專利名稱：脫氮假單胞菌發(fā)酵生產維生素b12的培養(yǎng)基及發(fā)酵方法
技術領域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵技術領域，特別是涉及一種脫氮假單胞菌發(fā)酵生產維生素B12的培養(yǎng)基及發(fā)酵方法。
背景技術：
維生素B12為鈷胺素類化合物，主要用于治療惡性貧血，亦與葉酸合用用于治療各種巨幼紅細胞性貧血、抗葉酸藥引起的貧血及脂肪瀉。還用于神經系統(tǒng)疾病(如神經炎、神經萎縮)的治療等。目前國內外商品化的維生素B12幾乎都是通過微生物發(fā)酵進行生產的。其中以脫氮假單胞菌發(fā)酵生產維生素B12的生產原輔料主要利用甜菜糖蜜、蔗糖等碳、氮源及少量無機鹽組成的培養(yǎng)基進行液體深層發(fā)酵，中間采用流加補料方式，再經多步提煉、精制而成。 甜菜糖蜜作為維生素B12生產的主要原料，對維生素B12的正常發(fā)酵生產起著重要作用。但是，一直以來，甜菜糖蜜由于受人工種植及采收季節(jié)的影響，產品質量波動大。甜菜糖蜜生產的季節(jié)性也特別強，每年的十月至次年的三月為甜菜糖蜜的產出季節(jié)，供應量較充足，糖蜜新鮮，質量較好，剩余的6個月時間甜菜糖蜜的產出量明顯不足，這嚴重制約著維生素^2 的工業(yè)化生產；而且甜菜糖蜜因甜菜產地不同而質量差異較大，對維生素B12的發(fā)酵單位影響較大；另外，糖蜜的貯存、運輸成本也較高。因此，提供一種可替代甜菜糖蜜的原料對于穩(wěn)定維生素B12工業(yè)化生產具有非常重要的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就在于克服上述現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種可替代甜菜糖蜜，質量穩(wěn)定，來源不受季節(jié)限制，供應充足，實現(xiàn)維生素B12穩(wěn)定、有效生產的脫氮假單胞菌發(fā)酵生產維生素B12的培養(yǎng)基；
本發(fā)明的另一目的是提供利用上述培養(yǎng)基生產維生素B12的發(fā)酵方法。為實現(xiàn)上述目的所采取的技術方案為
一種脫氮假單胞菌發(fā)酵生產維生素B12的培養(yǎng)基，包括一級種子培養(yǎng)基、二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于上述一級種子培養(yǎng)基、二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中均含有人工糖蜜，該人工糖蜜是由麥芽糖、硫胺素、核黃素和生物素組成；
上述一級種子培養(yǎng)基的組成為麥芽糖2. 0 2. ^g/m3，硫胺素0. 007 0. 008kg/m3, 核黃素0. 007 0. 008 kg/m3，生物素0. 007 0. 008kg/m3，5，6-二甲基苯并咪唑0. 018 0. 022 kg/m3,硫酸鋅 0. 04 0. 05 kg/m3,氧化鎂 0. 018 0. 022kg/m3，玉米漿 14. 0 16. OL/m3,磷酸氫二銨 0. 040 0. 045 kg/m3,碳酸鈣 0. 02 0. 03 kg/m3 和甜菜堿 0. 10 0. 11 kg/m3 ；
上述二級種子培養(yǎng)基的組成為麥芽糖2. 6 2. Ag/m3，硫胺素0. 008 0. 009kg/m3, 核黃素0. 008 0. 009 kg/m3,生物素0. 008 0. 009kg/m3，5，6- 二甲基苯并咪唑0. 07
30. 08kg/m3，硫酸鋅 0. 005 0. 006kg/m3，氧化鎂 0. 02 0. 03kg/m3，玉米漿 20. 0 22. OL/ m3,甜菜堿 0. 30 0. 32kg/m3,磷酸氫二銨 0. 04 0. 05kg/m3,碳酸鈣 0. 08 0. 09kg/m3 和尿素 0. 004 0. 005 kg/m3 ；
上述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為麥芽糖4. 2 4. 3kg/m3，硫胺素0. 013 0. 015kg/m3,核黃素0. 013 0. 015 kg/m3，生物素0. 013 0. 015 kg/m3, 5, 6-二甲基苯并咪唑0. 09 0. 10kg/m3，甘油磷酸 0. 50 0. 55kg/m3，硫酸鋅 0. 005 0. 006 kg/m3,氯化鈷 0. 0001 0. 0002kg/m3,玉米漿 30. 0 32. OL/m3,碳酸鈣 0. 07 0. 08kg/m3,尿素 0. 01 0. 02kg/m3, 磷酸氫二銨0. 04 0. 06 kg/m3,甜菜堿2. 4 2. 6kg/m3和氧化鎂0. 04 0. 06kg/m3 ； 一種利用上述培養(yǎng)基的發(fā)酵方法，其工藝步驟包括
