專利名稱：測定糖化蛋白質(zhì)的組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于測定糖化蛋白質(zhì)的組合物和一種測定糖化蛋白質(zhì)的方法。可將本發(fā)明用于測定糖化蛋白質(zhì)的組合物和方法應用于臨床檢查，其能夠精確地測定糖化蛋白質(zhì)。
背景技術：
在糖尿病的診斷和控制中測定糖化蛋白質(zhì)是非常重要的。對能夠反應過去約1至2個月的平均血糖值的糖化血紅蛋白(GHb)，能反應過去約2周的平均血糖值的糖化清蛋白(GA)，一般地指示血清中具有還原能力的糖化蛋白的果糖胺(FRA)等可每天進行測定。GHb是血紅蛋白的糖化產(chǎn)物，即在血紅蛋白β-鏈上N-末端纈氨酸的α-氨基基團被糖化。GA和FRA分別是清蛋白和血清蛋白的糖化產(chǎn)物，即清蛋白或血清蛋白的賴氨酸殘基上的ε-氨基基團被糖化。
酶學方法是一種簡易且便宜的精確測定糖化蛋白質(zhì)的方法。日本專利申請公開No.6-46846，No.5-192193，No.2-195900和No.2-195899，以及國際專利申請公布號WO98/48043和WO97/13872是公開此酶學方法的文獻實例。
然而，為提供一種精確測定糖化蛋白質(zhì)的組合物，有必要1)消除球蛋白組分和抗壞血酸的影響以及2)使蛋白酶和能夠至少與糖化氨基酸反應的酶保持穩(wěn)定。此外，如果糖化蛋白是糖化清蛋白，則3)精確測定清蛋白和4)消除糖化血紅蛋白的影響也很重要。
1)消除球蛋白組分和抗壞血酸的影響的常規(guī)方法已知糖尿病患者的球蛋白的量能夠改變和影響FRA的值[Rodrigues，S.等，臨床化學(Clin.Chem.)35134-138(1989)]。本發(fā)明人研發(fā)了一種方法，其中通過向蛋白酶反應液中加入特定金屬離子和蛋白質(zhì)A或G可選擇性地抑制蛋白酶對球蛋白組分的作用(日本專利申請No.11-231259)。利用此發(fā)明的方法，可以測定糖化蛋白而不會受到球蛋白組分的影響。應用于此方法中的球蛋白選擇性蛋白酶抑制劑可提及的有金屬、蛋白A和蛋白G。在此專利申請所述的金屬中，強效金屬是那些可能會導致環(huán)境安全問題的重金屬。而弱效金屬如果與其它試劑(或組合物)結合可能導致試劑溶液渾濁。另外，蛋白A和蛋白G都是非常昂貴的試劑。
作為選擇性吸附血液中球蛋白的方法，已知血液處理劑利用色譜學原理以及具有類固醇骨架的引入了配體的乙烯共聚物可對血液中的內(nèi)毒素和球蛋白進行吸附(日本專利申請公開No.61-94663)。然而，在日本專利申請公開No.61-94663的實施例中附表1所示的結果表明只有α1-球蛋白和α2-球蛋白被證明可被吸附，而占球蛋白組分70％或更多的γ-球蛋白不能被吸附。假設γ-球蛋白被吸附，則不會期望血液處理試劑具有抑制蛋白酶對γ-球蛋白的作用的能力。
近年來，大量抗壞血酸作為增補物被攝取的情況越來越多。含有高濃度抗壞血酸的臨床樣品也在增加?？箟难嵊捎诰哂袕娺€原性而對臨床檢查造成多種影響。
作為消除抗壞血酸影響的方法，已知可通過化學或利用抗壞血酸氧化酶的酶學方法去除樣品中的抗壞血酸。從對顯色系統(tǒng)引起較小影響來考慮，當利用至少與糖化氨基酸反應的酶對利用蛋白酶斷裂糖化蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的糖化氨基酸進行檢測時，優(yōu)選預先地在與蛋白酶反應時利用抗壞血酸氧化酶(ASOx)去除抗壞血酸的方法。
作為蛋白酶存在時利用ASOx去除樣品中抗壞血酸的實例，對在pH8.0的2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸(HEPES)緩沖液中使ASOx與樣品溶液反應的實驗已有報道(Clinical Chemistry(臨床化學)，2799-106，1998)。文獻報道經(jīng)過兩周的冷藏后處理抗壞血酸的能力沒有變化。
然而，本發(fā)明人的研究表明當HEPES緩沖液(pH8.0)、蛋白酶和ASOx存在時，在37℃下貯藏一天或在10℃下貯藏兩周后抗壞血酸處理能力已經(jīng)幾乎完全喪失。
2)用于穩(wěn)定蛋白酶和至少與糖化氨基酸反應的酶的現(xiàn)有技術用于糖化蛋白質(zhì)的臨床檢測的蛋白酶溶液具有在其它領域如食品業(yè)中無法見到的極高濃度。已知蛋白酶在水溶液中能進行自消化。難以想象蛋白酶能以如此高濃度在水溶液中保持穩(wěn)定。因此，在用于鑒定糖化蛋白的組合物中使用的蛋白酶以凍干產(chǎn)物形式提供。
目前尚沒有用于測定糖化蛋白質(zhì)的組合物及測定糖化蛋白質(zhì)的方法能使其中的蛋白酶以液態(tài)形式保持穩(wěn)定并可長期貯藏。目前也沒有測定糖化蛋白質(zhì)的組合物以及測定糖化蛋白質(zhì)的方法能使其中的至少與糖化氨基酸反應的酶以液態(tài)形式保持穩(wěn)定并可長期貯藏。
3)有關精確測定清蛋白的方法的現(xiàn)有技術抗清蛋白抗體免疫和利用溴甲酚綠(BCG)、溴甲酚紫(BCP)的染色法等是測定清蛋白的方法。染色法由于操作簡便成本低廉而被廣泛用于每日檢測中。雖然已經(jīng)證實BCG對球蛋白組分的作用，但BCG的缺點是對清蛋白的專一性低。
另一方面，BCP盡管對清蛋白具有高專一性但易受到共存物質(zhì)的影響。尤其是，BCP受到SH化合物的影響，從而導致測定結果依據(jù)清蛋白的氧化還原狀態(tài)出現(xiàn)差異的問題。為解決這一問題，提出了在蛋白質(zhì)變性劑和/或SH試劑存在時反應BCP的方法(日本專利申請公開No.10-232233)。然而，還沒有關于BCP對GA和非糖化清蛋白(NGA)的反應性的研究實例。
4)消除糖化血紅蛋白影響的現(xiàn)有技術如上所述，GA是從清蛋白經(jīng)ε-氨基的糖化衍生得到，而GHb是經(jīng)糖化血紅蛋白β-鏈上的N-末端纈氨酸的α-氨基得到。因此，如果GA作為測量對象，可能期望只測定ε-氨基被糖化的氨基酸。雖然已知有幾種酶顯示出對ε-氨基的高度專一性而且對糖化纈氨酸沒有作用(日本專利申請公開No.11-243950)，但是沒有一種酶的成本足夠低廉以致可作為實際應用中的酶。其中，來自尖鐮孢(Fusarium oxysporm)的果糖基氨基酸氧化酶(FOD)具有高反應性，是有用的。本發(fā)明人單獨報道了FOD的基因(日本專利申請公開No.10-201473)。雖然利用此基因的方法產(chǎn)率高且能夠以低成本生產(chǎn)FOD，但本發(fā)明人證實，其與α-氨基被糖化的糖化纈氨酸的反應性沒有顯示出令人滿意的專一性。
發(fā)明詳述本發(fā)明的目的是為精確測定糖化蛋白質(zhì)提供一種組合物，該組合物1)能夠消除球蛋白組分和抗壞血酸的影響以及2)使蛋白酶和至少與糖化氨基酸反應的酶保持穩(wěn)定，并提供一種穩(wěn)定方法。本發(fā)明的另一目的是在糖化蛋白質(zhì)是糖化清蛋白的情況下提供一種3)能夠精確測定清蛋白并且4)能夠消除糖化血紅蛋白的影響的組合物，及提供一種消除糖化血紅蛋白的影響的方法。
為精確測定糖化蛋白質(zhì)，有必要1)消除球蛋白組分和抗壞血酸的影響以及2)使蛋白酶和至少與糖化氨基酸反應的酶保持穩(wěn)定。此外，如果糖化蛋白是糖化清蛋白，則有必要3)準確測定清蛋白和4)消除糖化血紅蛋白的影響。
1)消除球蛋白組分和抗壞血酸的影響的方法本發(fā)明人經(jīng)過廣泛研究發(fā)現(xiàn)如果將選自脫氧膽酸，脫氧膽酰胺，膽酰胺，季銨鹽，季銨鹽類陽離子表面活性劑，伴刀豆凝集素A，辛基葡糖苷，和甜菜堿的一種或多種組分添加到蛋白酶反應溶液中，則可以選擇性地抑制蛋白酶對球蛋白組分的作用，而且即使使至少與糖化氨基酸反應的酶直接與此反應溶液反應，也不會抑制此酶促作用而能簡單且重復性極好地精確測定糖化蛋白。這些化合物具有經(jīng)濟方面的優(yōu)點，與利用常規(guī)技術的方法相比沒有環(huán)境和安全的問題，且與樣品混合時不會產(chǎn)生混濁。
ASOx能有效除去抗壞血酸。然而，通常很難假定ASOx在含有大量蛋白酶的反應液中能保持穩(wěn)定。實際上，根據(jù)本發(fā)明人對各種蛋白酶、蛋白酶抑制劑和各種ASOx的研究，尚未發(fā)現(xiàn)存在能使ASOx在含有大量蛋白酶的反應液中保持穩(wěn)定的條件。
然而經(jīng)過潛心研究，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)ASOx的穩(wěn)定性依據(jù)緩沖液的類型可以顯著增加。
2)蛋白酶和至少與糖化氨基酸反應的酶的穩(wěn)定如上所述，在糖化蛋白的臨床測定中使用的是高蛋白酶濃度的蛋白酶溶液。原則上，蛋白酶本身在這樣的溶液中是不穩(wěn)定的。然而，經(jīng)過廣泛研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)如果添加二甲基亞砜，醇，水溶性鈣鹽，氯化鈉，季銨鹽或季銨鹽類陽離子表面活性劑，則蛋白酶的穩(wěn)定性可以顯著增加且蛋白酶能以高濃度溶液形式長期貯藏。
至少與糖化氨基酸反應的酶是不穩(wěn)定的，因為如果以液態(tài)形式在37℃貯藏4天，酶活力將減少到初始活力的約10％。然而，經(jīng)過廣泛研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)如果將選自糖醇，蔗糖，水溶性鎂鹽，水溶性鈣鹽，硫酸銨，氨基酸和肌氨酸的穩(wěn)定劑添加到至少與糖化氨基酸反應的酶中，則能夠產(chǎn)生令人吃驚地高穩(wěn)定作用以致酶以液態(tài)形式在37℃貯藏4天后酶活力幾乎沒有可見的減少。
此外，雖然蛋白酶在接近最適pH時顯示出高的蛋白水解活力，但是同時發(fā)生的自體消化反應使得難于尤其以液態(tài)形式貯藏蛋白酶。然而，經(jīng)過廣泛研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過提供第一試劑(其被配制成能適當引起蛋白酶的反應)以及第二試劑(其被配制成能穩(wěn)定液態(tài)蛋白酶)，蛋白酶可以穩(wěn)定地貯藏且不受檢測時條件的影響。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)即使將用于預反應的酶摻入到第二試劑中，也可以進行精確測定而不影響測量結果。另外，如果將至少與糖化氨基酸反應的酶添加到第一試劑中，則可預先除去樣品中的糖化氨基酸并選擇性地測定糖化蛋白質(zhì)。
3)精確測定清蛋白的方法經(jīng)本發(fā)明人的研究意外發(fā)現(xiàn)BPC與GA的反應性不同于BPC與NGA的反應性，而且如果有大量NGA存在，分析值會受到負面影響。經(jīng)過廣泛研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可通過在測定清蛋白之前或同時以蛋白質(zhì)變性劑和/或具有S-S鍵的化合物處理樣品，實現(xiàn)對含有大量NGA的樣品中的清蛋白的精確測定。
4)消除糖化血紅蛋白的影響基于對上述問題的大量研究，本發(fā)明人通過對來自尖鐮孢IFO-9972菌株的FOD基因進行修飾制備出突變FOD并測定了突變FOD的性質(zhì)，結果發(fā)現(xiàn)通過以另一個氨基酸替代從N-端算起的第372位賴氨酸可以使底物特異性發(fā)生明顯改變。而且，本發(fā)明人還制備了幾種對糖化纈氨酸僅顯示出極低的反應性并幾乎專一地與糖化賴氨酸進行反應的經(jīng)修飾FOD。
根據(jù)上述結果發(fā)現(xiàn)的這些突變FOD由于以另一氨基酸替代SEQ IDNo.1所示氨基酸序列中的第372位賴氨酸，已經(jīng)喪失了與糖化纈氨酸的反應性。具體來說，這些突變FOD為權利要求1所述的突變FOD，其是以色氨酸、甲硫氨酸或纈氨酸替代SEQ ID No.1所示氨基酸序列中的第372位賴氨酸而得到的。
最后，綜合上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人完成了用于精確測定糖化蛋白質(zhì)的組合物和方法。
本發(fā)明的構成和優(yōu)選實施方案將在下文進行詳述。
任何蛋白酶都可應用于本發(fā)明，只要該蛋白酶能夠有效地與包含在樣品中的糖化蛋白質(zhì)反應并有效地從糖化蛋白質(zhì)產(chǎn)生糖化氨基酸和/或糖化肽即可。實例包括來源于動物，植物，和微生物如芽孢桿菌屬(Bacillus)，曲霉屬(Aspergillus)，青霉屬(Penicillium)，鏈霉菌屬(Streptomyces)，葡萄球菌屬(Staphylococcus)，梭菌屬(Clostridium)，Lysobacter，Glifila，酵母屬(Yeast)，Tritirachium，棲熱菌屬(Thermus)，假單胞菌屬(Pseudomonus)和無色桿菌屬(Achromobacter)等的蛋白酶。
如果待測定的糖化蛋白是GA，則優(yōu)選對人類清蛋白(Alb)具有高反應性的芽孢桿菌屬或鏈霉菌屬的微生物蛋白酶。如果待測定的糖化蛋白是GHb，則優(yōu)選對人類血紅蛋白(Hb)具有高反應性的芽孢桿菌屬、曲霉屬、鏈霉菌屬或Tritirachium的微生物蛋白酶。
本發(fā)明中對蛋白酶活性的測定如下。
《測定蛋白酶活性的方法》
在下列條件下，30℃一分鐘給出相應于1μg酪氨酸的顏色改變的蛋白酶活性被指定為1PU(蛋白水解單位)。
<底物>0.6％乳酪蛋白(由Merck & Co.，Inc.生產(chǎn))<酶溶液>稀釋至10-20PU<酶稀釋溶液>20mM乙酸緩沖液(pH7.5)，1mM醋酸鈣，100mM氯化鈉<反應終止溶液>0.11M三氯乙酸，0.22M醋酸鈉，0.33M乙酸<步驟>
