專利名稱：用于約氏乳桿菌真空冷凍干燥的保護劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于約氏乳桿菌真空冷凍干燥的保護劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
約氏乳桿菌(LactcAacillus johnsonii)是一種重要的乳桿菌，屬益生菌，它對動物益生功能主要體現(xiàn)在以下三方面1.調(diào)控動物天然防御系統(tǒng)及免疫機能作用；2.預(yù)防動物特異性皮炎作用；3.排他性競爭作用。但約氏乳桿菌對生長條件要求苛刻，在生產(chǎn)制備、 貯藏期間極易失活。真空冷凍干燥技術(shù)是保存發(fā)酵益生菌最有效的方法之一，但真空凍干過程中，由于細胞內(nèi)還有大量的水分，低溫凍存細胞時，胞內(nèi)的水分以兩種方式固化一種是形成冰晶，另一種是形成無定型的玻璃化狀態(tài)。當(dāng)以冰晶的形式固化時，水的體積增大及冰晶的機械力使細胞內(nèi)部電解質(zhì)濃度增高，PH改變，蛋白質(zhì)和酶變性，從而引起細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，最終使細胞死亡；而在玻璃化的固化過程中，水分子沒有發(fā)生重排，不會產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和體積的變化，因而不會由于機械或溶液效應(yīng)造成組織和細胞傷害，復(fù)蘇后的細胞仍具有活力。 胞內(nèi)水分子固化處于冰晶和玻璃態(tài)動態(tài)平衡。因此，在細胞凍干技術(shù)的關(guān)鍵就是要使水分盡可能多的以玻璃態(tài)的形式固化，同時降低細胞內(nèi)的水分，減少冰晶的形成。在益生菌菌粉真空干燥過程中加入適當(dāng)?shù)谋Ｗo劑，有利于微生物抵御冷凍的機械傷害以及長期存放，已成為保存益生菌的必然要求。根據(jù)保護劑所起作用的不同可分為兩種，滲透性保護劑和非滲透性保護劑。滲透性保護劑是指一些分子量較小的有機物，易于穿透細胞膜與胞內(nèi)水分子結(jié)合，從而降低細胞冰點，同時提高細胞膜對水分子的通透性。凍存時，可促使胞內(nèi)水分滲出，從而減少胞內(nèi)冰晶的形成。非滲透性保護劑是一些易溶于水的大分子物質(zhì)，不能滲透到胞內(nèi)，但可降低胞外含水量，減小胞外冰晶的形成。兩種保護劑的作用方式不同，在冷凍過程中配合使用，可有效提高凍干菌粉的存活率。在凍干過程中還常常加入抗氧化劑，以防止氧化作用對細胞的傷害，保持細胞活性并提高細胞的穩(wěn)定性。目前，有關(guān)凍干保護劑的研究主要集中在醫(yī)學(xué)醫(yī)藥領(lǐng)域，應(yīng)用于生產(chǎn)微生物飼料添加劑活菌制劑的凍干保護劑的研究不多且結(jié)果差異大，存在活菌數(shù)不高的缺點。有些保護劑中有山梨醇類物質(zhì)，保護效果有一定提高，但山梨醇類物質(zhì)的成本較高，限制了它在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用且目前無針對約氏乳桿菌真空冷凍干燥的保護劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種用于約氏乳桿菌(LactcAacillus johnsonii)真空冷凍干燥的保護劑，減小冷凍干燥對菌體的損傷，提高凍干后產(chǎn)物活菌數(shù)及利用效率，可制備出高活性的約氏乳桿菌凍干菌粉。本發(fā)明的另一目的是提供該用于約氏乳桿菌真空冷凍干燥的保護劑在制備約氏乳桿菌凍干菌粉中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明提供一種用于約氏乳桿菌(LactcAacillus johnsonii)真空冷凍干燥的保護劑，每克濕菌體或濕菌泥使用如下重量配比的保護劑脫脂乳0. 25-0. 5g、海藻糖 0. 25-0. 5g、可溶性淀粉 0. 25-lg、谷氨酸鈉 0. 25_lg、甘油 0. 