1)一級種子培養(yǎng)首先將一級種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無菌空氣保壓，然后在火焰保護下，將已經培養(yǎng)好的脫氮假單胞菌母瓶種子接入其中進行培養(yǎng)，接種量控制在培養(yǎng)基體積的5 - 10% ；培養(yǎng)條件為罐壓0. 04 0. 05MPa ；罐溫四 33°C ；空氣流量3 8m3/ h ；培養(yǎng)時間20 30小時；
2)二級種子培養(yǎng)先將二級種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無菌空氣保壓，然后將一級種子液全部移入二級種子罐進行培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為罐壓0. 04 0. 05MPa ；罐溫四 33°C ； 空氣流量3 8m3/h ；培養(yǎng)時間60 80小時；
3)發(fā)酵培養(yǎng)先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無菌空氣保壓，然后將二級種子液全部移入發(fā)酵罐進行培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為罐壓0. 05 0. 06MPa ；罐溫30 33°C;空氣流量10 15m3/h ；培養(yǎng)時間約為160 200小時，在發(fā)酵過程中，當總糖含量低于7%時進行補料，補料時加入人工糖蜜，維持發(fā)酵液總糖含量控制在7 7. 5%。本發(fā)明是基于下面闡述的甜菜糖蜜影響維生素B12發(fā)酵效價的因素而設計的
1)甜菜糖蜜中的粗蛋白主要是由氨、酰胺及硝酸鹽等組成。當粗蛋白含量過高超過4% 以上時，會促使菌體細胞加速生長，減少了代謝產物的合成。2)甜菜糖蜜中的氨基酸是維生素B12發(fā)酵過程中非必需的氨基酸，因此其蛋白質對合成維生素B12生物學價值較低。3)甜菜糖蜜中的膠體主要為木糖膠、阿拉伯糖膠和果膠等，不是維生素B12發(fā)酵過程中所需的有用物質。4)甜菜糖蜜所含糖類主要是蔗糖，是維生素B12發(fā)酵中的基礎碳源，是構成菌體細胞和代謝產物的主要營養(yǎng)元素。甜菜糖蜜中合理的總糖含量是決定維生素B12效價的關鍵因素之一。目前，國內市場購買的甜菜糖蜜中總糖的含量偏低。5)甜菜糖蜜的生產廠家為了保證其微生物含量控制在一定的范圍內，通常加入防腐劑。該防腐劑能夠抑制脫氮假單胞菌的菌體生長。故而，本發(fā)明通過采用由麥芽糖、硫胺素、核黃素和生物素組成的人工糖蜜替代甜菜糖蜜，優(yōu)化其培養(yǎng)基配方，從而解決了因甜菜糖蜜質量不穩(wěn)定導致發(fā)酵效價波動范圍大的問題，并獲得了一種穩(wěn)定、有效地生產維生素B12的方法。其發(fā)酵單位達到180mg/L，而采用甜菜糖蜜，其它原輔料配伍比例不變，維生素B12的發(fā)酵單位為僅為140 160mg/L。本發(fā)明節(jié)約了原輔料用量，降低綜合成本，減少廢水排放。
具體實施例方式
4
下面用實例予以說明本發(fā)明，應該理解的是，實例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。本發(fā)明的范圍與核心內容依據權利要求書加以確定。下述實施例為脫氮假單胞桿菌母瓶種子采用目前常規(guī)的培養(yǎng)方法。實施例1
一級種子培養(yǎng)基配制過程在Im3 —級種子罐中加入人工糖蜜(其中麥芽糖2. 0kg、硫胺素7g、核黃素7g、生物素7g)、玉米漿14L、氧化鎂18g、5，6- 二甲基苯并咪唑18g、磷酸氫二銨40g、硫酸鋅4g、碳酸鈣20g，甜菜堿100g。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓力 0. 10 0. 14MPa ；溫度120 122°C ；滅菌時間31分鐘，冷卻并用無菌空氣保壓，壓力控制在0. 01-0. 02MPa，等待接種。二級種子培養(yǎng)基制備過程在IOm3 二級種子罐中加入人工糖蜜(其中麥芽糖 2Wcg、硫胺素80g、核黃素80g、生物素80g)、玉米漿200L、甜菜堿3kg、氧化鎂200g、磷酸氫二銨400g、硫酸鋅50g、碳酸鈣800g、5，6-二甲基苯并咪唑700g、尿素40g。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓力0. 10 0. 14MPa ；溫度120 ；滅菌時間32分鐘，冷卻并用無菌空氣保壓，壓力控制在0. 01-0. 02MPa，等待移種。發(fā)酵培養(yǎng)基制備過程在IOOm3發(fā)酵罐中加入人工糖蜜(其中麥芽糖420kg、硫胺素1. 3kg、核黃素1. 3kg、生物素1. 