專利名稱：益生菌唾液乳桿菌菌株的制作方法
導(dǎo)言本發(fā)明涉及唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)菌株及其作為益生菌特別是作為免疫調(diào)節(jié)性生物治療劑的應(yīng)用。
保護人體胃腸道免于腸道細菌建群的防御機制非常復(fù)雜，包括免疫學(xué)和非免疫學(xué)兩方面(1)。先天的防御機制包括胃液的低pH，膽鹽，蠕動，粘液層和抗微生物化合物如溶菌酶(2)。免疫學(xué)機制包括在M細胞下面的特異的淋巴聚集，稱為淋巴集結(jié)，其遍布于小腸和結(jié)腸(3)。在這些部位存在的腔抗原(luminal antigen)刺激合適的T和B細胞亞群，導(dǎo)致細胞因子網(wǎng)絡(luò)建立及抗體分泌入胃腸道中(4)。另外，可以發(fā)生抗原呈遞經(jīng)上皮細胞至上皮內(nèi)淋巴細胞及至下面的固有層免疫細胞(5)。因此，宿主在胃腸道免疫學(xué)防御作用中投入了許多。然而，由于胃腸道粘膜是宿主與外部環(huán)境相互作用的最大表面，必須存在特異的控制機制以調(diào)節(jié)對平均一生壽命中由胃腸道處理的100噸食物的免疫應(yīng)答。另外，結(jié)腸腸道中定居有500個物種以上的1011-1012/g的細菌。因此，這些控制機制必須能將非病原性粘附細菌與對宿主造成明顯傷害的侵染病原體加以區(qū)分。事實上，通過與新吸收的潛在病原微生物競爭，腸內(nèi)菌群有助于宿主的防御作用。
存在于人體胃腸道中的細菌可以促進炎癥。對土著微生物區(qū)系的異常應(yīng)答與一些疾病狀態(tài)相關(guān)，如炎癥性腸病。與正常菌群相關(guān)的抗原通常產(chǎn)生免疫學(xué)耐受性，不能達到這種耐受性是粘膜炎癥的主要機制(6)。在IBD患者中這種耐受性破壞的跡象包括針對腸道菌群的抗體水平提高。
本發(fā)明涉及唾液乳桿菌菌株，其示出通過調(diào)節(jié)細胞因子水平或者通過拮抗促炎微生物并將其從胃腸道中清除而具有免疫調(diào)節(jié)作用。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，提供了一種唾液乳桿菌菌株，其選自AH102，AH103，AH105，AH109或AH110及其突變體或變體中的任一個或多個。
所述突變體可以是遺傳修飾的突變體。所述變體可以是唾液乳桿菌菌株的天然發(fā)生的變體。
在本發(fā)明的一個實施方案中，唾液乳桿菌菌株是活細胞形式?；蛘咄僖喝闂U菌菌株是非活細胞形式。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述菌株是生物學(xué)純培養(yǎng)物形式。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述唾液乳桿菌菌株分離自切除并洗滌的人體胃腸道。優(yōu)選地所述唾液乳桿菌菌株經(jīng)口服由人體攝取后具有明顯免疫調(diào)節(jié)作用。
本發(fā)明還提供了一種配方，其包含至少一種本發(fā)明的唾液乳桿菌菌株。該配方可以包含兩或多種乳桿菌菌株。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述配方包括另一種益生菌材料。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述配方包括一種益生素材料。
優(yōu)選地所述配方包括一種可攝食載體。所述可攝食載體可以是一種藥物學(xué)合適的載體如膠囊，片劑或粉末。優(yōu)選地所述可攝食載體是一種食品如酸奶(acidified milk)，酸乳酪，冷凍酸乳酪，奶粉，濃縮奶，奶酪，調(diào)味品(dressings)或飲料。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的配方進一步包含一種蛋白質(zhì)和/或肽，特別是有豐富谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白質(zhì)和/或肽，一種脂質(zhì)，一種碳水化合物，一種維生素，礦物質(zhì)和/或微量元素。