將蛋白酶溶液溶解于酶稀釋溶液中使其濃度為10-20PU/ml。取1ml此溶液置于試管中并加熱到30℃。然后加入預熱至30℃的5ml底物溶液。正好10分鐘之后加入5ml反應終止溶液以終止反應。將混合物加熱到30℃維持30分鐘以使沉淀物沉積。通過Toyo濾器No.131(9cm)過濾混合物得到濾液。對于空白實驗，在試管中將1ml蛋白酶溶液加熱到30℃，加入5ml反應終止溶液，然后再加入5ml底物溶液，之后以同樣的方法對沉淀物進行沉積和過濾。向2ml濾出液中加入5ml的0.55M碳酸鈉溶液和1ml稀釋3倍的福林試劑。30℃反應30分鐘后，測定660nm的吸光度。通過從與酶反應的樣品的吸光度中減去空白吸光度確定吸光度變化。然后利用單獨繪制的標準活性曲線確定酶活性。
<標準活性曲線的繪制>
將濃度調(diào)節(jié)成約50PU/ml的酶溶液進行稀釋以制備系列放大稀釋的幾個酶溶液，濃度在2-50PU/ml。對每一種酶溶液執(zhí)行上述操作。沿縱軸繪制所得的吸光度變化，沿水平軸繪制稀釋倍數(shù)。另一方面，標準酪氨酸溶液(酪氨酸濃度9.09μg/ml)的制備是將L-酪氨酸溶于0.2N鹽酸溶液使其濃度為0.01％再將10ml的0.2N鹽酸溶液加入到1ml的L-酪氨酸溶液中得到。對2ml標準酪氨酸溶液和2ml的0.2N鹽酸溶液執(zhí)行上述測量操作。所得的吸光度變化對應于18.2μg的酪氨酸。將吸光度變化在上圖中繪出。從繪制點引出的垂直線與水平軸的交點對應10PU/ml。
這些蛋白酶可以以在規(guī)定時段能夠有效消化靶蛋白的任意濃度使用，例如通常為1-100,000PU/ml，優(yōu)選10-10,000PU/ml。
對于可應用于本發(fā)明中至少與糖化氨基酸反應的酶，可選用能夠同含在樣品溶液中的糖化蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的糖化氨基酸或糖化肽進行有效反應并能夠通過蛋白酶的作用實質(zhì)上測定糖化蛋白質(zhì)的任何酶。舉例來說，至少與糖化氨基酸反應的酶可以是能夠與α-氨基被糖化的氨基酸進行有效反應的酶，及能夠與ε-氨基被糖化的氨基酸進行有效反應的酶，等等。
作為能夠與ε-氨基被糖化的氨基酸進行有效反應的所述至少與糖化氨基酸反應的酶的實例，有來自赤霉屬(Gibberella)，曲霉屬，假絲酵母屬(Candida)，青霉屬，鐮孢霉屬(Fusarium)，頂孢霉屬(Acremonium)或德巴利酵母屬(Debaryomyces)的微生物的FOD。
作為能夠與α-氨基被糖化的氨基酸進行有效反應的所述至少與糖化氨基酸反應的酶的實例，有來自棒狀桿菌屬(Corynebacterium)的微生物的酶。
另外，作為在蛋白酶存在時活性充足并且制備成本低的酶的實例，可提及通過基因重組產(chǎn)生的酮胺氧化酶(R-FOD，由Asahi Kasei公司生產(chǎn))和與糖化纈氨酸的反應性極大降低的突變FOD(R-FOR-II，由Asahi kasei公司生產(chǎn))。
編碼來自尖鐮孢IFO-9972菌株(其能產(chǎn)生R-FOD-II)的FOD蛋白的DNA，可利用常規(guī)方法從尖鐮孢IFO-9972菌株中提取染色體DNA并利用PCR或雜交法分離出編碼FOD蛋白的DNA來獲得。
為了將突變引進所得的FOD基因中，可利用PCR法或定點誘變直接使DNA突變。如果利用隨機誘變，則可以將DNA修復缺陷型大腸桿菌用作宿主，也可以對引入了FOD基因的宿主微生物在含有DNA誘變源的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
由此方法獲得的突變FOD基因可利用合適的宿主-載體系統(tǒng)引入宿主微生物。利用表達載體的標記和FOD活性的表達或DNA探針作為指示對具有含F(xiàn)OD基因的重組DNA質(zhì)粒的微生物進行篩選分離。通過培養(yǎng)基因重組微生物，從微生物中提取重組蛋白質(zhì)，并純化蛋白質(zhì)而獲得突變FOD。
獲得突變FOD的一個具體方法如下所述。在以下步驟中，常規(guī)方法包括，例如，Maniatis等的方法(Maniatis，T.，等Molecular Cloning(分子克隆)。Cold Spring Harbor Labortory(冷泉港實驗室)1982，1989)或在各種商品酶和試劑盒所附手冊中描述的方法。
為了將突變引入分離出的FOD基因中，可在添加錳離子的條件下使用3′→5′修復缺陷聚合酶如Taq聚合酶進行PCR。或者，可以使用如下方法，即，將此FOD基因引入DNA修復缺陷的大腸桿菌宿主，在含有能引起基因突變的誘變源如聯(lián)二茴香胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主微生物，從產(chǎn)生的候選突變菌株中分離出獲得靶底物專一性的突變體。
可通過雙脫氧法(Sangar，F(xiàn).(1981)Science(科學)，214，1205-1210)測定引入突變的基因的堿基序列，對由上述方法引進的FOD突變進行驗證。
一旦突變已確定，還可以利用Zoller等的方法(Zoller，M.J.和Smith，M.(1983)，Methods in Enzymology(酶學方法)，154，367)通過定向誘變引進特異突變。
從突變基因的堿基序列可確定形成突變FOD的多肽的氨基酸序列突變?？赏ㄟ^將突變FOD基因加到適當宿主-載體系統(tǒng)中重組產(chǎn)生由上述方法獲得的突變FOD。
對于突變FOD基因所摻入的載體，為基因重組用途從噬菌體或質(zhì)粒構建出的能在宿主微生物中自主生長的載體是適用的。對于噬菌體載體，如以大腸桿菌微生物作為宿主微生物時，可利用如λgt·λC，λgt·λB等。對于質(zhì)粒載體，如以大腸桿菌作為宿主微生物，優(yōu)選利用如質(zhì)粒pBR322，pBR325，pACYC184，pUC12，pUC13，pUC18，pUC19，pUC118，pIN I和Bluescript KS+；以枯草芽孢桿菌作為宿主微生物時，可利用pUB110和pKH300PLK；以放線菌(Actinomyces)作為宿主微生物時，可利用pIJ680和pIJ702；以酵母，尤其釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作為宿主微生物時，可利用Yrp7，pYC1和Yep3。
為了將突變FOD基因摻入如此獲得的載體中，載體和突變FOD基因都以適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶進行消化以便產(chǎn)生出相同末端，然后按照常規(guī)方法利用DNA連接酶使含有突變FOD基因的DNA片斷和載體片斷進行連接。
任何微生物都可以作為宿主微生物向其中轉入結合有突變FOD基因的載體，只要重組DNA能穩(wěn)定自主地生長即可。當宿主微生物是屬于大腸桿菌的微生物時，可使用如大腸桿菌DH1，大腸桿菌JM109，大腸桿菌W3110，大腸桿菌C600等。當宿主微生物是屬于枯草芽孢桿菌的微生物時，可使用枯草芽孢桿菌ISW1214等。當宿主微生物是屬于放線菌的微生物時，可使用鉛青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)TK24等。當宿主微生物是屬于釀酒酵母的微生物時，可使用釀酒酵母INVSC1等。
對于將重組DNA摻入宿主微生物的方法，如宿主微生物屬于大腸桿菌、釀酒酵母或鉛青紫鏈霉菌，可例如按照常規(guī)方法將重組DNA轉入已轉變成感受態(tài)細胞的宿主微生物中。根據(jù)不同菌株類型可使用電穿孔。
為產(chǎn)生突變FOD，可在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中對已經(jīng)引入突變FOD基因的宿主微生物進行培養(yǎng)，收集培養(yǎng)細胞，通過在適當?shù)木彌_液中超聲粉碎或通過溶菌酶處理使細胞破碎以制備細胞提取物?？梢蕴砑有盘栃蛄幸砸鸱置诒磉_，這樣突變FOD將在培養(yǎng)液中積聚。
可通過常規(guī)的硫酸銨沉淀，凝膠過濾，柱純化等方法分離純化由此產(chǎn)生的突變FOD并作為一種酶制品提供。
在上述基因操作技術中一般按比例使用各組分，例如，對于源自微生物的0.1-10μg的DNA和載體DNA，使用約1-10U的限制性內(nèi)切酶，約300U的連接酶，以及約1-10U其它酶。
作為包含突變FOD基因并能夠產(chǎn)生突變FOD的轉基因微生物的具體實例，有大腸桿菌JM109·pcmFOD3(FERM BP-7847)，即一種以大腸桿菌作為宿主微生物并具有包含突變FOD基因的質(zhì)粒pcmFOD3的轉基因微生物；大腸桿菌JM109·pcmFOD4，一種包含pcmFOD4的轉基因微生物；以及大腸桿菌JM109·pcmFOD5(FERM BP-7848)，一種包含pcmFOD5的轉基因微生物。這些質(zhì)粒的結構如附圖7所示。
2001年1月16日大腸桿菌JM109·pcmFOD3和大腸桿菌JM109·pcmFOD5由獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所國際專利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，an IndependentAdministrative Institution)(日本茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6，郵編305-8566(Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本))保藏，保藏號分別是FERM BP-7847和FERM BP-7848。
在從轉基因微生物生產(chǎn)突變FOD時，在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉基因微生物，以便在細胞或培養(yǎng)液中產(chǎn)生突變FOD，培養(yǎng)結束后通過過濾或離心培養(yǎng)液來收集細胞，經(jīng)過機械法或利用溶菌酶的酶法等破碎細胞，任選地通過加入EDTA和/或適當表面活性劑對突變FOD的水溶液進行濃縮，然后利用硫酸銨分級沉淀、凝膠過濾、吸附層析如親和層析或離子交換層析對濃縮物或非濃縮水溶液進行純化，由此獲得高純度的突變FOD。
對轉基因微生物的培養(yǎng)條件的選擇要考慮微生物的營養(yǎng)和生理特點。通常，液體培養(yǎng)條件可在許多情況下應用。不過，深通氣攪拌有利于工業(yè)生產(chǎn)。就培養(yǎng)基中的營養(yǎng)源來說，可利用常規(guī)應用于微生物培養(yǎng)的營養(yǎng)源。
任何可利用的碳氫化合物如葡萄糖，蔗糖，乳糖，麥芽糖，果糖和糖蜜都可作為碳源。任何可利用的氮化合物如蛋白胨，肉膏，酵母提取物和酪蛋白水解物都可作為氮源。
如需要，還可加入其它組分包括鹽類如磷酸，碳酸，硫酸的鹽，鎂鹽，鈣鹽，鉀鹽，鐵鹽，錳鹽和鋅鹽，特定氨基酸和特定維生素。
培養(yǎng)溫度可在微生物能進行生長和產(chǎn)生突變FOD的范圍內(nèi)適當變化。對大腸桿菌來說，優(yōu)選溫度范圍是大約20-42℃。雖然根據(jù)培養(yǎng)條件培養(yǎng)時間可稍有差異，但可在突變FOD產(chǎn)量達到最大值的適當時間終止培養(yǎng)。對大腸桿菌來說，培養(yǎng)時間通常是12-48小時。培養(yǎng)基的pH可在微生物能進行生長和產(chǎn)生突變FOD的范圍內(nèi)適當變化。對大腸桿菌來說，優(yōu)選pH范圍是大約6-8。
培養(yǎng)基中的突變FOD可通過收集含有細胞的培養(yǎng)基就此進行利用。然而一般來說，如果突變FOD存在于培養(yǎng)液中，則利用從微生物細胞中經(jīng)過濾或離心分離出的含突變FOD的溶液。如果突變FOD存在于細胞中，則通過過濾、離心或其它方法從所得培養(yǎng)液中收集細胞，然后任選地用機械法或利用溶菌酶的酶法等破碎細胞，再將突變FOD溶解于添加了螯合劑如EDTA和/或表面活性劑的水中以選擇和收集突變FOD的水溶液。
可以通過減壓或膜過濾濃縮這樣獲得的含突變FOD的溶液，進而通過硫酸銨，硫酸鈉等作鹽析處理以分級沉淀突變FOD。
然后可將沉淀物溶于水中并用半透膜透析以去除低分子量的雜質(zhì)?；蛘?，可通過利用吸附劑、凝膠過濾劑等的凝膠過濾、吸附層析如親和層析或離子交換層析對含突變FOD的溶液進行純化?？蓪?jīng)這些方法得到的含突變FOD的溶液進行減壓濃縮，冷凍干燥或其它加工以提供純化的突變FOD。
利用如下方法測定與糖化氨基酸反應的酶的活性。
《測定與糖化氨基酸反應的酶的活性的方法》<反應溶液的組成>
50mM Tris緩沖液(pH7.5)0.03％4-氨基安替比林(4-AA)(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生產(chǎn))0.02％苯酚(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生產(chǎn))4.5U/ml過氧化物酶(POD)(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))1.0mM α-芐酯基-ε-D-1-脫氧-果糖基賴氨酸或1-脫氧-果糖基纈氨酸(根據(jù)Hashiba等的方法(Hashiba，H.等，J.Agric.FoodChem.，24；70，1976)進行合成和純化。以下分別簡稱“ZFL”和“FV”)。
將1ml上述反應溶液置于一個小試管中37℃預熱5分鐘，然后加入0.02ml適當稀釋的酶溶液。攪拌混合物以引發(fā)反應。反應正好10分鐘之后，加入2ml的0.5％SDS以終止反應。測定500nm波長下的吸光度(As)。作為空白實驗，用0.02ml蒸餾水代替酶溶液進行同樣操作以測定吸光度(Ab)。從酶反應后的吸光度(As)和空白實驗的吸光度(Ab)的差值(As-Ab)確定酶活性。預先可利用過氧化氫的標準溶液確定吸光度和所產(chǎn)生的過氧化氫的相關性。在37℃一分鐘內(nèi)能產(chǎn)生1μmol過氧化氫的酶量被定義為1U。