3kg)、玉米漿3000L、5，6- 二甲基苯并咪唑9kg、磷酸氫二銨40kg、硫酸鋅500g、碳酸鈣Ag、甘油磷酸50kg、氧化鎂4kg、氯化鈷100kg、尿素1kg， 甜菜堿MOkg。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓力0. 10 0. 14MPa ；溫度122 1230C ；時間38分鐘。冷卻，并用無菌空氣保壓，壓力控制在0. 01-0. 02MPa，等待移種。一級種子培養(yǎng)過程控制將符合接種條件(無雜菌，OD為0. 198，搖瓶效價23%ig/ L)的脫氮假單胞菌母瓶種子在火焰保護下，由接種口接入母瓶種子，接種量控制在種子培養(yǎng)基體積的5. 4%,罐壓控制在0. 04 - 0. 05MPa ；罐溫四 33°C ；空氣流量6m3/h ；培養(yǎng)時間約為24. 7小時。種子培養(yǎng)基OD 0. 210 ；pH :7. 3。二級種子培養(yǎng)過程控制符合移種條件(無雜菌，OD為0. 210)的一級種子液由移種管道全部移入二級種子罐。培養(yǎng)條件罐壓0. 04 - 0. 05MPa ；罐溫四 32°C;空氣流量 7m3/h ；培養(yǎng)時間 71. 4h。種子培養(yǎng)基 OD :0. 394 ；pH :7. 2。發(fā)酵培養(yǎng)基過程控制將符合移種條件(無雜菌，OD為0. 394)的二級種子液由移種管道全部移入發(fā)酵罐。培養(yǎng)條件罐壓控制在0. 05 - 0. 06MPa ；罐溫30 33°C ；空氣流量14. 3 m3/h ；培養(yǎng)時間為185. 4h。補料控制發(fā)酵過程中進行補料，補料時加入人工糖蜜(麥芽糖2. 6 2. 7 kg/m3， 硫胺素 0. 008 0. 009kg/m3,核黃素 0. 008 0. 009kg/m3,生物素 0. 008 0. 009 kg/m3)。 發(fā)酵過程中每隔6 檢測總糖。當總糖含量低于7%進行補料。維持發(fā)酵液總糖含量控制在7 7. 5%。發(fā)酵結束，維生素B12發(fā)酵單位為18;3mg/L。實施例2
一級種子培養(yǎng)基配制過程在Im3 —級種子罐中加入人工糖蜜(其中麥芽糖2. 1kg、硫胺素7. 5g、核黃素7. 5g、生物素7. 5g)、玉米漿15L、氧化鎂20g、5，6- 二甲基苯并咪唑20g、 磷酸氫二銨42g、硫酸鋅4. 5g、碳酸鈣25g，甜菜堿105g。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓力0. 10 0. 14MPa ；溫度120 122°C ；滅菌時間31分鐘，冷卻并用無菌空氣保壓，壓力控制在0. 01-0. 02MPa，等待接種。二級種子培養(yǎng)基制備過程在IOm3 二級種子罐中加入人工糖蜜(其中麥芽糖 26. ^g、硫胺素85g、核黃素85g、生物素85g)、玉米漿210L、甜菜堿3. 1kg、氧化鎂250g、磷酸氫二銨450g、硫酸鋅55g、碳酸鈣850g、5，6-二甲基苯并咪唑750g、尿素45g。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓力0. 10 0. 14MPa ；溫度120 ；滅菌時間32分鐘， 冷卻并用無菌空氣保壓，壓力控制在0. 01-0. 02MPa，等待移種。發(fā)酵培養(yǎng)基制備過程在IOOm3發(fā)酵罐中加入人工糖蜜(其中麥芽糖42^g、硫胺素1. 4kg、核黃素1. 4kg、生物素1. 4kg)、玉米漿3100L、5，6- 二甲基苯并咪唑9. 5kg、磷酸氫二銨41kg、硫酸鋅550g、碳酸鈣7. ^g、甘油磷酸52kg、氧化鎂^g、氯化鈷150kg、尿素 1. 5kg,甜菜堿250kg。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓力0. 10 0. 14MPa ；溫度 122 123°C ；時間38分鐘。冷卻，并用無菌空氣保壓，壓力控制在0. 01-0. 02MPa，等待移種。一級種子培養(yǎng)過程控制將符合接種條件(無雜菌，OD為0. 214，搖瓶效價236mg/ L)的脫氮假單胞桿菌母瓶種子在火焰保護下，由接種口接入母瓶種子，接種量控制在種子培養(yǎng)基體積的5. 8%,罐壓控制在0. 04 - 0. 05MPa ；罐溫四 33 °C ；空氣流量6m3/h ；培養(yǎng)時間約為24. 2小時。種子培養(yǎng)基OD 0. 283 ；pH :7. 2。二級種子培養(yǎng)過程控制符合移種條件(無雜菌，OD為0. 283)的一級種子液由移種管道全部移入二級種子罐。培養(yǎng)條件罐壓0. 04 - 0. 05MPa ；罐溫四 32°C;空氣流量 7m3/h ；培養(yǎng)時間 71. 7h。種子培養(yǎng)基 OD :0. 421 ；pH :7. 3。