在本發(fā)明的一個實施方案中，配方中存在的唾液乳桿菌菌株超過106cfu/g輸送系統(tǒng)。優(yōu)選地所述配方包括佐劑，細菌成分，藥物本體(drug entity)或生物學(xué)化合物中的任一或多種。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述配方用于免疫和接種方案。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的唾液乳桿菌菌株或配方作為食品、藥物的應(yīng)用，及在預(yù)防和/或治療非所希望的炎性(undesirable inflammatoryactivity)中的應(yīng)用，在預(yù)防和/或治療非所希望的胃腸道炎性如炎癥性腸病如Crohns病或潰瘍性結(jié)腸炎、過敏性腸綜合征、囊炎(pouchitis)或感染后結(jié)腸炎中的應(yīng)用，在預(yù)防和/或治療胃腸道癌癥中的應(yīng)用，在預(yù)防和/或治療全身性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用，在預(yù)防和/或治療由非所希望的炎性導(dǎo)致的自身免疫疾病中的應(yīng)用，在預(yù)防和/或治療由非所希望的炎性導(dǎo)致的癌癥中的應(yīng)用，在預(yù)防癌癥中的應(yīng)用，在預(yù)防和/或治療由非所希望的炎性導(dǎo)致的腹瀉疾病如艱難梭菌(Clostridium difficile)相關(guān)的腹瀉、輪狀病毒相關(guān)的腹瀉或者感染后腹瀉中的應(yīng)用，在預(yù)防和/或治療感染因子如大腸桿菌導(dǎo)致的腹瀉疾病中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了唾液乳桿菌菌株或配方在制備一種用于預(yù)防和/或治療非所希望的炎性的抗炎生物治療劑中的應(yīng)用，或者在制備多種用于預(yù)防和/或治療非所希望的炎性的抗炎生物治療劑中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的菌株通過拮抗促炎微生物并將其從胃腸道中清除而起作用。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的唾液乳桿菌菌株或配方在制備用于降低促炎細胞因子如IL8的水平的抗炎生物治療劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了唾液乳桿菌菌株在制備用于調(diào)節(jié)細胞因子水平如IL-8、IL-10、IL-12、TNFα或IFNγ的抗炎生物治療劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了唾液乳桿菌菌株在制備用于改變IFNγ水平的抗炎生物治療劑中的應(yīng)用。優(yōu)選地，在這種情況中，所述菌株選自AH102、AH103或AH105中的任一種。
本發(fā)明還提供了唾液乳桿菌菌株在制備用于改變IL-10水平的抗炎生物治療劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了唾液乳桿菌菌株在制備用于改變IL-12水平的抗炎生物治療劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了唾液乳桿菌菌株在制備用于改變IL-8水平的抗炎生物治療劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了唾液乳桿菌AH110菌株在制備用于改變TNFα水平的抗炎生物治療劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了唾液乳桿菌菌株由于其拮抗病原體生長的能力而作為抗感染益生菌菌株的應(yīng)用。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)特定的乳桿菌菌株在體外激發(fā)免疫調(diào)節(jié)作用。