25-0. 5g。為更好的達到本發(fā)明的發(fā)明效果每克濕菌體或濕菌泥使用如下重量配比的保護劑脫脂乳海藻糖可溶性淀粉谷氨酸鈉甘油=1 1 1 1 1。為更好的達到本發(fā)明的發(fā)明效果每克濕菌體或濕菌泥也可使用如下重量配比的保護劑脫脂乳海藻糖可溶性淀粉谷氨酸鈉甘油=2 1 2 4 1。為更好的達到本發(fā)明的發(fā)明效果每克濕菌體或濕菌泥也可使用如下重量配比的保護劑脫脂乳海藻糖可溶性淀粉谷氨酸鈉甘油=2:2:4:1:2。本發(fā)明的用于約氏乳桿菌真空冷凍干燥的保護劑可應(yīng)用于制備約氏乳桿菌凍干菌粉。進一步，制備約氏乳桿菌凍干菌粉的過程如下(1)約氏乳桿菌種子基培養(yǎng)；(2) 高密度發(fā)酵；(3)發(fā)酵菌泥的收集；(4)凍干菌粉的制備。更進一步，制備約氏乳桿菌凍干菌粉的過程如下(1)約氏乳桿菌種子基培養(yǎng)從平板上挑取約氏乳桿菌的單菌落至50mL的MRS培養(yǎng)基中，37度恒溫培養(yǎng)18h，然后以5 %的接種量轉(zhuǎn)接至500mL的MRS培養(yǎng)基中，繼續(xù)37度下靜止培養(yǎng)18h，即得到種子基；(2)高密度發(fā)酵高密度發(fā)酵的參數(shù)設(shè)置如下氨水調(diào)節(jié)維持PH值5. 0 ；轉(zhuǎn)速50轉(zhuǎn)/分鐘；溫度37 度；罐壓保持0. 05MPa ；發(fā)酵時間12小時；(3)發(fā)酵菌泥的收集發(fā)酵液4000g離心10分鐘， 棄去上清；用生理鹽水將菌體重懸；4000g離心10分鐘，棄去上清；(4)凍干菌粉的制備向制備的菌泥中加入5倍體積的保護劑，混勻，平衡30分鐘；于-80度預(yù)凍3小時；在真空冷凍干燥機中凍干30-36小時，凍干參數(shù)設(shè)置如下真空度0. IMba-O. 2Mba ；冷阱溫度為-50 度至-55度，即得。有益效果本發(fā)明為乳酸菌的保藏，尤其是約氏乳桿菌的保藏，提供了一個新的保護劑組方； 該保護劑中無山梨醇類物質(zhì)，成本較低；該保護劑可對約氏乳桿菌在真空冷凍干燥過程中起有效保護作用，保護率高，生產(chǎn)出的活菌得率在IO9以上，有利于乳酸菌微生物飼料添加劑利用效率的提高。通過下列實施例將更具體的說明本發(fā)明，但是應(yīng)理解所述實施例僅是為了說明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式實施例1-實施例18(1)種子基的制備挑取約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)的單菌落至50mL的MRS培養(yǎng)基(蛋白胨10克，肉膏10克，酵母提取物5克，磷酸氫二鉀2克，檸檬酸二銨2克，乙酸鈉5克，葡萄糖20克，土溫lmL，七水硫酸鎂0. 58克，四水硫酸錳0. 25克，蒸餾水1L，pH6. 2-6. 4)中， 37度恒溫培養(yǎng)18小時，然后5%的接種量轉(zhuǎn)接至500mL的MRS培養(yǎng)基中，繼續(xù)37度下靜止培養(yǎng)18小時，值OD6tltlnm為5. 0即得到種子基。
(2)高密度發(fā)酵1 %的接種量將種子基接入5L的發(fā)酵罐中，發(fā)酵過程中以氮氣保持罐壓為 0. 05MPa，轉(zhuǎn)速為50轉(zhuǎn)/分鐘，溫度為37度，流加氨水保持pH為5. 0 ；培養(yǎng)4小時后開始流加葡萄糖繼續(xù)培養(yǎng)8小時。(3)發(fā)酵菌泥的收集及(4)凍干菌粉的制備發(fā)酵液于4度，4000g離心10分鐘收集菌體；棄去上清，沉淀用無菌生理鹽水重懸，按上述條件再次離心，棄去上清，分別用5倍體積37度預(yù)熱各種配比的本發(fā)明的保護劑 (見表1)重懸菌體，攪拌平衡30分鐘，置于-80度冰箱預(yù)凍3小時，置于真空冷凍干燥機中。凍干條件為真空度0. 2mba，冷阱溫度為-55度，凍干30小時，即得到約氏乳桿菌凍干粉。