發(fā)酵培養(yǎng)基過程控制將符合移種條件(無雜菌，OD為0. 421)的二級種子液由移種管道全部移入發(fā)酵罐。培養(yǎng)條件罐壓控制在0. 05 - 0. 06MPa ；罐溫30 33°C ；空氣流量14. 5m3/h ；培養(yǎng)時間為178. 6h。補料控制發(fā)酵過程中進行補料，補料時加入人工糖蜜(麥芽糖2. 6 2. 7 kg/m3， 硫胺素 0. 008 0. 009kg/m3,核黃素 0. 008 0. 009kg/m3,生物素 0. 008 0. 009kg/m3)。 發(fā)酵過程中每隔6 檢測總糖。當總糖含量低于7%進行補料。維持發(fā)酵液總糖含量控制在7 7. 5%。發(fā)酵結束，維生素B12發(fā)酵單位為196mg/L。實施例3
一級種子培養(yǎng)基配制過程在Im3 —級種子罐中加入人工糖蜜(其中麥芽糖2. ^g、硫胺素Sg、核黃素Sg、生物素Sg)、玉米漿16L、氧化鎂22g、5，6- 二甲基苯并咪唑22g、磷酸氫二銨45g、硫酸鋅5g、碳酸鈣30g，甜菜堿110g。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓力 0. 10 0. 14MPa ；溫度120 122°C ；滅菌時間31分鐘，冷卻并用無菌空氣保壓，壓力控制在0. 01-0. 02MPa，等待接種。二級種子培養(yǎng)基制備過程在IOm3 二級種子罐中加入人工糖蜜(其中麥芽糖 2Ag、硫胺素90g、核黃素90g、生物素90g)、玉米漿220L、甜菜堿3. ^g、氧化鎂300g、磷酸氫二銨500g、硫酸鋅60g、碳酸鈣900g、5，6-二甲基苯并咪唑800g、尿素50g。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓力0. 10 0. 14MPa ；溫度120 ；滅菌時間32分鐘，冷卻并用無菌空氣保壓，壓力控制在0. 01-0. 02MPa，等待移種。發(fā)酵培養(yǎng)基制備過程在IOOm3發(fā)酵罐中加入人工糖蜜(其中麥芽糖430kg、硫胺
6素1. 5kg、核黃素1. 5kg、生物素1. 5kg)、玉米漿3200L、5，6- 二甲基苯并咪唑10kg、磷酸氫二銨42kg、硫酸鋅600g、碳酸鈣^ig、甘油磷酸55kg、氧化鎂meg、氯化鈷200kg、尿素^ig, 甜菜堿^Okg。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓力0. 10 0. 14MPa ；溫度122 1230C ；時間38分鐘。冷卻，并用無菌空氣保壓，壓力控制在0.01-0. 02MPa，等待移種。一級種子培養(yǎng)過程控制將符合接種條件(無雜菌，OD為0. 205，搖瓶效價231mg/ L)的脫氮假單胞桿菌母瓶種子在火焰保護下，由接種口接入母瓶種子，接種量控制在種子培養(yǎng)基體積的6. 1%,罐壓控制在0. 04 - 0. 05MPa ；罐溫四 33 °C ；空氣流量6m3/h ；培養(yǎng)時間約為25小時。種子培養(yǎng)基OD 0. 225 ；pH :7. 3。二級種子培養(yǎng)過程控制符合移種條件(無雜菌，OD為0. 433)的一級種子液由移種管道全部移入二級種子罐。培養(yǎng)條件罐壓0. 04 - 0. 05MPa ；罐溫四 32 °C;空氣流量 7m3/h ；培養(yǎng)時間 71. 4h。種子培養(yǎng)基 OD :0. 278 ；pH :7. 4。發(fā)酵培養(yǎng)基過程控制將符合移種條件(無雜菌，OD為0. 433)的二級種子液由移種管道全部移入發(fā)酵罐。培養(yǎng)條件罐壓控制在0. 05 - 0. 06MPa ；罐溫30 33°C ；空氣流量14. 8 m3/h ；培養(yǎng)時間為181h。補料控制發(fā)酵過程中進行補料，補料時加入人工糖蜜(麥芽糖2. 6 2. 7，硫胺素 0. 008 0. 009，核黃素0. 008 0. 009，生物素0. 008 0. 009)。發(fā)酵過程中每隔6 7h 檢測總糖。當總糖含量低于7%進行補料。維持發(fā)酵液總糖含量控制在7 7. 5%。發(fā)酵結束，維生素B12發(fā)酵單位為185mg/L。實施例4