本發(fā)明因此在預(yù)防或治療免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)異常中具有重要的潛在治療價值，所述免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)異常如非所希望的炎癥反應(yīng)，例如炎癥性腸病。
所述菌株可以用作一組生物治療劑，從中可以加以選擇以改變IFNγ，TNFα，IL-8，IL-10和/或IL-12的水平。
本發(fā)明的菌株或配方可以用于預(yù)防和/或治療炎癥、免疫缺陷、炎癥性腸病、過敏性腸綜合征、癌癥(特別是胃腸道和免疫系統(tǒng)癌癥)、腹瀉、抗生素相關(guān)的腹瀉、兒童腹瀉、闌尾炎、自身免疫疾病、多發(fā)性硬化、Alzheimer’s病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腹腔疾病、糖尿病、器官移植、細菌感染、病毒感染、真菌感染、牙周病、泌尿生殖系疾病、性傳播疾病、HIV感染、HIV復(fù)制、HIV相關(guān)的腹瀉、外科手術(shù)相關(guān)的損傷、外科手術(shù)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移性疾病、敗血癥、體重減輕、厭食、發(fā)熱控制(fever control)、惡病質(zhì)、傷口愈合、潰瘍、腸屏障功能(gutbarrier function)、過敏反應(yīng)、哮喘、呼吸系病變、循環(huán)系病變、冠心病、貧血、凝血系統(tǒng)病變、腎病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變、肝病、局部缺血、營養(yǎng)失調(diào)、骨質(zhì)疏松、內(nèi)分泌失調(diào)、表皮病變、銀屑病和/或?qū)こｐ畀彙?br> 所述乳桿菌菌株是共生微生物。它們已經(jīng)從人胃腸道內(nèi)的微生物菌群中分離。胃腸道內(nèi)的免疫系統(tǒng)對這個菌群的成員不能具有明確的反應(yīng)，因為所產(chǎn)生的炎性也會破壞宿主細胞和組織功能。
因此，存在一些機制，借此免疫系統(tǒng)可以識別與病原性生物體不同的胃腸道菌群的共生非病原性成員。這保證了對宿主組織破壞是有限的并且一種防御屏障仍被保留。
唾液乳桿菌菌株AH102于2000年4月20日保藏在國家工業(yè)和海洋細菌保藏中心(National Collections of Industrial and MarineBacteria Limited，NCIMB)，保藏號NCIMB 41044。
唾液乳桿菌菌株AH103于2000年4月20日保藏在NCIMB，保藏號NCIMB 41045。
唾液乳桿菌菌株AH105于2000年4月20日保藏在NCIMB，保藏號NCIMB 41047。
唾液乳桿菌菌株AH109于2001年3月22日保藏在NCIMB，保藏號NCIMB 41093。
唾液乳桿菌菌株AH110于2001年3月22日保藏在NCIMB，保藏號NCIMB 41094。
唾液乳桿菌菌株可以是遺傳修飾的突變體或者可以是其天然發(fā)生的變體。
優(yōu)選地，唾液乳桿菌菌株是活細胞形式?；蛘?，唾液乳桿菌菌株可以是非活細胞形式。
本發(fā)明的特異的唾液乳桿菌菌株可以以在常規(guī)制品中的口服可攝入形式給予動物(包括人)，如膠囊，微膠囊，片劑，顆粒，粉末，錠劑，丸劑，栓劑，懸浮液及糖漿。合適的配方可以使用常規(guī)的有機和非有機添加劑通過常用方法制備。藥物組合物中活性成分的量可以呈實現(xiàn)希望的治療作用的水平。
所述配方還包括一種細菌成分，一種藥物本體或一種生物學(xué)化合物。