計算表達式如下所示。
酶活性(U/ml)＝[(As-Ab)/12.0]×[3.02/0.02]×[1/10]×[2/B]3.02反應溶液總量(ml)0.02酶溶液總量(ml)10反應時間2表示從兩個過氧化氫分子使4-AA和苯酚縮和產(chǎn)生1分子有色物質(zhì)的系數(shù)12.04-AA-苯酚的毫摩爾吸光系數(shù)B酶溶液的稀釋放大倍數(shù)經(jīng)上述方法得到的突變FOD中，其中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中第372位賴氨酸被色氨酸替代的突變FOD具有下列酶學性質(zhì)。
(1)底物專一性ZFL 100％FV 0％(2)酶反應該酶反應至少催化α-氨基酸或ε-氨基酸的阿馬多瑞氏(amadori)化合物分解以產(chǎn)生葡糖醛酮、過氧化氫以及相應的α-氨基酸或ε-氨基酸，如下列反應式所示。
(3)分子量利用Sephadex G-100和含有0.2M NaCl的0.1M磷酸緩沖液(pH7.0)洗脫液通過柱凝膠過濾法測定的酶分子量是48,000±2,000。利用SDS-PAGE所得的結果是47,000±2,000。
(4)等電點在以兩性電解質(zhì)為載體的聚焦電泳中4℃下加載700V衡壓保持40小時對酶進行分級分離，然后測定每一級分的酶活性，由此確定的等電點是pH4.3±0.2。
(5)Km值通過在含有50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)，0.03％的4-AA，0.02％苯酚和4.5U/ml過氧化物酶的反應溶液中改變ZFL濃度而測定的合成底物ZFL的Km值是3.4mM。
(6)最適pH值按照上述測定酶活性的方法，但將100mM乙酸緩沖液(pH4.4-5.4)、磷酸緩沖液(pH5.6-7.9)Tris-Hcl緩沖液(pH7.3-8.5)或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH8.0-10.3)替代50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)用于反應溶液以測定酶活性。結果，酶在pH7.5顯示出最大活性。
(7)pH穩(wěn)定性將0.5ml含0.5U酶的以0.5M濃度用于測定最適pH的各種緩沖液，在40℃下孵育10分鐘，然后按照下面說明的活性測定方法測定殘余活性。結果，發(fā)現(xiàn)在pH7.0-9.0酶保持了80％或更多活性。
(8)熱穩(wěn)定性利用0.2M tris-HCl緩沖液(pH7.5)制備0.5U酶溶液并加熱10分鐘，然后按照活性測定方法測定殘余活性。結果，發(fā)現(xiàn)不超過40℃酶保持95％或更多活性。
(9)最適溫度按照活性測定方法利用40mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)在不同溫度下對酶進行反應。反應10分鐘之后，加入2ml的0.5％十二烷基硫酸鈉(此下稱為“SDS”)以終止反應。測定500nm下的吸光度(As)。結果，酶在50℃下顯示出最大活性。
接下來， 將討論在用與糖化纈氨酸反應性明顯減少的突變FOD消除樣品溶液中的糖化賴氨酸之后，利用與糖化纈氨酸具有反應性的FOD測定樣品中糖化纈氨酸的方法，所述突變FOD通過用另一個氨基酸替代SEQID No.1所示氨基酸序列中的第372位賴氨酸獲得。
任何與糖化纈氨酸不具有反應性的FOD都可以用于消除樣品溶液中的糖化賴氨酸。例如，可利用通過以另一個氨基酸替代SEQ ID No.1所示氨基酸序列中的第372位賴氨酸所獲得的、與糖化纈氨酸反應性明顯減少的突變FOD。在突變FOD中，優(yōu)選使用SEQ ID No.1所示氨基酸序列中第372位賴氨酸被色氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸中的任一個所替代的突變FOD。添加到反應溶液中的酶量可以是足夠消除樣品溶液中糖化賴氨酸的量，如0.5-200U/ml，更優(yōu)選1-50U/ml。
對用于測定糖化纈氨酸的FOD沒有限制，只要此FOD能與糖化纈氨酸進行反應即可。例如，可利用尖鐮孢IFO-9972菌株的FOD。添加到反應溶液中的酶量可以是足夠測定樣品溶液中糖化纈氨酸的量，如0.5-200U/ml，更優(yōu)選1-50U/ml。
一個具體的測定方法包括在第一反應中使含糖化賴氨酸和糖化纈氨酸的樣品溶液中的糖化賴氨酸與突變FOD進行反應，以過氧化氫酶等分解在反應中產(chǎn)生的過氧化氫，使在第二反應中通過樣品溶液內(nèi)的糖化纈氨酸與FOD的反應產(chǎn)生的過氧化氫與4-氨基安替比林(4-AA)和Trinder試劑反應，并用比色法測定產(chǎn)生的顏色?？梢栽诘诙磻芤褐屑尤脒^氧化氫酶抑制劑疊氮化鈉。
對于可用于本發(fā)明中精確測定糖化蛋白質(zhì)的對球蛋白組分具有選擇性的蛋白酶抑制劑，任何對球蛋白組分具有選擇性的抑制劑都可利用，只要在此球蛋白組分選擇性蛋白酶抑制劑存在下，當樣品溶液與蛋白酶反應時此抑制劑能夠引起主要對非球蛋白組分的其它蛋白質(zhì)的消化即可。優(yōu)選的實例有脫氧膽酸，脫氧膽酰胺，膽酰胺，季銨鹽，季銨鹽型陽離子表面活性劑，伴刀豆凝集素A，辛基葡糖苷和甜菜堿。
作為脫氧膽酰胺，舉例來說，優(yōu)選N，N-二(3-D-葡糖酰氨基丙基)脫氧膽酰胺。作為膽酰胺，舉例來說，優(yōu)選3-[(3-膽酰氨基丙基)二甲基銨]-2-羥基丙磺酸，3-[(3-膽酰氨基丙基)二甲基銨]丙磺酸，N，N-二(3-D-葡糖酰氨基丙基)膽酰胺等。
作為季銨鹽，舉例來說，優(yōu)選氯化芐基三乙基銨和氯化芐基三正丁基銨。作為季銨鹽型陽離子表面活性劑，舉例來說，優(yōu)選氯化月桂基三甲基銨和月桂基二甲基胺氧化物。
這些具有球蛋白組分選擇性的抑制劑既可以單獨使用，也可以兩種或多種聯(lián)合使用。
這些具有球蛋白組分選擇性的抑制劑可以以能夠在反應中充分抑制蛋白酶與球蛋白組分的反應的量使用。如果利用脫氧膽酸，脫氧膽酰胺，膽酰胺，辛基葡糖苷，季銨鹽或季銨鹽型陽離子表面活性劑，優(yōu)選的濃度為大約0.01-20％，更優(yōu)選的濃度范圍為0.05-10％。濃度也可在這些范圍之外。
如果使用伴刀豆凝集素A，辛基葡糖苷或甜菜堿，例如，可應用的濃度分別為大約0.01-10mg/ml或0.005-5％，優(yōu)選濃度范圍分別為0.02-2mg/ml或0.05-10％。此范圍外的濃度也可使用。
就用于本發(fā)明中精確測定糖化蛋白質(zhì)的ASOx來說，任何能夠有效地與包含在樣品溶液中的抗壞血酸進行反應的酶都可利用。實例有來自植物或微生物等的ASOx。下文給出具體實例，但是這些實例并不表示限定可用于本發(fā)明的酶。
植物來源的ASOx有例如，黃瓜來源的ASOx(由Amano Enzyme Inc.或Toyobo Co.，Ltd.生產(chǎn))和南瓜來源的ASOx(由Roche Co.或ToyoboCo.，Ltd.生產(chǎn))微生物來源的ASOx有例如，頂孢霉屬(Acremonium)來源的ASOx(由Asahi Kasei公司生產(chǎn))和源于一種微生物的ASOx(由Amano Enzyme Inc.生產(chǎn))。
通過以下方法測定ASOx酶活性。
《測定ASOx酶活性的方法》<貯存底物溶液>
將176mg的L-抗壞血酸(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生產(chǎn))和37mg EDTA(由Daiichi Pure Chemicals Co.Ltd.生產(chǎn))溶解于100ml的1mM鹽酸中。
<混合反應試劑>
利用包含0.45mM EDTA的90mM磷酸氫二鉀-5mM磷酸二氫鈉緩沖液將上述貯存底物溶液稀釋20倍。
<步驟>
將1ml上述混合反應試劑置于一個小試管中30℃預熱5分鐘，然后加入0.10ml適當稀釋的酶溶液。攪拌混合物以起始反應。反應正好5分鐘后，加入3.0ml的0.2N鹽酸水溶液以終止反應。測定245nm波長下的吸光度(As)。對于空白實驗，將1ml上述反應溶液置于一個小試管中30℃預熱5分鐘，然后加入3.0ml的0.2N鹽酸水溶液以終止反應。加入0.10ml適當稀釋的酶溶液并對混合物進行攪拌以測定245nm波長下的吸光度(Ab)。從酶反應之后的吸光度(As)和空白實驗的吸光度(Ab)之間的差值(As-Ab)確定酶活性。30℃下一分鐘將1μmol抗壞血酸氧化成脫氫抗壞血酸的酶量被定義為1U。計算表達示如下所示。
活性(U/ml)＝[(As-Ab)/10.0]×[1/5]×[4.10/0.10]×[1/B]10.0在pH1.0的條件下抗壞血酸的245nm分子吸光系數(shù)(mM)。
5反應時間(min)4.10反應溶液總量(ml)0.10用于反應的酶樣品溶液的量B酶溶液的稀釋放大倍數(shù)。
可以使用任何濃度的ASOx，只要在此濃度下當?shù)鞍酌负虯SOx同時存在時可使用試劑將足夠量的抗壞血酸去除即可，例如通常為0.1-100U/ml，優(yōu)選1-50U/ml的濃度。
對于能夠與ASOx組合用于根據(jù)本發(fā)明精確測定糖化蛋白質(zhì)的不具有4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基基團的緩沖試劑，可使用任何能在ASOx與蛋白酶共存時使ASOx保持穩(wěn)定的緩沖試劑。除那些具有4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基的緩沖試劑如3-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPS)，2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)，和2-羥基-3-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPSO)之外的任何緩沖試劑都可使用。
其它優(yōu)選的緩沖試劑的實例包括N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)，N-(2-乙酰胺)亞氨二乙酸(ADA)，N，N-二(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)，N，N-二(2-羥乙基)甘氨酸(Bicine)，二(2-羥乙基)亞氨三(羥甲基)甲烷(Bis-Tris)，N-環(huán)己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)，N-環(huán)己基-2-羥基-3-氨基丙磺酸(CAPSO)，N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸(CHES)，3-[N，N-二(2-羥乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸(DIPSO)，2-嗎啉代乙磺酸(MES)，3-嗎啉代丙磺酸(MOPS)，2-羥基-3-嗎啉代丙磺酸(MOPSO)，哌嗪-1，4-二(2-乙磺酸)(PIPES)，哌嗪-1，4-二(2-羥基-3-丙磺酸)(POPSO)，N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)，2-羥基-N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)，N-三(羥甲基)甲基-2-氨基丙磺酸(TES)，N-[三(羥甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)，和三羥甲基氨基甲烷(Tris)。
最優(yōu)選的緩沖劑有例如，三羥甲基氨基甲烷(Tris)和哌嗪-1，4-二(2-羥基-3-丙磺酸)(POPSO)。
對于這些能夠與ASOx組合使用的緩沖試劑，可以以在蛋白酶存在時能保持ASOx穩(wěn)定并且不影響蛋白酶和ASOx的反應的任意濃度進行利用，例如，通常為1mM至1M，優(yōu)選5mM至500mM。
對于本發(fā)明用于精確測定糖化蛋白質(zhì)的清蛋白變性劑和/或具有S-S鍵的化合物，可使用任何一種使BCP對GA和NGA的反應性相同的化合物。
蛋白質(zhì)變性劑的實例有尿素，胍類化合物和陰離子表面活性劑如十二烷基硫酸鈉(SDS)，聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸鹽，聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽，和烷基苯磺酸鹽。這些蛋白質(zhì)變性劑既可以單獨使用也可以兩種或多種聯(lián)合使用。對于這些蛋白質(zhì)變性劑，可利用能使BCP等同地與GA和NGA反應的任意濃度，例如通常為0.01-10％，優(yōu)選0.05-5％。
優(yōu)選的具有S-S鍵的化合物的實例有6，6′-二硫代二煙酸，3，3′-二硫代二丙酸，2，2′-二硫代二安息香酸，4，4′-二硫代二嗎啉，2，2′-二羥基-6，6′-二萘二硫(DDD)，2，2′-二硫代吡啶(2-PDS)，4，4′-二硫代吡啶(4-PDS)，5，5′-二硫代二-(2-硝基安息香酸)(DTNB)，和2，2′-二硫代二-(5-硝基吡啶)。
對于具有S-S鍵的這些化合物，可利用能使BCP等同地與GA和NGA反應的任意濃度，例如，通常為1μM至10mM，優(yōu)選10μM至5mM。決不排除此范圍之外的濃度。