一級種子培養(yǎng)基配制過程在Im3 —級種子罐中加入人工糖蜜(其中麥芽糖2. 1kg、硫胺素7. 5g、核黃素7. 5g、生物素7. 5g)、玉米漿15L、氧化鎂20g、5，6- 二甲基苯并咪唑20g、 磷酸氫二銨42g、硫酸鋅4. 5g、碳酸鈣25g，甜菜堿105g。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓力0. 10 0. 14MPa ；溫度120 122°C ；滅菌時間31分鐘，冷卻并用無菌空氣保壓， 壓力控制在0. 01-0. 02MPa，等待接種。二級種子培養(yǎng)基制備過程在IOm3 二級種子罐中加入人工糖蜜(其中麥芽糖 26. ^g、硫胺素85g、核黃素85g、生物素85g)、玉米漿210L、甜菜堿3. 1kg、氧化鎂250g、磷酸氫二銨450g、硫酸鋅55g、碳酸鈣850g、5，6-二甲基苯并咪唑750g、尿素45g。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓力0. 10 0. 14MPa ；溫度120 ；滅菌時間32分鐘， 冷卻并用無菌空氣保壓，壓力控制在0. 01-0. 02MPa，等待移種。發(fā)酵培養(yǎng)基制備過程在IOOm3發(fā)酵罐中加入人工糖蜜(其中麥芽糖42^g、硫胺素1.4kg、核黃素1.4kg、生物素1.4kg)、玉米漿3100L、5，6-二甲基苯并咪唑10kg、磷酸氫二銨41kg、硫酸鋅550g、碳酸鈣7. 4kg、甘油磷酸53kg、氧化鎂5. ^g、氯化鈷140kg、尿素1. ^g，甜菜堿^Okg。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓力0. 10 0. 14MPa ；溫度 122 1230C ；時間37分鐘。冷卻，并用無菌空氣保壓，壓力控制在0. 01-0. 02MPa，等待移種。一級種子培養(yǎng)過程控制將符合接種條件(無雜菌，OD為0. 216，搖瓶效價23%ig/ L)的脫氮假單胞桿菌母瓶種子在火焰保護下，由接種口接入母瓶種子，接種量控制在種子培養(yǎng)基體積的6. 2 %,罐壓控制在0. 04 - 0. 05MPa ；罐溫四 33°C;空氣流量6. 2m3/h ；培養(yǎng)時間約為24. 6小時。種子培養(yǎng)基OD 0. 290 ；pH :7. 3。
二級種子培養(yǎng)過程控制符合移種條件(無雜菌，OD為0. 290)的一級種子液由移種管道全部移入二級種子罐。培養(yǎng)條件罐壓0. 04 - 0. 05MPa ；罐溫四 32°C;空氣流量 7. 2m3/h ；培養(yǎng)時間 70. 8h。種子培養(yǎng)基 OD :0. 417 ；pH :7. 4。發(fā)酵培養(yǎng)基過程控制將符合移種條件(無雜菌，OD為0. 417)的二級種子液由移種管道全部移入發(fā)酵罐。培養(yǎng)條件罐壓控制在0. 05 - 0. 06MPa ；罐溫30 33°C ；空氣流量14. lm3/h ；培養(yǎng)時間為177h。補料控制發(fā)酵過程中進行補料，補料時加入人工糖蜜(麥芽糖2. 6 2. 7 kg/m3， 硫胺素 0. 008 0. 009 kg/m3，核黃素 0. 008 0. 009 kg/m3，生物素 0. 008 0. 009 kg/m3)。 發(fā)酵過程中每隔6 檢測總糖。當總糖含量低于7%進行補料。維持發(fā)酵液總糖含量控制在7 7. 5%。發(fā)酵結束，維生素B12發(fā)酵單位為198mg/L。實例 5
一級種子培養(yǎng)基配制過程在Im3 —級種子罐中加入人工糖蜜(其中麥芽糖2. 1kg、硫胺素7. 5g、核黃素7. 5g、生物素7. 5g)、玉米漿15L、氧化鎂20g、5，6- 二甲基苯并咪唑20g、 磷酸氫二銨42g、硫酸鋅4. 5g、碳酸鈣25g，甜菜堿105g。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓力0. 10 0. 14MPa ；溫度120 122°C ；滅菌時間32分鐘，冷卻并用無菌空氣保壓， 壓力控制在0. 01-0. 02MPa，等待接種。二級種子培養(yǎng)基制備過程在IOm3 二級種子罐中加入人工糖蜜(其中麥芽糖 26. ^g、硫胺素85g、核黃素85g、生物素85g)、玉米漿210L、甜菜堿3. 1kg、氧化鎂250g、磷酸氫二銨450g、硫酸鋅55g、碳酸鈣850g、5，6-二甲基苯并咪唑750g、尿素45g。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓力0. 10 0. 14MPa ；溫度120 ；滅菌時間31分鐘， 冷卻并用無菌空氣保壓，壓力控制在0. 01-0. 02MPa，等待移種。發(fā)酵培養(yǎng)基制備過程在IOOm3發(fā)酵罐中加入人工糖蜜(其中麥芽糖420kg、硫胺素1. 3kg、核黃素1. 3kg、生物素1. 3kg)、玉米漿3000L、5，6- 二甲基苯并咪唑9kg、磷酸氫二銨40kg、硫酸鋅500g、碳酸鈣Ag、甘油磷酸50kg、氧化鎂4kg、氯化鈷100kg、尿素1kg， 甜菜堿MOkg。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓力0. 10 0. 14MPa ；溫度122 1230C ；時間38分鐘。冷卻，并用無菌空氣保壓，壓力控制在0. 01-0. 02MPa，等待移種。