另外，包含本發(fā)明一或多種菌株的疫苗可以使用任何合適的已知方法制備，并可以包括一種藥物學(xué)可接受的載體或佐劑。
在本說明書中，術(shù)語突變體，變體及遺傳修飾的突變體包括一種唾液乳桿菌菌株，其遺傳和/或表型性質(zhì)與親代菌株相比發(fā)生變化。唾液乳桿菌菌株的天然發(fā)生的變體包括選擇性分離的目標性質(zhì)自發(fā)變化，而親代菌株性質(zhì)的預(yù)定變化可通過常規(guī)遺傳處理方法實現(xiàn)，如基因破壞，接合轉(zhuǎn)移等。
附圖簡述

圖1是示出使用人胃腸道上皮細胞CaCo-2和HT-29，每20個上皮細胞粘附的細菌數(shù)的條形圖。
圖2是示出在與唾液乳桿菌菌株共溫育后PBMC誘導(dǎo)的IFNγ水平的條形圖。
圖3是示出在與唾液乳桿菌菌株共溫育后對PBMC產(chǎn)生IL-10(pg/ml)的水平的作用的條形圖。
圖4是示出唾液乳桿菌菌株對PBMC的IL-12產(chǎn)量(pg/ml)的作用的條形圖。
圖5是示出唾液乳桿菌菌株對PMBC的IL-8產(chǎn)量(pg/ml)的作用的條形圖。
圖6是示出唾液乳桿菌菌株調(diào)節(jié)促炎細胞因子產(chǎn)生的能力的條形圖，以pg/ml測定。
詳細描述我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)唾液乳桿菌菌株AH102，AH103，AH105，AH109和AH110不僅是酸和膽汁耐受的并附著于人小腸細胞系，而且令人驚訝地具有免疫調(diào)節(jié)作用，所述免疫調(diào)節(jié)作用通過調(diào)節(jié)細胞因子水平或通過拮抗及從胃腸道中排除促炎或免疫調(diào)節(jié)微生物而進行。
益生菌一般是以活細胞形式應(yīng)用。然而，其還可以擴展為非活細胞如滅活培養(yǎng)物或含有由益生菌表達的有益因子的組合物。這可以包括加熱滅活微生物或者通過改變pH或加壓而滅活的微生物。非活細胞產(chǎn)物的制備較簡便，細胞可以簡易地摻入藥物中，而且貯存要求比活細胞更不受限。Lactobacillus casei YIT 9018提供了有效應(yīng)用熱滅活的細胞治療和/或預(yù)防腫瘤生長的方法實例，如美國專利No.US4347240所述。
目前還未知是否需要完整細菌發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用或者本發(fā)明的各個活性成分是否能單獨利用。已經(jīng)鑒別了某些細菌菌株的促炎成分。革蘭氏陰性菌的促炎作用是通過脂多糖(LPS)介導(dǎo)的。LPS單獨能誘導(dǎo)一個促炎網(wǎng)絡(luò)，部分是由于LPS與單核細胞上的CD14受體結(jié)合所致。推測益生菌的成分具有免疫調(diào)節(jié)活性是由于整個細胞的作用所致。在分離這些成分時采取藥物級操作。
白細胞介素-8(IL-8)是包含巨噬細胞炎性蛋白(MIP)家族的細胞因子的一種。MIP-1和MIP-2家族代表一組蛋白質(zhì)，其是白細胞和成纖維細胞的趨化因子。這個家族的蛋白質(zhì)也稱為intercrines，因為除了巨噬細胞之外的細胞也可合成它們。這些細胞包括T細胞和B細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、角質(zhì)細胞、平滑肌細胞、滑膜細胞、嗜中性粒細胞、軟骨細胞、肝細胞、血小板和腫瘤細胞。MIP-1α、MIP-1β、結(jié)締組織激活蛋白(CTAP)、血小板因子4(PF4)和IL-8刺激嗜中性粒細胞趨化。單核細胞趨化蛋白(MCP-1)和RANTES是單核細胞趨化性的，IL-8是嗜中性粒細胞和淋巴細胞趨化性的，而PF4和CTAP是成纖維細胞趨化性的。針對這些家族成員中的一些已經(jīng)描述了除了趨化性之外的作用。MCP-1刺激單核細胞細胞靜止活性及超氧化物陰離子釋放。CTAP和PF4提高成纖維細胞增殖，IL-8提高血管通透性，而MIP-1α和MIP-1β是熱原性的。IL-8直接參與胃腸道內(nèi)的炎性應(yīng)答。刺激IL-8(及其它促炎細胞因子)易引起胃腸道損害發(fā)展，因此重要的是益生菌應(yīng)不刺激這種細胞因子產(chǎn)生。