對于本發(fā)明用于精確測定糖化蛋白質(zhì)的蛋白酶穩(wěn)定劑，可利用在貯藏試劑時能夠抑制蛋白酶活性減少的任何化合物。特別優(yōu)選的是在液態(tài)試劑貯藏過程中能夠抑制蛋白酶活性減少的化合物。
優(yōu)選的穩(wěn)定劑的實例有，例如二甲基亞砜，醇類，水溶性鈣鹽，氯化鈉，季銨鹽，季銨鹽型陽離子表面活性劑。醇類的實例有乙醇，丙醇，乙二醇和甘油。季銨鹽及季銨鹽型陽離子表面活性劑的實例有十二烷基硫酸三乙醇胺，氯化十二烷基三甲基銨等。
這些蛋白酶穩(wěn)定劑可以以任何濃度進行使用，只要在試劑貯存過程中其能夠抑制蛋白酶活性減少即可，尤其是在液態(tài)試劑貯藏中能夠抑制蛋白酶活性減少的濃度。通常利用0.01-30％的濃度，優(yōu)選0.1-20％的濃度。不排除此范圍之外的濃度。
對于本發(fā)明用于精確測定糖化蛋白質(zhì)的至少與糖化氨基酸反應的酶的穩(wěn)定劑，可利用在試劑貯藏中能夠抑制此至少與糖化氨基酸反應的酶的活性減少的任何化合物。特別優(yōu)選的是在液態(tài)試劑貯藏中能夠抑制該酶活性減少的化合物。
優(yōu)選的此類穩(wěn)定劑有例如，糖醇，蔗糖，水溶性鎂鹽，水溶性鈣鹽，硫酸銨，氨基酸和肌氨酸。糖醇的實例有山梨糖醇，甘露醇，海藻糖和甘油。雖然所有氨基酸都顯示出強穩(wěn)定效果，但優(yōu)選的氨基酸是脯氨酸，谷氨酸，丙氨酸，纈氨酸，甘氨基，賴氨酸等。
這些至少與糖化氨基酸反應的酶的穩(wěn)定劑可以以任何濃度進行使用，只要在試劑貯藏中能夠抑制此至少與糖化氨基酸反應的酶的活性減少即可。特別優(yōu)選的是在液態(tài)試劑貯藏中能夠抑制該酶活性減少的濃度。穩(wěn)定劑如果是糖醇，蔗糖，氨基酸或肌氨酸，則通常使用0.01-30％的濃度，優(yōu)選0.1-20％的濃度。穩(wěn)定劑如果是水溶性鎂鹽，水溶性鈣鹽或硫酸銨，則使用1mM到1M的濃度，優(yōu)選10mM到500mM的濃度。不排除這些范圍外的濃度。
在制備用于測定糖化蛋白質(zhì)的本發(fā)明組合物時，可將蛋白水解試劑(包括蛋白酶)和用于測定所產(chǎn)生的糖化氨基酸或肽的糖化氨基酸檢測試劑適當組合以便使這些試劑可在同一反應容器中使用。這些試劑可以以液態(tài)產(chǎn)品，冰凍產(chǎn)品或冷凍干燥產(chǎn)品形式提供。
在制備用于本發(fā)明的蛋白水解試劑時，對pH、緩沖劑以及蛋白酶濃度進行確定以便使蛋白水解反應能夠有效進行。然后，適當?shù)刂苽渚哂星虻鞍捉M分選擇性的蛋白酶抑制劑、ASOx和蛋白酶穩(wěn)定劑并加到上述的有效濃度。
舉例來說，如果使用XXIV-型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))，由于蛋白酶在pH7-10附近顯示出強的蛋白水解活性所以可選擇在pH7-10反應。就緩沖液來說，可利用不具有4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基的緩沖劑的溶液，例如，在pH7.2-8.5范圍內(nèi)具有緩沖作用的POPSO緩沖液，POPSO的濃度可為1-100mM，優(yōu)選10-500mM。
可利用的蛋白酶濃度是能夠在實際應用的反應時間內(nèi)使樣品中的糖化蛋白質(zhì)充分分解的濃度，優(yōu)選100-500,000PU/ml，更優(yōu)選500-100,000PU/ml。
對于具有球蛋白組分選擇性的蛋白酶抑制劑、ASOx和蛋白酶穩(wěn)定劑的組合，例如可利用由0.01-20％并優(yōu)選0.05-10％的3-[(膽酰氨基丙基)二甲基銨]-1-丙磺酸作為球蛋白組分選擇性蛋白酶抑制劑、0.1-100U/ml并優(yōu)選1-50U/ml的南瓜抗壞血酸氧化酶(由Toyobo Co.Ltd.生產(chǎn))、以及0.01-30％，優(yōu)選0.1-20％的二甲基亞砜作為蛋白酶穩(wěn)定劑所形成的組合。
為了配制用于本發(fā)明測定糖化氨基酸的試劑，可從確保所利用的至少與糖化氨基酸反應的酶能進行有效反應的最適pH出發(fā)選擇適當?shù)膒H，并確定與糖化氨基酸反應的酶量，然后加入至少與糖化氨基酸反應的酶的穩(wěn)定劑。
舉例來說，如果利用R-FOD或R-FOD-II(由Asahi Kasei公司生產(chǎn))，由于這些蛋白酶在pH6.5-10的寬范圍內(nèi)顯示出其最大活性的50％或更多，所以可選在pH6.5-10進行反應。酶的使用濃度可為能夠充分檢測出所用反應溶液中的糖化氨基酸的濃度，優(yōu)選0.5-200U/ml的濃度，并更優(yōu)選1-50U/ml的濃度。
舉例來說，谷氨酸可在0.01-30％并優(yōu)選0.1-20％濃度下用作至少與糖化氨基酸反應的酶的穩(wěn)定劑。
在配制包含至少與糖化氨基酸反應的酶(作為第一試劑)和蛋白酶(作為第二試劑)的組合物時，可利用任何條件，但第一試劑中的條件如pH，鹽濃度等需使蛋白酶和至少與糖化氨基酸反應的酶可顯示出活性，而第二試劑中的條件應適宜蛋白酶的貯藏。
例如，當利用R-FOD和XXIV型蛋白酶時，由于這些酶具有的特定活性pH范圍分別為6.5-10和7-10，所以第一試劑選擇pH7-10，并選擇具有相對高濃度如20-1,000mM的緩沖劑。另一方面，由于此蛋白酶在pH7或更低時是穩(wěn)定的，因此第二試劑選擇的pH是7或更低，同時選擇濃度相對低于第一試劑所用濃度的緩沖劑，如在1-50mM范圍。此外，還優(yōu)選加入蛋白酶穩(wěn)定劑，如大約1-50％二甲基亞砜。在此情況下，如果第一試劑的使用量大于第二試劑，例如第一試劑對第二試劑的比率為4∶1，則可將較高濃度的穩(wěn)定劑加到第二試劑中，并且對于其它條件如pH，第二個試劑可選用大幅度偏離第一試劑的條件的條件。
在配制根據(jù)本發(fā)明測定糖化蛋白質(zhì)的酶反應組合物時，可適當?shù)剡x擇和添加表面活性劑，鹽類，緩沖劑，pH調(diào)節(jié)劑，防腐劑等。
作為表面活性劑，如聚氧乙烯烷基醚，聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯，聚乙烯醇等可加入0.01-10％，優(yōu)選0.05-5％的量。作為鹽類，如氯化鋰，氯化鈉，氯化鉀，氯化錳，氯化鈷，氯化鋅，氯化鈣等可加入1mM到5M，優(yōu)選10mM到1M的量。各種緩沖液如Tris-HCl緩沖液，甘氨酸-NaOH緩沖液，磷酸緩沖液，Good緩沖液等可加入10mM到2M，優(yōu)選20mM到1M的量。各種防腐劑如疊氮化鈉可適當?shù)丶尤?.01-10％，優(yōu)選0.05-1％的量。
在利用本發(fā)明方法測定糖化蛋白質(zhì)時，將0.001-0.5ml的樣品加到用于測定糖化蛋白質(zhì)的本發(fā)明組合物中并在37℃下進行反應。如果使用速率測定技術，可直接或間接地利用上述方法在反應開始后兩個指定時間點間的幾分鐘到幾十分鐘的一個時段內(nèi)，例如在反應開始三分鐘后和四分鐘后之間的一分鐘，或在反應開始三分鐘后和八分鐘后之間的五分鐘內(nèi)對輔酶、溶解氧、過氧化氫或其它反應產(chǎn)物的量的變化進行測定。如果使用終點測定技術，可利用同種方式在反應開始后某個時段內(nèi)對輔酶、溶解氧、過氧化氫或其它反應產(chǎn)物的量的變化進行測定。在此時，可通過將吸光度等的變化與所測定的具已知糖化蛋白質(zhì)濃度的樣品的值進行比較，確定樣品中糖化蛋白質(zhì)的量。
可以對應用于本發(fā)明的能至少與糖化氨基酸反應的酶所進行的反應進行檢測，舉例來說，如果使用脫氫酶，可直接測定輔酶量的變化或通過利用電子載體如各種硫辛酰胺脫氫酶或吩嗪硫酸甲酯及還原型顯色劑如以硝基四唑，WST-1或WST-8為代表的四唑鹽(由Dojindo實驗室生產(chǎn))間接測定所形成的還原性輔酶。還可利用其它已知的直接或間接測定方法。
如果使用氧化酶，舉例來說，優(yōu)選測定氧消耗量或反應產(chǎn)物的量。例如，如果使用R-FOD，產(chǎn)生過氧化氫和葡糖醛酮作為反應產(chǎn)物?？赏ㄟ^已知方法對過氧化氫和葡糖醛酮進行直接或間接地分析。
過氧化氫量可以，例如，通過利用過氧化物酶等產(chǎn)生顯色物質(zhì)并測定顏色、發(fā)射光或熒光強度，通過電化學技術，或通過利用過氧化氫酶從醇產(chǎn)生醛并測定所產(chǎn)生的醛的量進行確定。
對于從過氧化氫產(chǎn)生顯色物質(zhì)來說，可利用能夠在過氧化物酶存在時通過偶合劑如4-AA或3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)和生色原如苯酚的氧化縮合產(chǎn)生顯色物質(zhì)的Trinder試劑，能夠在過氧化物酶存在時直接被氧化并產(chǎn)生顏色的Leuko-型試劑，等。
作為Trinder試劑的生色原，可利用苯酚衍生物，苯胺衍生物，甲苯胺衍生物等。具體來說，有N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-間-甲苯胺(TOOS)，N，N-二(4-磺丙基)-3-甲基苯胺二鈉(TODB)(二者皆由Dojindo實驗室生產(chǎn))，等。
Leuko-型試劑的具體實例有N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-二(二甲基氨基)-聯(lián)苯胺(DA64)，10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-二(二甲基氨基)吩噻嗪(DA67)(二者皆由Wako Pure chemical Industries有限公司生產(chǎn))，等。
經(jīng)氧化發(fā)射熒光的化合物如高香草酸和4-羥基苯乙酸可用于熒光方法。對于化學發(fā)光方法來說，魯米諾、光澤精，異魯米諾等可用作催化劑。
如果利用電極測定過氧化氫，對所用電極沒有特殊限制只要電極是由能與過氧化氫交換電子的材料制成即可，例如鉑，金和銀。可利用常規(guī)電極方法如電流測定法，電勢測定法和電量分析法?？梢栽陔姌O和氧化酶或底物之間提供電子載體以便測定所產(chǎn)生的氧化或還原電流或電量。任何可表現(xiàn)出電子轉移功能的材料都可作為電子載體，舉例來說有二茂鐵衍生物和醌衍生物。還可以在電極和經(jīng)氧化反應產(chǎn)生的過氧化氫之間提供電子載體以便測定所產(chǎn)生的氧化或還原電流或電量。
當糖化蛋白是糖化清蛋白并且必須精確測定出糖化清蛋白的量時，任何含有蛋白質(zhì)變性劑和/或具有S-S鍵化合物和溴甲酚紫的清蛋白檢測試劑都能用于本發(fā)明，只要此試劑在GA和NGA之間不產(chǎn)生偏差。
例如，如果十二烷基硫酸鈉和5，5′-二硫代二(2-硝基安息香酸)被用作蛋白質(zhì)變性劑和/或具有S-S鍵的化合物，則使用不影響B(tài)PC顯色的低濃度如1-20mM的緩沖液，其中十二烷基硫酸鈉所用的濃度為0.01-10％，優(yōu)選0.05-5％，5，5′-二硫代二(2-硝基安息香酸)所用的濃度為1μM到10mM，優(yōu)選10μM到5mM。由于BCP在高于中性的pH明顯地發(fā)生顯色，所以在pH4.5-7.5下利用BCP。
在利用本發(fā)明的方法測定清蛋白中，將0.001-0.5ml的樣品加到用于測定清蛋白的本發(fā)明組合物中并在37℃進行反應。在反應開始后的一段指定時間內(nèi)顯色物質(zhì)的量可通過一點分析(one point assay)的方法進行測定。由于清蛋白-BCP在600nm附近具有最大吸光度，所以測定550-630nm附近的吸光度。在此情況下，樣品中清蛋白的量還可通過與使用具已知清蛋白濃度的樣品測定的吸光度和空白(水)的吸光度進行比較來確定。
任何含有至少糖化蛋白的樣品都可作為本發(fā)明的檢測對象。優(yōu)選的樣品包括血液組分如血清，血漿，血細胞，和全血。此外，分離出的紅細胞也可用作優(yōu)選樣品，因為根據(jù)不同分離條件，分離出的紅細胞樣品可能含有能影響檢測結果的球蛋白組分。
可利用本發(fā)明測定糖化蛋白的組合物和方法進行測定的糖化蛋白包括GA和GHb，但不限于這些蛋白，任何糖化蛋白都可進行測定。
附圖簡述

圖1表示的是本發(fā)明實施例4中HSA底物溶液(4g/dl)，γ-球蛋白底物溶液，和球蛋白IV底物溶液的測量曲線和再現(xiàn)性。
圖2表示的是本發(fā)明實施例5中Hb底物溶液(4g/dl)，γ-球蛋白底物溶液，和球蛋白IV底物溶液的測量曲線和再現(xiàn)性。
圖3表示的是經(jīng)本發(fā)明實施例6中的實驗得到的糖化清蛋白的測量曲線。
圖4表示的是本發(fā)明實施例9中不同類型緩沖劑對用于測定糖化蛋白質(zhì)的組合物中的抗壞血酸氧化酶的穩(wěn)定作用。
圖5表示的是本發(fā)明實施例11中不同類型穩(wěn)定劑對蛋白酶的穩(wěn)定作用。
圖6表示的是本發(fā)明實施例12中不同類型穩(wěn)定劑對至少與糖化氨基酸反應的酶的穩(wěn)定作用。
圖7表示本發(fā)明實施例20中質(zhì)粒pcmFOD1到pcmFOD5的共有結構。
圖8表示的是本發(fā)明實施例21中對被突變果糖基氨基酸氧化酶除去糖化賴氨酸的反應液和未進行去除處理的反應液中的糖化纈氨酸濃度進行測量時在波長555nm下的吸光度測量結果。
圖9表示的是本發(fā)明實施例22中酶學方法和HPLC方法在糖化清蛋白測量結果上的相關性。
圖10表示的是本發(fā)明實施例23中糖化蛋白測定試劑的反應曲線。
實施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明將通過下列實施例進行闡述，但不意謂限制本發(fā)明。
實施例1為篩選出不與球蛋白組分反應的蛋白酶，利用R-FOD(由Asahi Kasei公司生產(chǎn))對由蛋白酶與清蛋白、球蛋白組分以及血紅蛋白反應所產(chǎn)生的糖化氨基酸或糖化肽進行測定。