一級種子培養(yǎng)過程控制將符合接種條件(無雜菌，OD為0. 212，搖瓶效價23;3mg/ L)的脫氮假單胞桿菌母瓶種子在火焰保護下，由接種口接入母瓶種子，接種量控制在種子培養(yǎng)基體積的6. 1%,罐壓控制在0. 04 - 0. 05MPa ；罐溫四 33 °C ；空氣流量6. 2m3/h ；培養(yǎng)時間約為24. 8小時。種子培養(yǎng)基OD 0. 292 ；pH :7. 3。二級種子培養(yǎng)過程控制符合移種條件(無雜菌，OD為0. 292)的一級種子液由移種管道全部移入二級種子罐。培養(yǎng)條件罐壓0. 04 - 0. 05MPa ；罐溫四 32°C;空氣流量 7. lm3/h ；培養(yǎng)時間 71. 2h。種子培養(yǎng)基 OD :0. 418 ；pH :7. 4。發(fā)酵培養(yǎng)基過程控制將符合移種條件(無雜菌，OD為0. 418)的二級種子液由移種管道全部移入發(fā)酵罐。培養(yǎng)條件罐壓控制在0. 05 - 0. 06MPa ；罐溫30 33°C ；空氣流量:14m3/h ；培養(yǎng)時間為178. Ih0補料控制發(fā)酵過程中進行補料，補料時加入人工糖蜜(麥芽糖2. 6 2. 7，硫胺素 0. 008 0. 009kg/m3,核黃素 0. 008 0. 009 kg/m3,生物素 0. 008 0. 009 kg/m3)。發(fā)酵
8過程中每隔6 檢測總糖。當總糖含量低于7%進行補料。維持發(fā)酵液總糖含量控制在 7 7. 5%ο發(fā)酵結束，維生素B12發(fā)酵單位為18;3mg/L。實例6
一級種子培養(yǎng)基配制過程在Im3 —級種子罐中加入人工糖蜜(其中麥芽糖2. 1kg、硫胺素7. 6g、核黃素7. 5g、生物素7. 6g)、玉米漿15. 8L、氧化鎂21g、5，6- 二甲基苯并咪唑 22g、磷酸氫二銨42. 3g、硫酸鋅4. 4g、碳酸鈣^g，甜菜堿106g。完成配料后進行滅菌處理， 滅菌條件壓力0. 10 0. 14MPa ；溫度120 122°C ；滅菌時間32分鐘，冷卻并用無菌空氣保壓，壓力控制在0. 01-0. 02MPa，等待接種。二級種子培養(yǎng)基制備過程在IOm3 二級種子罐中加入人工糖蜜(其中麥芽糖 26. meg、硫胺素86g、核黃素85g、生物素85g)、玉米漿211. 4L、甜菜堿3. 1kg、氧化鎂251g、 磷酸氫二銨452g、硫酸鋅55g、碳酸鈣851g、5，6-二甲基苯并咪唑759g、尿素46g。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓力0. 10 0. 14MPa ；溫度120 滅菌時間31分鐘， 冷卻并用無菌空氣保壓，壓力控制在0. 01-0. 02MPa，等待移種。發(fā)酵培養(yǎng)基制備過程在IOOm3發(fā)酵罐中加入人工糖蜜(其中麥芽糖430kg、硫胺素1. 5kg、核黃素1. 5kg、生物素1. 5kg)、玉米漿3200L、5，6- 二甲基苯并咪唑10kg、磷酸氫二銨42kg、硫酸鋅600g、碳酸鈣^ig、甘油磷酸5^g、氧化鎂meg、氯化鈷200kg、尿素^ig, 甜菜堿^Okg。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓力0. 10 0. 14MPa ；溫度122 1230C ；時間37分鐘。冷卻，并用無菌空氣保壓，壓力控制在0. 01-0. 02MPa，等待移種。一級種子培養(yǎng)過程控制將符合接種條件(無雜菌，OD為0. 214，搖瓶效價23;3mg/ L)的脫氮假單胞桿菌母瓶種子在火焰保護下，由接種口接入母瓶種子，接種量控制在種子培養(yǎng)基體積的6. 3 %,罐壓控制在0. 04 - 0. 05MPa ；罐溫四 33°C ；空氣流量6. 4m3/h ；培養(yǎng)時間約為24. 7小時。種子培養(yǎng)基OD 0. 296 ；pH :7. 2。二級種子培養(yǎng)過程控制符合移種條件(無雜菌，OD為0. 296)的一級種子液由移種管道全部移入二級種子罐。培養(yǎng)條件罐壓0. 04 - 0. 05MPa ；罐溫四 32°C;空氣流量 7. 4m3/h ；培養(yǎng)時間 70. 7h。種子培養(yǎng)基 OD :0. 409 ；pH :7. 3。發(fā)酵培養(yǎng)基過程控制將符合移種條件(無雜菌，OD為0. 409)的二級種子液由移種管道全部移入發(fā)酵罐。培養(yǎng)條件罐壓控制在0. 05 - 0. 06MPa ；罐溫30 33°C ；空氣流量14. 2m3/h ；培養(yǎng)時間為178. 6h。補料控制發(fā)酵過程中進行補料，補料時加入人工糖蜜(麥芽糖2. 6 2. 7，硫胺素 0. 008 0. 009kg/m3,核黃素 0. 008 0. 009kg/m3,生物素 0. 008 0. 009 kg/m3)。發(fā)酵過程中每隔6 檢測總糖。當總糖含量低于7%進行補料。維持發(fā)酵液總糖含量控制在 7 7. 5%ο發(fā)酵結束，維生素B12發(fā)酵單位為189mg/L。對比實例以甜菜糖蜜工藝為培養(yǎng)基配方，用脫氮假單胞桿菌發(fā)酵生產維生素B12 一級種子培養(yǎng)基配制過程在Im3 —級種子罐中加入甜菜糖蜜3. 4kg，玉米漿15L、氧化
