專利名稱：用于增強(qiáng)免疫功能的乳桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于免疫功能增強(qiáng)劑，其可以增加人體干擾素的產(chǎn)生并增強(qiáng)人體免疫功能。
干擾素(IFN)由多種細(xì)胞產(chǎn)生，如白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，它在受病毒感染時產(chǎn)生并保護(hù)其它細(xì)胞不受病毒感染。因此，干擾素具有抑制病毒繁殖的作用。
幾種干擾素中，據(jù)報道IFN-α的產(chǎn)量在患癌癥、糖尿病、結(jié)核病等的病人中降低，產(chǎn)IFN-α的能力與對感染的敏感性成負(fù)性相關(guān)。
另外，還報道了IFN-γ的產(chǎn)量在癌癥病人中降低，而在患橋本氏病和自身免疫病等的病人中產(chǎn)量增高。
還已知IFN-γ的產(chǎn)生對人體免疫功能的貢獻(xiàn)不同于IFN-α的產(chǎn)生所反映的貢獻(xiàn)。
因此，產(chǎn)生IFN-α和IFN-γ的能力被作為評價人體免疫功能的有用參數(shù)。
增強(qiáng)這些免疫功能被認(rèn)為可改善免疫功能缺陷病人的一般狀況和生活質(zhì)量。
為了增強(qiáng)免疫功能，已建議服用IFN或使用強(qiáng)免疫增效劑如OK432。
已知自然殺傷細(xì)胞(NK)活性與癌癥病人狀況相關(guān)，眾所周知服用IFN可增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性。
但是，重復(fù)使用IFN或免疫增效劑如OK432發(fā)現(xiàn)會引起副作用。如內(nèi)環(huán)境紊亂、發(fā)熱和不適。
因此，不是服用IFN，而是發(fā)展了免疫功能增強(qiáng)劑，其可以提高人體內(nèi)干擾素的產(chǎn)生并增強(qiáng)免疫功能。實際上，已建議雙螺旋RNA、吡喃共聚物、陰離子高聚物和多種多糖(見日本專利公開No.Hei.3-9882)作為免疫功能增強(qiáng)劑。
但是，因為這些熟知的免疫功能增強(qiáng)劑不是人體中自然存在的，所以這些增強(qiáng)劑有毒性，當(dāng)用來治療感染或腫瘤時，在人體中可產(chǎn)生副作用。
本發(fā)明的一個目的是提供一種免疫功能增強(qiáng)劑，它可增加干擾素的產(chǎn)生并增強(qiáng)人體免疫功能。使用免疫功能增強(qiáng)劑可治療或預(yù)防感染和腫瘤。
在這一點上，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)了一種包括短乳桿菌凝結(jié)亞種(Lactobacillusbrevissubsp.coagulans)菌粉的免疫功能增強(qiáng)劑。
短乳桿菌凝結(jié)亞種菌粉可用例如以下步驟產(chǎn)生首先，作為乳桿菌(Lactobacillus)來源的起始菌種在25-35℃、100rpm速度攪拌下在下述培養(yǎng)基A、B或C中培養(yǎng)18-40小時。
然后，濃縮或離心培養(yǎng)液，再冷凍干燥為短乳桿菌凝結(jié)亞種菌粉。
培養(yǎng)基A①酵母膏0.5%②葡萄糖1.5%③磷酸二氫鉀0.5%④磷酸氫鈉2.0%⑤氯化鈉0.425%⑥氫氧化鈉0.0375%⑦脫脂黃豆提取物8.75%⑧碳酸鈣沉淀0.1%培養(yǎng)基B蛋白胨(polypeptone)0.5-1.0%酵母膏0.5-1.0%葡萄糖0.5-1.0%pH6.5-7.0培養(yǎng)基C酵母膏0.55%葡萄糖1.10%蛋白胨1.25%
磷酸二氫鈉0.025%磷酸氫鈉0.025%硫酸鎂0.01%硫酸錳0.0005%pH6.5-7.0制備培養(yǎng)基A時，組分①-⑦加熱下溶解在水中。然后，溶液中加入組分⑧后，調(diào)節(jié)溶液pH為6.8-7.0，再在121℃高壓蒸氣滅菌15分鐘。另外，脫脂黃豆提取物用下述步驟制備脫脂后，將黃豆浸在稀鹽酸(約0.25N)中，加入胃蛋白酶，然后混合物在不時攪拌下在37℃保持40-48小時消化。消化后，加入氫氧化鈉中和此溶液。然后離心此溶液，取出上清液作為脫脂黃豆提取物。
起始菌種最好從食物如乳桿菌(Tsukemono)發(fā)酵的蔬菜中得到。每種培養(yǎng)基A、B和C50l產(chǎn)生100-500g細(xì)菌粉末，其中每g含20-500億個細(xì)菌(2×109-5×1010/g)。
菌粉最好以粉末、片劑、膠囊或粒化粉末的形式口服給藥。
制備片劑時，菌粉可與L-谷氨酸鈉(10%)或與作為分散介質(zhì)的脫脂奶粉(10%)和L-谷氨酸鈉的混合物、及作為賦形劑的干馬鈴薯淀粉混合。
下面詳細(xì)描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。