IL-10由T細胞，B細胞，單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生。這種細胞因子增加B細胞增殖及分化為分泌抗體的細胞。IL-10主要呈現(xiàn)抗炎活性。其通過正調(diào)節(jié)單核細胞表達IL-1RA，并抑制大多數(shù)單核細胞炎性。IL-10抑制單核細胞產(chǎn)生細胞因子、活性氧和氮中間體，MHCII類表達，殺滅寄生蟲及通過反饋機制產(chǎn)生IL-10(7)。這種細胞因子還示出通過干擾PGE2-cAMP依賴性途徑而阻斷單核細胞產(chǎn)生腸膠原酶和IV型膠原酶，并因此可以是慢性炎癥疾病中見到的結(jié)締組織破壞的重要調(diào)節(jié)因子。
IL-12是一種70kD的異源二聚體蛋白，由兩個共價連接的35kD和40kD的鏈組成。其在炎癥級聯(lián)早期主要由抗原呈遞細胞產(chǎn)生，如巨噬細胞。胞內(nèi)細菌刺激IL-12高水平產(chǎn)生。其是IFNγ產(chǎn)生的強力誘導(dǎo)物及是天然殺傷細胞的激活物。IL-12是產(chǎn)生細胞介導(dǎo)的或者Th1免疫應(yīng)答所必需的關(guān)鍵細胞因子之一，主要通過其引發(fā)細胞高產(chǎn)IFNγ的能力而起作用(8)。IL-12誘導(dǎo)IL-10產(chǎn)生，其反饋抑制IL-12產(chǎn)生，因此限制不受控制的細胞因子產(chǎn)生。TGF-β也負調(diào)節(jié)IL-12產(chǎn)生。IL-4和IL-13對IL-12的產(chǎn)生可具有刺激或抑制作用。IL-12的體內(nèi)抑制在治療Th1相關(guān)的炎癥如多發(fā)性硬化中可具有一些治療價值(9)。
干擾素γ(IFNγ)主要是激活的T淋巴細胞的產(chǎn)物，而且其大小由于可變糖基化而在20-25kD范圍內(nèi)。這種細胞因子與其它細胞因子協(xié)同導(dǎo)致更強力刺激單核細胞，巨噬細胞，嗜中性粒細胞和內(nèi)皮細胞。IFNγ還通過增加細胞因子產(chǎn)生而增強單核細胞和巨噬細胞誘導(dǎo)脂多糖(LPS)(10)，提高活性中間體釋放，吞噬作用和胞毒性。IFNγ誘導(dǎo)或增強主要組織相容性復(fù)合物II類(MHC II類)抗原在單核細胞及上皮，內(nèi)皮和結(jié)締組織來源的細胞上的表達。這樣使炎癥組織內(nèi)細胞的抗原更高地呈遞給免疫系統(tǒng)。IFNγ也可以具有抗炎作用。這種細胞因子抑制磷脂酶A2，從而降低單核細胞產(chǎn)生PGE2和膠原酶(11)。IFNγ還可以調(diào)節(jié)TGFβ，TNFα和C5a的單核細胞和巨噬細胞受體表達(11)，從而有助于這種細胞因子的抗炎性質(zhì)。益生菌對這種細胞因子的刺激根據(jù)宿主的當前炎癥狀態(tài)、其它細胞因子的刺激及給藥途徑可在體內(nèi)有不同作用。
TNFα是一種促炎細胞因子，其介導(dǎo)在炎癥應(yīng)答期間見到的許多局部和全身作用。這種細胞因子主要是單核細胞或巨噬細胞衍生的產(chǎn)物，但其它類型細胞包括淋巴細胞，嗜中性粒細胞，NK細胞，肥大細胞，星形膠質(zhì)細胞，上皮細胞，內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞也可以合成TNFα。TNFα作為激素原合成并在加工之后觀測到17.5kD的成熟產(chǎn)物。純化的TNFα已經(jīng)觀測到呈二聚體，三聚體和五聚體形式，推測三聚體形式在體內(nèi)是活性形式。已經(jīng)鑒別了TNFα的三個受體，一個可溶受體似乎具有TNFα抑制劑功能(12)，而另兩個膜結(jié)合形式經(jīng)鑒別分子大小分別為60和80kDa。