鎂20g、5，6- 二甲基苯并咪唑20g、磷酸氫二銨42g、硫酸鋅4. 5g、碳酸鈣25g，甜菜堿105g。 完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓力0. 10 0. 14MPa ；溫度120 122°C ；滅菌時間 32分鐘，冷卻并用無菌空氣保壓，壓力控制在0. 01-0. 02MPa，等待接種。
二級種子培養(yǎng)基制備過程在IOm3 二級種子罐中加入甜菜糖蜜4^ig、玉米漿 210L、甜菜堿3. 1kg、氧化鎂250g、磷酸氫二銨450g、硫酸鋅55g、碳酸鈣850g、5，6- 二甲基苯并咪唑750g、尿素45g。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓力0. 10 0. 14MPa ；溫度120 ；滅菌時間31分鐘，冷卻并用無菌空氣保壓，壓力控制在0.01-0. 02MPa，等待移種。發(fā)酵培養(yǎng)基制備過程在IOOm3發(fā)酵罐中加入甜菜糖蜜680kg、玉米漿3000L、5， 6- 二甲基苯并咪唑^cg、磷酸氫二銨40kg、硫酸鋅500g、碳酸鈣Ag、甘油磷酸50kg、氧化鎂4kg、氯化鈷100kg、尿素1kg，甜菜堿MOkg。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓力 0. 10 0. 14MPa ；溫度122 123°C ；時間38分鐘。冷卻，并用無菌空氣保壓，壓力控制在 0. 01-0. 02MPa，等待移種。一級種子培養(yǎng)過程控制將符合接種條件(無雜菌，OD為0. 211，搖瓶效價23%ig/ L)的脫氮假單胞桿菌母瓶種子在火焰保護下，由接種口接入母瓶種子，接種量控制在種子培養(yǎng)基體積的6. 2%,罐壓控制在0. 04 - 0. 05MPa ；罐溫四 33 °C ；空氣流量6. 3m3/h ；培養(yǎng)時間約為27. 2小時。種子培養(yǎng)基OD 0. 186 ；pH :7. 1。二級種子培養(yǎng)過程控制符合移種條件(無雜菌，OD為0. 186)的一級種子液由移種管道全部移入二級種子罐。培養(yǎng)條件罐壓0. 04 - 0. 05MPa ；罐溫四 32°C;空氣流量 7. 3m3/h ；培養(yǎng)時間74.訃。種子培養(yǎng)基OD :0. 313 ；pH :7. 2。發(fā)酵培養(yǎng)基過程控制將符合移種條件(無雜菌，OD為0. 313)的二級種子液由移種管道全部移入發(fā)酵罐。培養(yǎng)條件罐壓控制在0. 05 - 0. 06MPa ；罐溫30 33°C ；空氣流量:14m3A ；培養(yǎng)時間為189. 3h。補料控制發(fā)酵過程中進行補料，補料時加入甜菜糖蜜。發(fā)酵過程中每隔6 幾檢測總糖。當總糖含量低于7%進行補料。維持發(fā)酵液總糖含量控制在7 7. 5%。發(fā)酵結束，維生素B12發(fā)酵單位為16;3mg/L。
10
權利要求
1.一種脫氮假單胞菌發(fā)酵生產維生素B12的培養(yǎng)基，包括一級種子培養(yǎng)基、二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于上述一級種子培養(yǎng)基、二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中均含有人工糖蜜，該人工糖蜜是由麥芽糖、硫胺素、核黃素和生物素組成。
2.按照權利要求1所述的脫氮假單胞菌發(fā)酵生產維生素B12的培養(yǎng)基，其特征在于上述一級種子培養(yǎng)基的組成為麥芽糖2. 0 2. ^g/m3，硫胺素0. 007 0. 0(^kg/m3，核黃素 0.007 0.008 kg/m3，生物素 0. 007 0. 008kg/m3，5，6-二甲基苯并咪唑 0. 018 0. 022 kg/m3，硫酸鋅 0. 04 0. 05 kg/m3,氧化鎂 0. 018 0. 022kg/m3，玉米漿 14. 0 16. OL/m3， 磷酸氫二銨0. 040 0. 045 kg/m3,碳酸鈣0. 02 0. 03 kg/m3和甜菜堿0. 10 0. 11 kg/3m 。