<底物溶液>
1、HSA底物溶液；人清蛋白；基本無球蛋白；25mg/ml，GA％＝31.9％，果糖胺(FRA)值＝256μmol/l(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))；底物溶液中的清蛋白濃度利用清蛋白檢測試劑盒(清蛋白II-HA檢測盒Wako；由Wako Pure Chemical Industries有限公司生產(chǎn))進行測定。GA％利用糖化清蛋白分析儀(GAA-2000，由ARKRAY公司生產(chǎn))進行測定。
2、G-II和III底物溶液，F(xiàn)RA值＝48μmol/l[人球蛋白Cohn級分II和III；16.9mg/ml(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))]。
3、G-IV底物溶液，F(xiàn)RA值＝26μmol/l[人球蛋白Cohn級分IV；6mg/ml(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))]。
4、G-I底物溶液，F(xiàn)RA值＝77μmol/l[Glovenin I免疫球蛋白制品(由Takeda Chemical Industries有限公司生產(chǎn))]。
5、Hb底物溶液人血紅蛋白；55mg/ml，糖化血紅蛋白比率HbAlc＝4.5％[由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)，HbAlc值利用糖化血紅蛋白分析儀(Hi-AUTO A1C HA-8150，由ARKRAY公司生產(chǎn))測定]。
底物溶液的果糖胺值利用果糖胺分析盒(Autowako果糖胺，由WakoPure Chemical Industries有限公司生產(chǎn))進行測定。
<制備蛋白酶反應溶液>
將200μl非Hb的底物溶液、40μl的100mg/ml蛋白酶溶液(如果不能制備出濃度100mg/ml的溶液，溶液濃度盡可能接近100mg/ml，或者如果其是液體則使用原樣濃度)和10μl的1M Tris緩沖液(pH8)充分混合并在37℃反應30分鐘。反應溶液經(jīng)10,000NMWL膜(Ultrafree MC，由Millipore公司生產(chǎn))進行過濾。將濾液作為蛋白酶反應樣品。利用蒸餾水替代底物執(zhí)行同樣操作以制備空白樣品。
對Hb底物溶液來說，150μl的底物溶液、60μl的200mg/ml蛋白酶溶液(如果不能制備出濃度200mg/ml的溶液，溶液濃度盡可能接近200mg/ml，或者如果其是液體則使用原樣濃度)和5μl的1M Tris緩沖液(pH8)充分混合并在37℃反應60分鐘。反應溶液經(jīng)10,000NMWL膜(Ultrafree MC，由Millipore公司生產(chǎn))進行過濾。將濾液作為蛋白酶反應樣品。利用蒸餾水替代底物執(zhí)行同樣操作以制備空白樣品。
<測定蛋白酶反應樣品中的糖化氨基酸和糖化肽>
<反應溶液組成>
50mM Tris緩沖液(pH8.0)0.02％4-AA(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生產(chǎn))0.02％N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-間-甲苯胺(TOOS)(由Dojindo實驗室生產(chǎn))2U/ml R-FOD(由Asahi Kasei公司生產(chǎn))5U/ml POD(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))<反應步驟>
將300μl上述用于測定糖化氨基酸的反應溶液加到測定池中并在37℃保溫3分鐘。測定555nm的吸光度(A0)。然后將30μl蛋白酶反應樣品加進測定池并在37℃保溫5分鐘。測定555nm的吸光度(A1)。利用空白樣品替代蛋白酶反應樣品對其執(zhí)行同樣操作。測定吸光度(A0空白和A1空白)。蛋白酶與糖化蛋白質(zhì)的反應由下列吸光度變化指示。
ΔA＝(A1-A0)-(A1空白-A0空白)在pH8.0典型蛋白酶與清蛋白、球蛋白和血紅蛋白的反應性(ΔA)如表1所示。
表1各種蛋白酶作用于各種蛋白的活性(單位mAb)
在球蛋白組分中，表1記述的只是G-I底物溶液的結果，這是因為所有蛋白酶與G-IV底物溶液中的糖化蛋白質(zhì)沒有反應或只有極小反應，并且G-II和G-III底物溶液的測定值與G-I底物溶液的測定值幾乎相同。從表1中可明確看出，源自曲霉屬的蛋白酶和XIV型蛋白酶對球蛋白組分中的糖化球蛋白顯示出良好的反應性。
然而，能夠與清蛋白中的GA和血紅蛋白中的GHb反應的內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶對球蛋白組分中的糖化球蛋白也具有反應性。這些結果表明如果對血清或血漿中的GA或全血或血細胞中的GHb進行測定，僅選擇蛋白酶的類型不可避免球蛋白組分的影響。
實施例2<球蛋白組分選擇性蛋白酶抑制劑的篩選>
利用與HSA底物溶液具有高反應性的XXIV型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))，在HSA底物溶液基礎上篩選出能夠減少蛋白酶與上述球蛋白底物溶液的反應的組分。
<反應溶液組成>
R-1蛋白水解試劑150mM Tricine緩沖液(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生產(chǎn))pH8.5，2,500U/ml XXIV型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))+球蛋白組分選擇性蛋白酶抑制劑(脫氧膽酸，脫氧膽酰胺，膽酰胺，季銨鹽，或季銨鹽型陽離子表面活性劑1％，伴刀凝集素A0.21mg/ml，甜菜堿0.1％，辛基葡糖苷1％，由Dojindo實驗室生產(chǎn))R-2糖化氨基酸檢測試劑150mM Tricine緩沖液(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生產(chǎn))pH8.5，0.12％4-AA(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生產(chǎn))0.08％TOOS(由Doiindo實驗室生產(chǎn))24U/ml R-FOD(由Asahi Kasei公司生產(chǎn))
20U/ml POD(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))在R-1蛋白水解試劑中，作為脫氧膽酰胺，利用雙葡糖酰胺基丙基脫氧膽酰胺；作為膽酰胺，利用3-[(膽酰胺基丙基)二甲基銨]-1-丙磺酸，3-[(膽酰胺基丙基)二甲基銨]-2-羥基-1-丙磺酸，或雙葡糖酰胺基丙基膽酰胺；作為季銨鹽，利用氯化芐基三乙基銨或氯化芐基三正丁基銨；作為季銨鹽型陽離子表面活性劑，利用氯化十二烷基三甲基銨或十二烷基二甲基胺氧化物。
<底物溶液>
1、HSA底物溶液；人清蛋白40mg/ml，GA％＝10.5％(由WakoPure Chemical Industries有限公司生產(chǎn)，底物溶液中的清蛋白濃度利用清蛋白檢測試劑盒(清蛋白II-HA檢測盒Wako；由Wako Pure ChemicalIndustries有限公司生產(chǎn))進行測定。GA％利用糖化清蛋白分析儀(GAA-2000，由ARKRAY公司生產(chǎn))進行測定。
2、γ-球蛋白添加底物溶液，將17.0mg/ml的γ-球蛋白[人γ-球蛋白(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))，果糖胺值＝34μM]添加到上述HSA底物溶液中。
<反應步驟>
將8μl的每種底物溶液(HSA底物溶液，G-I底物溶液)加到在37℃下保溫的240μl R-1中。在37℃下引發(fā)反應并在正好反應5分鐘之后加入80μl的R-2。在添加R-2之前和之后測定546nm波長下的吸光度。兩個測量結果的差作為吸光度變化。利用水替代底物執(zhí)行同樣操作以制備空白樣品。此外，以未添加球蛋白選擇性蛋白酶抑制劑的反應溶液作為對照。
ΔA(HSA)的計算是從HSA底物溶液所得的吸光度變化中減去空白樣品的吸光度變化。ΔA(+γ-球蛋白)的計算是從添加γ-球蛋白的底物溶液所得的吸光度變化中減去空白樣品的吸光度變化。
γ-球蛋白添加的效應＝(ΔA(+γ-球蛋白)-ΔA(HSA))/ΔA(HSA)×100(％)比較各種候選化合物存在和不存在(對照)時所得的值。結果如表2所示。
表2篩選球蛋白選擇性蛋白酶抑制劑
從表2可看出，在脫氧膽酸，脫氧膽酰胺，膽酰胺，季銨鹽，或季銨鹽型陽離子表面活性劑，伴刀豆凝集素A，辛基葡糖苷，甜菜堿中鑒定到對蛋白酶與球蛋白反應的抑制作用，證實了如果利用這些球蛋白組分選擇性蛋白酶抑制劑和蛋白酶，則可主要地對球蛋白以外的蛋白質(zhì)進行消化。
利用Hb底物溶液替代HSA底物溶液執(zhí)行同樣的測量，前提是如果利用Hb底物溶液，則在與R-1反應之后利用三氯乙酸除去蛋白質(zhì)，然后對殘余物進行中和并加入R-2。在利用Hb底物溶液的情況下，同樣證實脫氧膽酸，脫氧膽酰胺，膽酰胺，季銨鹽或季銨鹽型陽離子表面活性劑，伴刀豆凝集素A，甜菜堿具有抑制蛋白酶與球蛋白反應的作用。
實施例3<3-[(膽酰胺基丙基)二甲基銨]-1-丙磺酸的球蛋白組分選擇性蛋白酶抑制作用>
利用各種蛋白酶驗證了3-[(膽酰胺基丙基)二甲基銨]-1-丙磺酸的球蛋白組分選擇性蛋白酶抑制作用。
R-1蛋白水解試劑150mM Tricine緩沖液(由Wako Pure Chemical Industrials有限公司生產(chǎn))pH8.5，2,500U/ml蛋白酶*1％3-[(膽酰胺基丙基)二甲基銨]-1-丙磺酸*Orientase 22BF(由HBI酶公司生產(chǎn))，VIII型蛋白酶，XIV型蛋白酶，和XXVII型蛋白酶(以上由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))用作蛋白酶。
R-2糖化氨基酸檢測試劑同實施例2。
<底物溶液>
同實施例2。
<反應步驟>
利用如實施例2中的相同方式比較3-[(膽酰胺基丙基)二甲基銨]-1-丙磺酸存在和不存在(對照)時γ-球蛋白添加的效應。結果如表3所示。在判斷一欄中，添加γ-球蛋白的效應被明顯減少的情況以○來表示。
表33-[(膽酰胺基丙基)二甲基銨]-1-丙磺酸的球蛋白組分選擇性蛋白酶抑制作用
從表3可看出，有3-[(膽酰胺基丙基)二甲基銨]-1-丙磺酸存在時，Orientase 22BF，VIII型蛋白酶，XIV型蛋白酶，和XXVII型蛋白酶減少了與γ-球蛋白底物的蛋白酶反應，但所有這些蛋白酶都保持了與HSA底物的反應性。這些結果說明不論蛋白酶是何類型，本發(fā)明的球蛋白組分選擇性蛋白酶抑制劑都是有效的。
此外，甚至在測定GHb時，利用本發(fā)明也可以消除球蛋白組分的影響。
實施例4<糖化清蛋白的稀釋線性>
R-1蛋白水解試劑150mM Tricine緩沖液(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生產(chǎn))pH8.5，2,500U/ml XXVII型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))1％3-[(膽酰胺基丙基)二甲基銨]-2-羥基-1-丙磺酸(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))R-2糖化氨基酸檢測試劑同實施例2。
<底物溶液>
1、HSA底物溶液同實施例1，但使用的溶液濃度為4.0g/dl。
2、γ-球蛋白底物溶液同實施例2。
3、球蛋白IV底物溶液同實施例1。
<步驟>
將HSA底物溶液(4g/dl)，γ-球蛋白(γG)底物溶液(1.7g/dl)，以及球蛋白IV(GIV)底物溶液(1.7g/dl)進行稀釋放大0.0、0.5、1.0、1.5和2.0倍以驗證稀釋線性。接著執(zhí)行與實施例3相同的操作，但將HSA的1.0倍稀釋樣品測定10次以計算CV值。結果如圖1所示。
從圖1可看出，改變γ-球蛋白底物溶液或球蛋白IV(GIV)底物溶液的濃度，吸光度沒有變化。另一方面，HSA底物溶液相應于濃度顯示出良好的線性，這表明對糖化清蛋白的測定可以實質(zhì)上不受球蛋白組分的影響。已經(jīng)用HSA的1.0倍濃度證實CV值＝0.9％具有極好的重復性，這表明，如果利用本發(fā)明的測定方法，在10分鐘反應時間內(nèi)能夠以良好的靈敏性和極好的重復性對糖化清蛋白進行選擇性地測定。
實施例5<糖化血紅蛋白的稀釋線性>
R-1蛋白水解試劑77mM Tris緩沖液(pH8.0)2,500U/ml XIV型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))1％3-[(膽酰胺基丙基)-二甲基銨]-2-羥基-1-丙磺酸(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))R-2糖化氨基酸檢測試劑同實施例2。
<底物溶液>
利用與實施例1中相同的Hb底物溶液和與實施例4中相同的γ-球蛋白底物溶液和球蛋白IV底物溶液。
<步驟>
制備Hb底物溶液(4g/dl)，γ-球蛋白(γG)底物溶液(1.7g/dl)，以及球蛋白IV(GIV)底物溶液(1.7g/dl)的0.0、0.5、1.0、1.5和2.0倍濃度樣品以驗證稀釋線性。接著執(zhí)行與實施例1相同的操作，但將Hb的1.0倍稀釋樣品測定10次以計算CV值。結果如圖2所示。
