或青霉素G。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用微生物生產有價值的化合物的工業(yè)規(guī)模發(fā)酵工藝，其中總能量輸入的≥50％是通過注入含氧氣體來遞送的并且總能量輸入的≤50％是通過機械手段來遞送的。
文檔編號C12M1/04GK103003439SQ201180031397
公開日2013年3月27日 申請日期2011年6月16日 優(yōu)先權日2010年6月22日
發(fā)明者約瑟夫·約翰尼斯·瑪利亞·霍米斯特, 沃特·阿德里安努斯·溫登·范 申請人:中化帝斯曼制藥有限公司荷蘭公司