3.按照權利要求1所述的脫氮假單胞菌發(fā)酵生產維生素B12的培養(yǎng)基，其特征在于上述二級種子培養(yǎng)基的組成為麥芽糖2. 6 2. Ag/m3，硫胺素0. 008 0. 0(Wkg/m3，核黃素 0. 008 0. 009 kg/m3,生物素 0. 008 0. 009kg/m3，5，6- 二甲基苯并咪唑 0. 07 0. 08kg/ m3,硫酸鋅 0. 005 0. 006kg/m3,氧化鎂 0. 02 0. 03kg/m3,玉米漿 20. 0 22. OL/m3,甜菜堿0. 30 0. 32kg/m3，磷酸氫二銨0. 04 0. 05kg/m3，碳酸鈣0. 08 0. 09kg/m3和尿素 0. 004 0. 005 kg/m3。
4.按照權利要求1所述的脫氮假單胞菌發(fā)酵生產維生素B12的培養(yǎng)基，其特征在于上述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為麥芽糖4. 2 4. 3kg/m3,硫胺素0. 013 0. 015kg/m3,核黃素0. 013 0.015 kg/m3，生物素 0.013 0.015 kg/m3, 5, 6-二甲基苯并咪唑 0. 09 0. 10kg/m3，甘油磷酸 0. 50 0. 55kg/m3，硫酸鋅 0. 005 0. 006 kg/m3,氯化鈷 0. 0001 0. 0002kg/m3,玉米菜 30. 0 32. OL/m3,碳酸鈣 0. 07 0. 08kg/m3,尿素 0. 01 0. 02kg/m3,磷酸氫二銨 0. 04 0. 06 kg/m3,甜菜堿 2. 4 2. 6kg/m3 和氧化鎂 0. 04 0. 06kg/m3。
5.一種利用權利要求1至4任意一項培養(yǎng)基的發(fā)酵方法，其工藝步驟包括1)一級種子培養(yǎng)首先將一級種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無菌空氣保壓，然后在火焰保護下，將已經培養(yǎng)好的脫氮假單胞菌母瓶種子接入其中進行培養(yǎng)，接種量控制在培養(yǎng)基體積的5 — 10% ；2)二級種子培養(yǎng)先將二級種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無菌空氣保壓，然后將一級種子液全部移入二級種子罐進行培養(yǎng)。3)發(fā)酵培養(yǎng)先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無菌空氣保壓，然后將二級種子液全部移入發(fā)酵罐進行培養(yǎng)。
6.按照權利要求5所述的發(fā)酵方法，其特征在于所述一級種子培養(yǎng)條件為罐壓 0. 04 0. 05MPa ；罐溫四 33°C ；空氣流量3 &ii7h ；培養(yǎng)時間20 30小時。
7.按照權利要求5所述的發(fā)酵方法，其特征在于所述二級種子培養(yǎng)條件為罐壓 0. 04 0. 05MPa ；罐溫四 33°C ；空氣流量3 &ii7h ；培養(yǎng)時間60 80小時。
8.按照權利要求5所述的發(fā)酵方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為罐壓0.05 0. 06MPa ；罐溫30 33°C ；空氣流量10 15m7h ；培養(yǎng)時間約為160 200小時。
9.按照權利要求8所述的發(fā)酵方法，其特征是在發(fā)酵過程中，當總糖含量低于7%時進行補料，補料時加入人工糖蜜，維持發(fā)酵液總糖含量控制在7 7. 5%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種脫氮假單胞菌發(fā)酵生產維生素B12的培養(yǎng)基及發(fā)酵方法及利用其生產維生素B12的方法，該培養(yǎng)基包括一級種子培養(yǎng)基、二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于上述一級種子培養(yǎng)基、二級種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中均含有人工糖蜜，該人工糖蜜是由麥芽糖、硫胺素、核黃素和生物素組成。本發(fā)明通過采用由麥芽糖、硫胺素、核黃素和生物素組成的人工糖蜜替代甜菜糖蜜，優(yōu)化其培養(yǎng)基配方，從而解決了因甜菜糖蜜質量不穩(wěn)定導致發(fā)酵效價波動范圍大的問題，并獲得了一種穩(wěn)定、有效地生產維生素B12的方法。本發(fā)明節(jié)約了原輔料用量，降低綜合成本，減少廢水排放。
文檔編號C12P19/42GK102453740SQ201110419838
公開日2012年5月16日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權日2011年12月15日
發(fā)明者任勇, 冷曉紅, 奇乃, 王友善, 董媛 申請人:寧夏多維藥業(yè)有限公司