從圖2可看出，改變γ-球蛋白底物溶液或球蛋白IV(GIV)底物溶液的濃度，吸光度沒有變化。另一方面，Hb底物溶液相應于濃度顯示出良好的線性，這表明對糖化血紅蛋白的測定實質(zhì)上不受球蛋白組分的影響。已經(jīng)用HSA的1.0倍濃度證實CV值＝2.0％具有極好的重復性，這表明，如果利用本發(fā)明的測定方法，在10分鐘反應時間內(nèi)能夠以良好的靈敏性和極好的重復性對糖化血紅蛋白進行選擇性地測定。
實施例6<糖化清蛋白的線性>
R-1蛋白水解試劑同實施例4。
R-2糖化氨基酸檢測試劑同實施例4。
<底物溶液>
血清A)*糖尿病患者的血清GA％＝32.9％；清蛋白濃度4.3g/dl血清B)*健康人的血清GA％＝16.4％；清蛋白濃度4.1g/dl*將上述血清A)和血清B)以10∶0，8∶2，6∶4，4∶6，2∶8和0∶10的比率進行混合得到混合樣品。
<步驟>
同實施例3。
結果如圖3所示。
從圖3可看出，利用具有相同清蛋白濃度和不同糖化清蛋白比率的樣品獲得極好的線性。因此，證明本發(fā)明用于測定糖化蛋白質(zhì)的方法能夠實際地定量分析血清和血漿中的糖化清蛋白。此外，由于證明用溶解紅細胞制備的血紅蛋白底物溶液替代血清具有相同線性，所以證明本發(fā)明用于測定糖化蛋白質(zhì)的方法也能夠定量分析糖化血紅蛋白。
實施例7<糖化清蛋白的HPLC和酶學方法(本發(fā)明)之間的相關性>
R-1蛋白水解試劑同實施例4。
R-2糖化氨基酸檢測試劑同實施例4。
<底物溶液>
糖尿病患者的血清 14個樣品健康人的血清 25個樣品<步驟>
執(zhí)行與實施例2相同的步驟。
本發(fā)明的酶學方法和已知的HPLC法之間的相關性利用14個糖尿病患者血清樣品進行確定。利用糖化清蛋白分析儀(GAA-2000，由ARKRAY公司生產(chǎn))通過HPLC法測定糖化清蛋白的比率。由本發(fā)明方法得到的吸光度變化與此糖化清蛋白比率具有相當高的相關性(相關系數(shù)r＝0.991)，這證明本發(fā)明的測定方法能夠精確測定糖化清蛋白。
實施例8<緩沖劑的類型對抗壞血酸氧化酶的穩(wěn)定作用>
<反應溶液組成>
150mM各種緩沖液(pH8.0)2,500U/ml XXIV型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))或鏈霉蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))10U/ml抗壞血酸氧化酶(ASO-311，由Toyobo Co.，Ltd.生產(chǎn))或熱穩(wěn)定型抗壞血酸氧化酶(ASO-312，由Toyobo Co.，Ltd.生產(chǎn))R-1作為蛋白水解試劑中的緩沖劑，利用3-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPS)，2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)，2-羥基-3-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPSO)，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，哌嗪-1，4-二(2-羥基-3-丙磺酸)(POPSO)(上述化合物由Dojindo實驗室生產(chǎn))和磷酸(由Wako Pure Chemical Industrials有限公司生產(chǎn))。
<步驟>
利用各種緩沖劑制備上述反應溶液。測定抗壞血酸氧化酶活性后，將每種溶液的一部分用作對照。利用上述《測定抗壞血酸氧化酶(ASOx)活性的方法》進行活性測量。將剩余反應溶液在室溫下貯存2天，再以同樣的方法測量活性。計算在室溫下貯存2天后的活性與對照活性的比例以比較抗壞血酸氧化酶的穩(wěn)定性。結果如表4所示。
表4緩沖劑類型對抗壞血酸氧化酶的穩(wěn)定作用
從表4可看出，蛋白酶存在時抗壞血酸氧化酶明顯在利用不具4-(2-羥乙基)-l-哌嗪基的三羥甲基氨基甲烷(Tris)，哌嗪-1，4-二(2-羥基-3-丙磺酸)(POPSO)或磷酸作為緩沖劑的情況下比在利用具4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基的3-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPS)，2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)或2-羥基-3-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPSO)作為緩沖劑的情況下更穩(wěn)定。
而且明顯地，不論抗壞血酸氧化酶和蛋白酶為何種類型，都證實了具有同樣的作用。
實施例9<用于測定糖化蛋白質(zhì)的組合物中緩沖劑類型對抗壞血酸氧化酶的穩(wěn)定作用>
<反應溶液組成>
R-1蛋白水解試劑150mM各種緩沖液(pH8.0)2,500U/ml XXIV型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))2.0mM 4-氨基安替比林(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生產(chǎn))10U/ml抗壞血酸氧化酶(由Toyobo Co.，Ltd.生產(chǎn))R-2糖化氨基酸檢測試劑150mM HEPES緩沖液(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生產(chǎn))pH7.56.0mM TOOS(由Dojindo實驗室生產(chǎn))24U/ml R-FOD(由Asahi Kasei公司生產(chǎn))20U/ml POD(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))EPPS，HEPES，HEPPSO，Tris和POPSO用作R-1蛋白水解試劑中的緩沖劑。
<對照底物溶液和抗壞血酸添加底物溶液>
抗壞血酸添加底物溶液通過將1體積的抗壞血酸(1g/dl)(由KokusanChemical Co.Ltd.生產(chǎn))加到9體積的人類庫(pool)血清中進行制備。由添加蒸餾水替代抗壞血酸所制備的溶液作為對照底物溶液。
<反應步驟>
將8μl的對照底物溶液或抗壞血酸添加底物溶液加到240μl的37℃保溫的R-1中。在37℃引發(fā)反應并在正好5分鐘之后加入80μl的R-2。在添加R-2之前和添加R-2之后5分鐘測定555nm的吸光度。ΔA0的計算是通過從對照底物溶液和抗壞血酸添加底物溶液吸光度測量所得的吸光度變化中減去利用蒸餾水替代底物溶液的空白樣品所得的吸光度變化來進行。將同樣R-1反應溶液在室溫下貯存24小時，之后以同樣方法測定吸光度計算出ΔA24。將從對照底物溶液所得的吸光度變化設定為100，計算從抗壞血酸添加底物溶液所得的ΔA0和ΔA24的比例。結果如圖4所示。
由于抗壞血酸對測量系統(tǒng)具有顯著地負面影響，如果利用100mg/dl的濃度，則將清除反應省略就不能觀察到糖化蛋白質(zhì)的信號。從圖4可看出，利用不含4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基的Tris或POPSO的糖化蛋白質(zhì)檢測系統(tǒng)在室溫下貯存24小時之后，其在抗壞血酸去除能力上沒有變化。另一方面，利用含4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基的EPPS，HEPES或HEPPSO作為緩沖劑的系統(tǒng)在室溫下貯存24小時之后，幾乎沒有抗壞血酸去除能力。根據(jù)上述結果，發(fā)現(xiàn)在蛋白酶和抗壞血酸氧化酶共同存在的糖化蛋白質(zhì)檢測試劑中，抗壞血酸氧化酶在利用不具4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基的緩沖劑的系統(tǒng)中比在利用具4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基的緩沖劑的檢測系統(tǒng)中更穩(wěn)定。
此外，上述結果明顯地證明本發(fā)明可用于測定糖化清蛋白、果糖胺和糖化血紅蛋白。
實施例10<溴甲酚紫對糖化清蛋白和非糖化清蛋白的反應性差異，及蛋白質(zhì)變性劑和/或具S-S鍵的化合物的作用>
<反應溶液組成>
R-1預處理試劑
10mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)+各種濃度的蛋白質(zhì)變性劑和/或具S-S鍵的化合物；加入蒸餾水作為對照R-2清蛋白顯色劑200mM琥珀酸緩沖液(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生產(chǎn))pH5.50.15mM溴甲酚紫(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生產(chǎn))0.3％Tx-100(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生產(chǎn))下列化合物1)-9)用作R-1預處理試劑中的蛋白質(zhì)變性劑和/或具S-S鍵的化合物。
1)6，6′-二硫代二煙酸100mM2)3，3′-二硫代二丙酸100mM3)2，2′-二硫代二安息香酸100mM4)4，4′-二硫代二嗎啉100mM5)DTNB(50mM)6)DDD(33mM)7)2-PDS(25mM)8)4-PDS(50mM)9)SDS(0.3％)1)-5)由Wako Pure Chemical Industries有限公司生產(chǎn)6)-9)由Dojindo實驗室生產(chǎn)<樣品>
將糖化清蛋白，非糖化清蛋白，健康人血清和患者血清用作樣品，并將蒸餾水作為空白樣。糖化清蛋白和非糖化清蛋白是從人血清得到，通過已知方法利用硼酸-固定化樹脂進行純化。
<反應步驟>
將2μl樣品加入到160μl在37℃保溫的預處理試劑中。在37℃引發(fā)反應并在正好5分鐘之后加入160μl的清蛋白顯色劑。在添加清蛋白顯色劑前和添加清蛋白顯色劑之后5分鐘測量600nm的吸光度。標準曲線利用蒸餾水和具有已知清蛋白濃度的樣品替代上述樣品進行制作。通過免疫方法以膠乳試劑(LX試劑，Alb-II，由Eiken Chemical Co.Ltd生產(chǎn))作為對照對樣品分別進行測定。結果如表5所示。
表5
表5(續(xù))
從表5可看出，在BCP法中未進行預處理而測定的針對NGA的值出乎意料地低。同樣，在含少量NGA的患者樣品中免疫法和BCP法的偏差小于在含大量NGA的健康人樣品中的免疫法和BCP法的偏差。通過蛋白質(zhì)變性劑和/或具S-S鍵的化合物的預處理，與免疫法的偏差明顯減少。其中，2，2′-二硫代二安息香酸和4，4′-二硫代二嗎啉，DDD，2-PDS，4-PDS，DTNB以及十二烷基硫酸鈉的作用尤其顯著。結果，證明如果在測定糖化清蛋白的比率時樣品以蛋白質(zhì)變性劑和/或具S-S鍵的化合物進行預處理，并且在預處理同時和之后進行BCP反應，則可消除由NGA引起的負面誤差，確保糖化清蛋白比率的精確測定。
實施例11<蛋白酶的穩(wěn)定>
<反應溶液組成>
R-1蛋白水解試劑150mM Tris-HCl緩沖液(pH8.5)5,000PU/ml XXIV型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))8mM 4-氨基安替比林(由Dojindo實驗室生產(chǎn))15U/ml過氧化物酶1.0％3-[(膽酰胺基丙基)-二甲基銨]-2-羥基-1-丙磺酸(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))+各種濃度的蛋白酶穩(wěn)定劑(加入蒸餾水作為對照)R-2糖化氨基酸檢測試劑150mM Tris-HCl緩沖液(pH8.5)24U/ml R-FOD-II(由Asahi Kasei公司生產(chǎn))12mM TOOS(由Dojindo實驗室生產(chǎn))下列化合物1)-7)用作預處理試劑中的蛋白酶穩(wěn)定劑。
1)0.5mM氯化鎂2)10mM 氯化鈣3)100mM氯化鈉4)0.1％乙二醇(EtGly)5)10％ 二甲基亞砜(DMSO)6)1％ 乙醇(EtOH)7)0.1％十二烷基硫酸三乙醇胺(TEALS)1)-7)由Wako Pure Chemical Industries有限公司生產(chǎn)<樣品>
5g/dl HSA(LOT38H7601；由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))<反應步驟>
將8μl樣品加入到240μl在37℃保溫的蛋白水解試劑中。在37℃引發(fā)反應并在正好5分鐘之后加入80μl的糖化氨基酸檢測試劑。在添加糖化氨基酸檢測試劑前和添加糖化氨基酸檢測試劑之后5分鐘測量546nm的吸光度。ΔA0的計算是通過從底物溶液吸光度測量所得的吸光度變化中減去利用蒸餾水替代底物溶液的空白樣品所得的吸光度變化來進行。將同樣反應溶液蛋白水解試劑在37℃下貯存24小時，并以同樣方法測定吸光度。根據(jù)吸光度測量結果計算出ΔA24。對利用含穩(wěn)定劑的試劑的實驗到利用不含穩(wěn)定劑的試劑的實驗，計算出相對靈敏度，其中將利用不含穩(wěn)定劑并未經(jīng)貯存的試劑時所測得的ΔA0設定為100％。結果如圖5所示。