(5)存活率測定稱取1克干菌粉溶于9mL生理鹽水中，混勻；依次10倍稀釋至KTki ；每個稀釋度取100微升涂布MRS瓊脂培養(yǎng)基(蛋白胨10克，肉膏10克，酵母提取物5克，磷酸氫二鉀2 克，檸檬酸二銨2克，乙酸鈉5克，葡萄糖20克，土溫lmL，七水硫酸鎂0. 58克，四水硫酸錳 0. 25克，瓊脂15克，蒸餾水1L，pH6. 2-6. 4)，每個梯度做三個平行，37度培養(yǎng)18小時，采用平板菌落計數(shù)法，得出發(fā)酵液和凍干樣品中的活菌數(shù)，并計算乳酸菌的存活率(結(jié)果見表1)。表1保護劑配方設(shè)計及結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種用于約氏乳桿菌(LactcAacillus johnsonii)真空冷凍干燥的保護劑，其特征在于每克濕菌體或濕菌泥使用如下重量配比的保護劑脫脂乳0. 25-0. 5g、海藻糖 0. 25-0. 5g、可溶性淀粉 0. 25-lg、谷氨酸鈉 0. 25_lg、甘油 0. 25-0. 5g。
2.如權(quán)1所述的用于約氏乳桿菌真空冷凍干燥的保護劑，其特征在于每克濕菌體或濕菌泥使用如下重量配比的保護劑脫脂乳海藻糖可溶性淀粉谷氨酸鈉甘油= 1:1:1:1:1。
3.如權(quán)1所述的用于約氏乳桿菌真空冷凍干燥的保護劑，其特征在于每克濕菌體或濕菌泥使用如下重量配比的保護劑脫脂乳海藻糖可溶性淀粉谷氨酸鈉甘油=2 · 1 · 2 · 4 · 1 ο
4.如權(quán)1所述的用于約氏乳桿菌真空冷凍干燥的保護劑，其特征在于每克濕菌體或濕菌泥使用如下重量配比的保護劑脫脂乳海藻糖可溶性淀粉谷氨酸鈉甘油=2 · 2 · 4 · 1 · 2 ο
5.如權(quán)1-4任一項所述的用于約氏乳桿菌真空冷凍干燥的保護劑在制備約氏乳桿菌凍干菌粉中的應(yīng)用。
6.如權(quán)5所述的應(yīng)用，其特征在于制備約氏乳桿菌凍干菌粉的過程如下(1)約氏乳桿菌種子基培養(yǎng)；(2)高密度發(fā)酵；(3)發(fā)酵菌泥的收集；(4)凍干菌粉的制備。
7.如權(quán)6所述的應(yīng)用，其特征在于制備約氏乳桿菌凍干菌粉的過程如下(1)約氏乳桿菌種子基培養(yǎng)從平板上挑取約氏乳桿菌的單菌落至50mL的MRS培養(yǎng)基中，37度恒溫培養(yǎng)18h，然后以5%的接種量轉(zhuǎn)接至500mL的MRS培養(yǎng)基中，繼續(xù)37度下靜止培養(yǎng)18h，即得到種子基；( 高密度發(fā)酵高密度發(fā)酵的參數(shù)設(shè)置如下氨水調(diào)節(jié)維持 PH值5. 0 ；轉(zhuǎn)速50轉(zhuǎn)/分鐘；溫度37度；罐壓保持0. 05MPa ；發(fā)酵時間12小時；(3)發(fā)酵菌泥的收集發(fā)酵液4000g離心10分鐘，棄去上清；用生理鹽水將菌體重懸；4000g離心10分鐘，棄去上清；(4)凍干菌粉的制備向制備的菌泥中加入5倍體積的保護劑，混勻，平衡30 分鐘；于-80度預(yù)凍3小時；在真空冷凍干燥機中凍干30-36小時，凍干參數(shù)設(shè)置如下真空度0. IMba-O. 2Mba ；冷阱溫度為-50度至-55度，即得。全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于約氏乳桿菌真空冷凍干燥的保護劑及其應(yīng)用。本發(fā)明的保護劑中無山梨醇類物質(zhì)，成本較低；該保護劑可對約氏乳桿菌在真空冷凍干燥過程中提供有效保護，保護率高，生產(chǎn)出的活菌得率在109以上，有利于乳酸菌微生物飼料添加劑利用效率的提高。
文檔編號C12R1/225GK102453681SQ201110419979
公開日2012年5月16日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者孫曉雯, 張軍, 汪攀, 王安如, 閆軼潔 申請人:北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司, 湖南大北農(nóng)農(nóng)業(yè)科技有限公司, 漳州大北農(nóng)農(nóng)牧科技有限公司