起始菌種得自乳桿菌發(fā)酵的日本蕓苔屬Suigukina變種(Bras-sicaJaponicaVar.Suigukina)。起始菌種在25°-35℃下、在100rpm攪拌下，在培養(yǎng)基A中培養(yǎng)細(xì)菌30小時。然后約10000rpm離心培養(yǎng)液，并冷凍干燥成為細(xì)菌粉末，稱其為短乳桿菌PK。
用這種方法得到的細(xì)菌粉末具有下列乳桿菌特征的特性(1)-(6)，基于它具有示于下表1的酵解特征，此細(xì)菌粉末還被鑒定為短乳桿菌凝結(jié)亞種。
(1)它為革蘭氏陽性桿菌。
(2)它分解培養(yǎng)基中的碳酸鈣。
(3)它用培養(yǎng)基中的葡萄糖產(chǎn)生乳酸。
(4)還原硝酸鹽的能力為陰性。
(5)液化明膠的能力為陰性。
(6)消化酷蛋白的能力為陰性。
然后，將干馬鈴薯粉加到上述方法得到的菌粉中，并調(diào)節(jié)菌粉使其每g含108-109個細(xì)菌。再加入無水乳糖作為賦形劑。由此制備250mg的片劑。
每天年齡在25-65歲的4名健康男性和6名健康女性口服6個片劑，計4周。給藥前及給藥后2周和4周采外周血液于含肝素試管中。測定IFN-α和IFN-γ的產(chǎn)量、自然殺傷細(xì)胞(NK)活性和2-5A(2′，5′寡腺苷酸)合成活性，測定結(jié)果示于表2和表3。
IFN-α和-γ利用FL-細(xì)胞(來自人羊膜)和Sindobis病毒用50%CPE(細(xì)胞致病作用)的生物檢測方法進(jìn)行測定。
用于測定IFN-α的方法的一個例子描述如下肝素化外周血液用全血方法處理以產(chǎn)生IFN。然后離心管中收集2ml全血。加入HVJ(Sendai病毒)，其最終濃度為500HA/ml。37℃培養(yǎng)20小時，然后3，000rpm離心。收集上清液以測量IFN-α的產(chǎn)量。
下面描述用于測定IFN-γ的方法的一個例子肝素化外周血液在Eagle'sMEM中稀釋4倍，加入PHA-P(購自Sigma)使終濃度為25μg/ml。37℃培養(yǎng)48小時后，3，000rpm離心，收集上清液作為IFN-γ樣品。
在測定NK細(xì)胞活性時，用Ficoll-Paque方法從外周血中分離出外周單核細(xì)胞，這樣得到了效應(yīng)細(xì)胞。用Cr51標(biāo)記的K562細(xì)胞作為靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞以E/T(效/靶)比為20∶1進(jìn)行混合。用常規(guī)方法測定細(xì)胞毒性。
無刺激血漿中2-5A合成酶活性太低，檢測不出，用HVJ(Sendai病毒)刺激血漿20小時后測其2-5A合成酶活性，以評價IFN-α的產(chǎn)生能力。用放射免疫測定試劑盒(EikenChemicalCo.Tokyo生產(chǎn))測定2′，5′-寡腺苷酸(2-5A)合成酶活性。
從表2和表3所示結(jié)果可清楚看出，上述方法制備的菌粉提高了IFN-α的產(chǎn)量、NK細(xì)胞活性和2-5A合成酶活性。
另外，菌粉在給藥后，血液測試表明在任何個體中與標(biāo)準(zhǔn)值沒有大的差異。
表1
表2
表3
權(quán)利要求
1.組合物，其含有短乳桿菌凝結(jié)亞種菌粉。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述短乳桿菌凝結(jié)亞種菌粉每克含有2×109-5×1010個細(xì)菌。
3.權(quán)利要求1或2的組合物，其形成粉劑、片劑、膠囊或?；蹌?br> 4.權(quán)利要求1或2的組合物，其中短乳桿菌凝結(jié)亞種得自乳桿菌發(fā)酵的日本蕓苔屬Suigukina變種。
5.權(quán)利要求3的組合物，其中短乳桿菌凝結(jié)亞種得自乳桿菌發(fā)酵的日本蕓苔屬Suigukina變種。
6.增強(qiáng)病人免疫力的方法，其包括給需要這種治療的病人服用增強(qiáng)免疫力有效量的權(quán)利要求1的組合物。
7.增加人體內(nèi)IFN-α的產(chǎn)量的方法，其包括給人服用增加IFN-α產(chǎn)量有效量的權(quán)利要求1的組合物。
8.提高人體自然殺傷細(xì)胞活性的方法，其包括給人服用提高自然殺傷細(xì)胞活性有效量的權(quán)利要求1的組合物。
9.提高人體內(nèi)2-5A合成酶活性的方法，其包括給人服用提高2-5A合成酶活性有效量的權(quán)利要求1的組合物。
全文摘要
含有短乳桿菌凝結(jié)亞種的組合物用于增強(qiáng)病人的免疫功能，特別是關(guān)于增加干擾素的產(chǎn)生、2—5A合成酶活性和自然殺傷細(xì)胞活性。
文檔編號A61K39/02GK1105883SQ94101198
公開日1995年8月2日 申請日期1994年1月31日 優(yōu)先權(quán)日1994年1月31日
發(fā)明者岸田綱太郎 申請人:財團(tuán)法人京都巴斯德研究所, 信和藥品株式會社, 日東藥品工業(yè)株式會社