從圖5可看出，如果不使用穩(wěn)定劑則相對靈敏度減少到60％，這表明蛋白水解試劑具有穩(wěn)定作用。在添加穩(wěn)定劑的實驗中，觀察到添加氯化鈣，氯化鈉，DMSO，EtOH或TEALS的穩(wěn)定作用。其中氯化鈣和DMSO的性能幾乎沒有減少。繼續(xù)利用DMSO和氯化鈣進行的穩(wěn)定性實驗，發(fā)現(xiàn)在37℃貯存4周仍可看到其性能幾乎沒有減少。此外，證明如果在冰箱中以液態(tài)貯存，這些化合物則具有一年或更長時間的貯存穩(wěn)定作用。
實施例12<至少與糖化氨基酸反應的酶的穩(wěn)定>
<反應溶液組成>
R-1蛋白水解試劑150mM Tris-HCl緩沖液(pH8.5)8mM 4-氨基安替比林(由Dojindo實驗室生產(chǎn))15U/ml 過氧化物酶R-2糖化氨基酸檢測試劑150mM Tris-HCl緩沖液(pH8.5)24U/ml R-FOD-II(由Asahi Kasei公司生產(chǎn))
12mMTODB(由Dojindo實驗室生產(chǎn))+各種濃度的蛋白酶穩(wěn)定劑(加入蒸餾水作為對照)下列化合物1)-15)用作糖化氨基酸檢測試劑中至少與糖化氨基酸反應的酶的穩(wěn)定劑。
1)5％甘露醇2)5％飛梨糖醇3)5％蔗糖4)5％海藻糖5)0.5mM 氯化鈣6)0.5mM 氯化鎂7)3％L-谷氨酸(Glu)8)3％L-谷氨酰胺(Gln)9)3％L-脯氨酸(Pro)10)3％ L-丙氨酸(Ala)11)3％ L-纈氨酸(Val)12)3％ 甘氨酸(Gly)13)3％ L-賴氨酸(Lys)14)3％ 肌氨酸15)100mM 硫酸銨1)-14)由Wako Pure Chemical Industries有限公司生產(chǎn)<樣品>
0.5mM FZL<反應步驟>
將8μl樣品加入到240μl在37℃保溫的蛋白水解試劑中。在37℃引發(fā)反應并在正好5分鐘之后加80μl的糖化氨基酸檢測試劑。在添加糖化氨基酸檢測試劑前和添加糖化氨基酸檢測試劑之后5分鐘測量546nm的吸光度。ΔA0的計算通過從底物溶液吸光度測量所得的吸光度變化中減去利用蒸餾水替代底物溶液的空白樣品所得的吸光度變化來進行。將同樣反應溶液糖化氨基酸檢測試劑在37℃下貯存2天，并以同樣方法測定吸光度。根據(jù)吸光度測量結果計算出ΔA24。對利用含穩(wěn)定劑的試劑的實驗到利用不含穩(wěn)定劑的試劑的實驗，計算出相對靈敏度，其中將利用不含穩(wěn)定劑并未經(jīng)貯存的試劑時所測得的ΔA0設定為100％。結果如圖6所示。
從圖6可看出，如果不使用穩(wěn)定劑則相對靈敏度減少到30％，這表明糖化氨基酸檢測試劑具有穩(wěn)定作用。在添加穩(wěn)定劑的實驗中，觀察到添加甘露醇，山梨糖醇，蔗糖，海藻糖，氯化鈣，氯化鎂，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，L-脯氨酸，L-丙氨酸，L-纈氨酸，甘氨酸，L-賴氨酸，肌氨酸和硫酸銨的穩(wěn)定作用。其中，糖醇，氨基酸和肌氨酸顯示出尤其強的穩(wěn)定作用。繼續(xù)利用L-丙氨酸，甘氨酸或肌氨酸進行的穩(wěn)定性實驗，發(fā)現(xiàn)在37℃貯存4周仍看到性能幾乎沒有減少。此外，證明如果在冰箱中以液態(tài)貯存時，這些化合物具有一年或更長時間的貯存穩(wěn)定作用。
實施例13<制備含有突變FOD基因的DNA片斷文庫>
將具有序列表SEQ ID No.5所示堿基序列中第1-30位的堿基序列的寡核苷酸以及具有序列表SEQ ID No.6所示堿基序列中第1-30位的堿基序列的寡核苷酸的合成委托給BEX有限公司來完成。利用Taq聚合酶試劑盒(由Takara Shuzo Co.Ltd.生產(chǎn))，根據(jù)試劑盒所附的說明書以來自尖鐮孢IFO-9972的能夠編碼FOD蛋白的DNA為模板進行PCR反應，從而擴增FOD結構基因。反應是在反應液中加入Mg++離子使其終濃度為0.5mM的情況下以不均衡分布的堿基濃度(dATP0.51mM，dCTP0.20mM，dGTP1.15mM和dTTP3.76mM)進行的，以便提高誘變效率。
實施例14<制備突變FOD重組文庫>
將在實施例13中所得的含有擴增的FOD基因的DNA片斷以限制性內(nèi)切酶NcoI和EcoRI進行消化，然后與由同種限制性內(nèi)切酶處理的質(zhì)粒oTV119N(由Takara Shuzo Co.，Ltd.生產(chǎn))連接，再引入大腸桿菌JM109菌株(由Toyobo Co.Ltd.生產(chǎn))中。將細胞在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板培養(yǎng)基(由DIFCO公司生產(chǎn))上37℃下過夜培養(yǎng)，形成轉化體菌落。
實施例15<篩選賴氨酸特異性的突變FOD>
將在實施例14中制備的菌落文庫在兩塊LB瓊脂平板培養(yǎng)基上進行復制，每一塊平板含有100μg/ml氨芐青霉素和1mM IPTG(由Wako PureChemical Industries有限公司生產(chǎn))。每塊培養(yǎng)基上平鋪一層含有5U/ml過氧化酶(由Asahi Kasei公司生產(chǎn))，0.02％鄰聯(lián)茴香胺(由Wako PureChemical Industries有限公司生產(chǎn))，2.0mM糖化纈氨酸或糖化賴氨酸(通過Hashiba等的方法制備。Hashiba，H.(1976)J.Agric.Food Chem.，24，70)的LB瓊脂(0.3％)培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)8小時后，觀察到由FOD氧化糖化氨基酸所形成的氧自由基和由鄰聯(lián)茴香胺引起的菌落顯色。這樣就篩選出被糖化賴氨酸染成黑紫色且未被糖化纈氨酸染色的菌落，并獲得相應菌落的164個菌株。
實施例16<制備突變FOD候選菌株的細胞提取液>
將實施例15中得到的164個突變菌株在1.5ml含有50μg/ml氨芐青霉素和1mM IPTG的3.7％BHI液體培養(yǎng)基(由DIFCO公司生產(chǎn))中30℃培養(yǎng)16小時。對1ml培養(yǎng)液進行離心(15,000G，4℃離心1分鐘)以收集細胞。向收集的細胞中加入200μl的10mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)。利用超聲粉碎儀將細胞粉碎之后，對混合物進行離心(14,000G，4℃離心5分鐘)獲得作為上清液的細胞提取物。
實施例17
<突變FOD的底物專一性驗證>
利用上述的FOD酶活性測量方法對包含在實施例16制備的細胞提取物中的FOD突變重組體的糖化氨基酸底物專一性進行測量。結果，在候選菌株中鑒定出兩個突變體，其與糖化纈氨酸的反應性小于與糖化賴氨酸的反應性的1/1,000。這兩個突變體被作為靶突變體。
實施例18<重組質(zhì)粒的提取>
將實施例17中挑選出的突變體接種在1.5ml含50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中并在37℃振蕩培養(yǎng)16小時。按照常規(guī)方法提取質(zhì)粒。將這些質(zhì)粒命名為pcmFOD1和pcmFOD2。
實施例19<確定突變FOD基因的堿基序列>
按照雙脫氧法對實施例18中得到的突變FOD基因的堿基序列進行測定。結果，發(fā)現(xiàn)這兩個突變體具有相同結構，即在序列表SEQ ID No.1所示的堿基序列中第1115位A被G替代，并且對于編碼的重組突變FOD，在序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中第372位賴氨酸被精氨酸替代。
實施例20<每個突變體的底物專一性的驗證>
為了觀察在實施例19鑒定的突變氨基酸位點以其他氨基酸進行替代的效果，按照Kunkel等的方法進行定點誘變。將具有序列表SEQ ID No.7所示序列中第1-27位堿基序列的寡核苷酸的合成委托給外源(BEX有限公司)完成。利用Mutan-K試劑盒(由Takara Shuzo Co.Ltd.生產(chǎn))按照試劑盒所附的說明書對寡核苷酸進行定點誘變。將所得的突變基因再次連入表達質(zhì)粒pTV119N中，然后引入大腸桿菌宿主，并在含有50μg/ml氨芐青霉素和1mM的IPTG的3.7％BHI液體培養(yǎng)基中30℃下培養(yǎng)16小時，產(chǎn)生突變FOD蛋白質(zhì)。利用經(jīng)上述實驗產(chǎn)生的多種突變體按照實施例16和17中的同樣方法測定底物專一性，以發(fā)現(xiàn)具有除精氨酸外的色氨酸，甲硫氨酸，蘇氨酸，纈氨酸，丙氨酸，絲氨酸，半胱氨酸或甘氨酸替代的突變體是否顯示出與具精氨酸替代的突變體相同的糖化賴氨酸特異性的底物專一性。結果顯示在表6中。
表6
在此表中，“低于界限”表示“低于檢測界限”，“N.D.”表示“沒有數(shù)據(jù)”。上述結果證明如果序列表SEQ ID No.1的氨基酸序列中的第372位賴氨酸被其它氨基酸替代，F(xiàn)OD與糖化賴氨酸的反應性同與糖化纈氨酸的反應性相比可以被相對減少。尤其，發(fā)現(xiàn)色氨酸，甲硫氨酸或纈氨酸替代賴氨酸所得的突變體具有高度的糖化纈氨酸特異性和優(yōu)良的酶性能。用色氨酸替代賴氨酸所得的突變體命名為FOD-W，產(chǎn)生FOD-W的表達質(zhì)粒命名為pcmFOD3，甲硫氨酸替代賴氨酸所得的突變體命名為FOD-M，產(chǎn)生FOD-M的表達質(zhì)粒命名為pcmFOD4，纈氨酸替代賴氨酸所得的突變體命名為FOD-V，產(chǎn)生FOD-V的表達質(zhì)粒命名為pcmFOD5。圖7表示質(zhì)粒的共同結構。
實施例21<測定樣品中去除ε-果糖基-L-賴氨酸(ZFL)后的果糖基-L-纈氨酸(FV)>
反應試劑150mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)10U/mlFOD-V5U/ml 過氧化氫酶反應試劑250mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)10U/mlFOD20U/ml過氧化物酶0.05％疊氮化鈉0.04％4-氨基安替比林0.04％TOOS樣品溶液添加有終濃度為0，0.1，0.2或0.3mM的FV的0.3mM ZFL溶液。
0.5ml的反應溶液1在37℃預熱5分鐘后，加入0.05ml的上述樣品溶液并在37℃反應5分鐘。然后，加入0.5ml的反應溶液2，5分鐘后測定555nm下的吸光度。以蒸餾水替代樣品溶液作為空白實驗。作為對照，以同樣方法對未添加FOD-V的反應溶液1進行處理。
在圖8中，空心圓形表示未添加FOD-V所得的結果，空心方形表示添加FOD-V所得的結果。
從圖8可看出，F(xiàn)OD-V和FOD的組合使用確保了在去除樣品溶液中的ZFL后對FV的定量測定。
以色氨酸，甲硫氨酸和纈氨酸替代序列表SEQ ID No.1氨基酸序列中第372位賴氨酸所得的氨基酸序列分別顯示在序列表SEQ ID No.2，3和4中。
實施例22<糖化清蛋白的比率測定>
R-1蛋白水解試劑50mM POPSO酸緩沖液(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生產(chǎn))pH7.52,500U/ml XXIV型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))1％3-[(膽酰胺基丙基)-二甲基銨]-2-羥基-1-丙磺酸(由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))5U/ml抗壞血酸氧化酶(由F.Hoffmann-La Roche有限公司生產(chǎn))5％DMSO5mM4-氨基安替比林R-2糖化氨基酸檢測試劑150mM HEPES酸緩沖溶液(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生產(chǎn))pH7.55mM TODB10U/ml POD20U/ml R-FOD-II3％谷氨酸R-3清蛋白預處理試劑10mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)0.3％十二烷基硫酸鈉
R-4清蛋白顯色試劑200mM琥珀酸緩沖液(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生產(chǎn))pH5.50.15mM溴甲酚紫(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生產(chǎn))0.3％Tx-100(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生產(chǎn))<樣品>
1.健康人和糖尿病患者血清，每種35個樣品2.對照血清H(由BML公司生產(chǎn))作為校準物預先對校準物的糖化清蛋白濃度進行校準以便使通過HPLC方法和酶學方法得到的臨床樣品檢測結果能相符合。CRM470值用作清蛋白值。
<反應步驟>
將8μl樣品加入到240μl在37℃保溫的R-1中。在37℃引發(fā)反應并在正好5分鐘之后加入80μl的R-2。在添加R-2前和添加R-2之后5分鐘測量555nm的吸光度。分別測量對照血清H和蒸餾水以制備標準曲線，根據(jù)標準曲線對樣品中的糖化清蛋白的濃度進行確定。
將2μl樣品加入到160μl在37℃保溫的R-3清蛋白預處理試劑中。在37℃引發(fā)反應并在正好5分鐘之后加入160μl的清蛋白顯色試劑R-4。在添加清蛋白顯色試劑前和添加清蛋白顯色試劑之后5分鐘測量600nm的吸光度。
利用蒸餾水和具有已知清蛋白濃度的樣品替代清蛋白濃度待測樣品制備標準曲線。
酶學方法的GA％以如下公式進行確定GA％＝(GA濃度/清蛋白濃度)×100。
利用Hi-AUTO GAA-2000(由ARKRAY公司生產(chǎn))測得根據(jù)HPLC方法的值，結果如圖9所示。
從圖9可看出，酶學方法和HPLC方法顯示出極好的相關性r＝0.998。所有這些試劑以液態(tài)在37℃貯存2周后在性能上沒有變化。根據(jù)這些實驗，清楚地證明這些試劑能夠精確測定糖化清蛋白和確定糖化清蛋白比率，這是因為它們能1)消除球蛋白組分和抗壞血酸的影響2)使蛋白酶和至少與糖化氨基酸反應的酶保持穩(wěn)定3)精確測定清蛋白，以及4)消除糖化血紅蛋白的影響實施例23<將至少與糖化氨基酸反應的酶用于第一試劑及將含蛋白酶的組合物用于第二試劑>
R-1200mM POPSO緩沖液(pH7.5)5mM 4-氨基安替比林10U/mlPOD20U/mlR-FOD5U/ml 抗壞血酸氧化酶3％ 谷氨酸R-220mM 哌嗪-1，4-二(2-乙磺酸)緩沖液(pH6.5)20％ DMSO8,000U/ml XXIV型蛋白酶4％ 3-[(膽酰胺基丙基)-二甲基銨]-2-羥基-1-丙磺酸5mM TODBR-3，R-4 同實施例22<樣品>
同實施例22的樣品和10-200μM的FZL<反應步驟>
同實施例22。
結果如圖23所示。
從圖23可看出，即使在將至少與糖化氨基酸反應的酶加入第一個試劑，將蛋白酶加入第二個試劑的情況下，也在10分鐘的短反應時間內(nèi)對糖化蛋白質(zhì)進行了極好測定。此外，即使樣品中有糖化氨基酸，樣品中的糖化氨基酸也可被配制在R-1中的至少與糖化氨基酸反應的酶去除，這樣就能對糖化蛋白質(zhì)進行精確測定。
本發(fā)明試劑與HPLC方法具有良好相關性(R＝0.99)即酶學方法GA％＝1.03×HPLC方法GA％-0.3這表明本發(fā)明試劑能夠精確測定糖化蛋白質(zhì)。本發(fā)明試劑在37℃貯存3周或在冰箱中貯存15個月后，性能沒有降低。
工業(yè)實用性通過本發(fā)明可以對樣品中的糖化蛋白質(zhì)和糖化清蛋白的比率進行精確測定。因此，本發(fā)明的組合物可有效地用作臨床檢測試劑。
有關生物材料保藏的附注(1)(a)保藏生物材料的機構名稱和地址名稱獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所國際專利生物保藏中心地址日本茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6，郵編305-8566(b)送交保藏機構(a)保藏的日期2001年1月16日(c)保藏機構(a)給予的保藏號FERM BP-7847(2)(a)保藏生物材料的機構名稱和地址名稱獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所國際專利生物保藏中心地址日本茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6，郵編305-8566(b)送交保藏機構(a)保藏的日期2001年1月16日(c)保藏機構(a)給予的保藏號FERM BP-7848
序列表<110>旭化成株式會社(Yoshioka，Issei；Asahi Kasei Kabushiki Kaisha)<120>測定糖化蛋白質(zhì)的組合物<130>
<150>JP2001/22953JP2001/39796JP2001/24002<151>2001-1-132001-2-162001-8-8<160>7<170>
<210>1<211>1320<212>DNA<213>尖鐮孢(Fusarium oxysporum)IFO-9722<220>
<221>CDS<222>(1)...(1320)<300>
<308>DDBJ E16562<309>1999-07-28<310>JP1998201473-A/1<311>1997-01-20<312>1998-08-04<400>1gcc tca act ctc acc aaa cag tcc caa att ctc atc gtt ggt ggc gga48Ala Ser Thr Leu Thr Lys Gln Ser Gln Ile Leu Ile Val Gly Gly Gly1 5 10 15act tgg gga tgc tca act gcc ctc cat ctc gcc cgt cgg ggt tac acc96Thr Trp Gly Cys Ser Thr Ala Leu His Leu Ala Arg Arg Gly Tyr Thr20 25 30aac gtc act gtt ctc gat gtc aat cgc atc ccg tca ccg ata tca gcc144Asn Val Thr Val Leu Asp Val Asn Arg Ile Pro Ser Pro Ile Ser Ala35 40 45ggg cat gat gta aac aaa ctt gct ggc cga ctg tcg act gcc gat agc192
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<223>PCR引物<400>5aaaaccatgg cctcaactct caccaaacag 30<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>6aaaaagaatt cagatatcat tcttgatatt30<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>定點誘變引物<400>7ggcacgggtt acnnscatat cacatca2權利要求
1.利用蛋白酶和至少與糖化氨基酸反應的酶測定糖化蛋白質(zhì)的組合物，其特征在于蛋白酶與以下物質(zhì)共存1)選自脫氧膽酸、脫氧膽酰胺、膽酰胺、辛基葡糖苷、季銨鹽、季銨鹽型陽離子表面活性劑、伴刀豆凝集素A和甜菜堿中的至少一種，和/或2)抗壞血酸氧化酶及不具有4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基基團的緩沖劑。
2.如權利要求1所述的組合物，其中脫氧膽酰胺是雙葡糖酰胺基丙基脫氧膽酰胺，膽酰胺是3-[(膽酰胺基丙基)二甲基銨]-1-丙磺酸、3-[(膽酰胺基丙基)二甲基銨]-2-羥基-1-丙磺酸或雙葡糖酰胺基丙基膽酰胺。
3.如權利要求1所述的組合物，其中不具有4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基基團的緩沖劑是三羥乙基氨基甲烷或哌嗪-1，4-二(2-羥基-3-丙磺酸)。
4.如權利要求1-3之任一項所述的組合物，其中糖化蛋白質(zhì)是糖化清蛋白，該組合物包括單獨地用于測定清蛋白的組合物，并且可確定清蛋白的糖化比率，其中用于測定清蛋白的組合物包含蛋白質(zhì)變性劑和/或具S-S鍵的化合物和溴甲酚紫。
5.一種組合物，其可用于通過蛋白酶和至少與糖化氨基酸反應的酶測定糖化清蛋白，并對清蛋白進行單獨測定及確定清蛋白的糖化比率，其特征在于用于測定清蛋白的組合物含有蛋白質(zhì)變性劑和/或具S-S鍵的化合物和溴甲酚紫。
6.如權利要求4或5所述的組合物，其中蛋白質(zhì)變性劑和/或具S-S鍵的化合物是2，2′-二硫代二安息香酸、4，4′-二硫代二嗎啉、2，2′-二羥基-6，6′-二萘二硫(DDD)、2，2′-二硫代吡啶(2-PDS)、4，4′-二硫代吡啶(4-PDS)、5，5′-二硫代二-(2-硝基安息香酸)(DTNB)或十二烷基硫酸鈉。
7.如權利要求1-6之任一項所述的組合物，其中將選自二甲基亞砜、醇、水溶性鈣鹽、氯化鈉、季銨鹽和季銨鹽型陽離子表面活性劑的蛋白酶穩(wěn)定劑添加到蛋白酶中。
8.用于測定糖化蛋白質(zhì)的組合物，其包含蛋白酶、至少與糖化氨基酸反應的酶和選自二甲基亞砜、醇、水溶性鈣鹽、氯化鈉、季銨鹽和季銨鹽型陽離子表面活性劑的蛋白酶穩(wěn)定劑。
9.如權利要求1-8之任一項所述的組合物，其中將選自糖醇、蔗糖、水溶性鎂鹽、水溶性鈣鹽、硫酸銨、氨基酸和肌氨酸的用于至少與糖化氨基酸反應的酶的穩(wěn)定劑添加到所述至少與糖化氨基酸反應的酶中。
10.用于測定糖化蛋白質(zhì)的組合物，其包含蛋白酶、至少與糖化氨基酸反應的酶和選自糖醇、蔗糖、水溶性鎂鹽、水溶性鈣鹽、硫酸銨、氨基酸和肌氨酸的用于至少與糖化氨基酸反應的酶的穩(wěn)定劑。
11.如權利要求1-10之任一項所述的組合物，其中蛋白酶來自芽孢桿菌屬的微生物。
12.如權利要求1-11之任一項所述的組合物，其中至少與糖化氨基酸反應的酶是通過將序列表SEQ ID No.1氨基酸序列中的第372位賴氨酸替代為另一氨基酸而與糖化纈氨酸的反應性顯著減小的突變果糖基氨基酸氧化酶。
13.如權利要求12所述的組合物，其中利用的是以色氨酸、甲硫氨酸或纈氨酸作為所述另一氨基酸進行替代的突變果糖基氨基酸氧化酶。
14.如權利要求1-13之任一項所述的組合物，其是液體產(chǎn)品。
15.用于測定糖化蛋白質(zhì)的組合物，其包含蛋白酶及至少與糖化氨基酸反應的酶，其中至少與糖化氨基酸反應的酶包含在第一試劑中而蛋白酶包含在第二試劑中。
16.如權利要求15所述的組合物，其是液體產(chǎn)品。
17.突變果糖基氨基酸氧化酶，其與糖化纈氨酸的反應性通過用另一氨基酸替代序列表SEQ ID No.1氨基酸序列中的第372位賴氨酸而顯著減小。
18.如權利要求17所述的突變果糖基氨基酸氧化酶，其中所述另一氨基酸是色氨酸、甲硫氨酸或纈氨酸。
19.利用蛋白酶和至少與糖化氨基酸反應的酶測定糖化蛋白質(zhì)的方法，其特征在于蛋白酶進行反應時1)存在選自脫氧膽酸、脫氧膽酰胺、膽酰胺、季銨鹽、季銨鹽型陽離子表面活性劑、伴刀豆凝集素A、辛基葡糖苷和甜菜堿中的至少一種物質(zhì)以減少蛋白酶與球蛋白組分的反應性，和/或2)抗壞血酸氧化酶在不具有4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基基團的緩沖劑中進行反應以在蛋白質(zhì)消化的同時去除抗壞血酸。
20.如權利要求19所述的方法，其中脫氧膽酰胺是雙葡糖酰胺基丙基脫氧膽酰胺，膽酰胺是3-[(膽酰胺基丙基)二甲基銨]-1-丙磺酸、3-[(膽酰胺基丙基)二甲基銨]-2-羥基-1-丙磺酸或雙葡糖酰胺基丙基膽酰胺。
21.如權利要求19所述的方法，其中不具有4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基的緩沖劑是三羥乙基氨基甲烷或哌嗪-1，4-二(2-羥基-3-丙磺酸)。
22.如權利要求19-21之任一項所述的方法，其中糖化蛋白質(zhì)是清蛋白，該方法對清蛋白進行單獨地測定以計算清蛋白的糖化比率，而所述對清蛋白的測定是在用蛋白質(zhì)變性劑和/或具S-S鍵的化合物預處理樣品溶液的同時或隨后利用溴甲酚紫進行的。
23.用于計算糖化清蛋白比率的方法，包括通過蛋白酶和樣品溶液反應消化清蛋白，利用至少與糖化氨基酸反應的酶測定糖化清蛋白，和以所測定的值除以用溴甲酚紫單獨測定的清蛋白量，其中所述溴甲酚紫測定包括用蛋白質(zhì)變性劑和/或具S-S鍵的化合物預處理樣品并同時或隨后測定清蛋白。
24.如權利要求22或23所述的方法，其中蛋白質(zhì)變性劑和/或具S-S鍵的化合物是2，2′-二硫代二安息香酸、4，4′-二硫代二嗎啉、2，2′-二羥基-6，6′-二萘二硫(DDD)、2，2′-二硫代吡啶(2-PDS)、4，4′-二硫代吡啶(4-PDS)、5，5′-二硫代二-(2-硝基安息香酸)(DTNB)或十二烷基硫酸鈉。
25.如權利要求19-23之任一項所述的方法，其中將選自二甲基亞砜、醇、水溶性鈣鹽、氯化鈉、季銨鹽和季銨鹽型陽離子表面活性劑的蛋白酶穩(wěn)定劑添加到蛋白酶中。
26.利用蛋白酶和至少與糖化氨基酸反應的酶測定糖化蛋白質(zhì)的方法，其特征在于將選自二甲基亞砜、醇、水溶性鈣鹽、氯化鈉、季銨鹽和季銨鹽型陽離子表面活性劑的蛋白酶穩(wěn)定劑添加到蛋白酶中。
27.如權利要求19-26之任一項所述的方法，其中將選自糖醇、蔗糖、水溶性鎂鹽、水溶性鈣鹽、硫酸銨、氨基酸和肌氨酸的穩(wěn)定劑添加到至少與糖化氨基酸反應的酶中。
28.利用蛋白酶和至少與糖化氨基酸反應的酶測定糖化蛋白質(zhì)的方法，其包括在至少與糖化氨基酸反應的酶中加入選自糖醇、蔗糖、水溶性鎂鹽、水溶性鈣鹽、硫酸銨、氨基酸和肌氨酸的用于該酶的穩(wěn)定劑。
29.如權利要求19-28之任一項所述的方法，其中蛋白酶來自芽孢桿菌屬的微生物。
30.如權利要求19-29之任一項所述的方法，其中至少與糖化氨基酸反應的酶是突變果糖基氨基酸氧化酶，其通過用另一氨基酸替代序列表SEQ ID No.1氨基酸序列中的第372位賴氨酸而與糖化纈氨酸的反應性顯著減小。
31.如權利要求30所述的方法，其中突變果糖基氨基酸氧化酶中利用色氨酸、甲硫氨酸或纈氨酸作為所述另一氨基酸進行替代。
32.如權利要求19-31之任一項所述的方法，其中所述組合物是液體產(chǎn)品。
33.如權利要求32所述的方法，其中通過使樣品和至少與糖化氨基酸反應的酶進行反應然后與蛋白酶進行反應，對糖化蛋白質(zhì)進行測定。
34.利用蛋白酶和至少與糖化氨基酸反應的酶測定糖化蛋白質(zhì)的方法，其包括使樣品和至少與糖化氨基酸反應的酶進行反應然后與蛋白酶進行反應。
全文摘要
本發(fā)明提供用于精確測定糖化蛋白質(zhì)的組合物，該組合物可1)消除球蛋白和抗壞血酸組分的影響；2)使蛋白酶和能夠至少與糖化氨基酸反應的酶保持穩(wěn)定；3)精確測定清蛋白；和4)測定糖化清蛋白并同時消除糖化血紅蛋白的影響，本發(fā)明還提供了測定方法。因此，能夠更精確地確定糖化蛋白質(zhì)和糖化清蛋白的含量。
文檔編號C12Q1/37GK1501981SQ0280670
公開日2004年6月2日 申請日期2002年1月30日 優(yōu)先權日2001年1月31日
發(fā)明者高妻卓司, 芳陵一生, 荒井基夫, 炭谷順一, 今村茂行, 一, 夫, 生, 行 申請人:旭化成制藥株式會社