在炎性部位局部產(chǎn)生TNFα可由內(nèi)毒素誘導(dǎo)，而糖皮質(zhì)激素地塞米松抑制細胞因子產(chǎn)生(13)。TNFα產(chǎn)生引起許多類型細胞的刺激。明顯的抗病毒作用可在TNFα處理的細胞系中觀測到(14)，IFN與TNFα協(xié)同增強這種作用。內(nèi)皮細胞受刺激產(chǎn)生前凝血劑活性，粘附分子、IL-1、造血生長因子、血小板激活因子(PAF)和花生四烯酸代謝物表達。TNFα刺激嗜中性粒細胞粘附，吞噬，脫粒(15)，活性氧中間體產(chǎn)生，并可以影響細胞遷移。GM-CSF，TGFβ，IL-1，IL-6，PGE2及TNFα自身的白細胞合成均可在給予TNFα?xí)r被刺激(16，17)。編程性細胞死亡(細胞凋亡)在單核細胞中可被延遲(18)，同時對成纖維細胞的作用包括促進趨化及IL-6，PGE2和膠原酶合成。盡管局部TNFα產(chǎn)生促進傷口愈合和免疫應(yīng)答，但TNFα的未調(diào)節(jié)的全身釋放可具有嚴重毒性作用如觀測到惡病質(zhì)，發(fā)熱和急性期蛋白產(chǎn)生(19)。
通過以下實施例可以更清晰理解本發(fā)明。
實施例1鑒定從切除并加以洗滌的人胃腸道中分離的細菌，表明益生菌性狀分離益生菌對在重建手術(shù)期間獲得的人闌尾和胃腸道(G.I.T)的大腸和小腸切片進行篩選以獲得益生菌菌株。在手術(shù)后將所有樣品立即貯存在一80℃無菌容器中。
將冷凍的組織解凍，稱重并置于半胱氨酸化(0.05％)的1/4強度的Ringer’s溶液中。輕輕搖動樣品以除去松散地粘附的微生物(稱為洗滌“W”)。在移至另一Ringer’s溶液之后，將樣品渦旋7分鐘以除去緊密粘附的細菌(稱為樣品“S”)。為分離組織包埋的細菌，將樣品356，176和A也在Braun攪拌機中均質(zhì)(稱為勻漿“H”)。將該溶液系列稀釋并涂布(100μl)于以下瓊脂培養(yǎng)基上RCM(強化梭菌培養(yǎng)基)及用乙酸調(diào)節(jié)為pH5.5的RCM；TPY(類胰蛋白酶，蛋白胨和酵母膏)；MRS(deMann，Roogosa和Sharpe)；ROG(Rogosa的乙酸鹽培養(yǎng)基(SL))；LLA(Lapiere的肝乳糖瓊脂)；BHI(腦心浸液瓊脂)；LBS(乳桿菌選擇性瓊脂)及TSAYE(補加0.6％酵母膏的胰化蛋白胨大豆糖)。還使用了補加丙酸的TPY和MRS瓊脂。除了TPY瓊脂之外，所有瓊脂培養(yǎng)基均由Oxoid Chemicals提供。將平板在厭氧瓶(BBL，Oxoid)中，使用CO2產(chǎn)生試劑盒(Anaerocult A，Merck)，在37℃溫育2-5天。
將革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的桿狀或二叉/多形細菌分離株在復(fù)合的非選擇性培養(yǎng)基(MRS和TPY)上劃線純化。將分離株在MRS或TPY培養(yǎng)基(除非特別指定)中在37℃在厭氧條件下常規(guī)培養(yǎng)。將預(yù)測的乳桿菌在40％甘油中貯存于-20℃和-80℃。
對取自G.I.T.的7個組織切片篩選屬于乳桿菌屬的菌株的存在情況。在組織樣品之間有一些變化。表1示出了組織樣品的細菌計數(shù)，以菌落形成單位/g(cfu/ml)組織表示。
表1組織樣品編號分離 A176 356 312 316 423433培養(yǎng)基“洗滌”溶液MRS57×102＞9.0×1033.3×103＞3.0×1040 3.2×1038.0×102TPYP 0＞9.0×103＞6.0×103＞3.0×1040 1.9×1022.8×102RCM5.5 003.1×1021.8×104ND3.0×1018.0×102ROG0＞9.0×103＞6.0×1037.7×1023.8×1029.7×1014.0×101TSAYE 3.9×102＞9.0×103＞6.0×103ND NDNDNDLLA2.5×102＞9.0×103＞6.0×103ND 5.3×102NDNDRCMND ND ND ＞3.0×104ND4.8×1034.6×103“樣品”溶液MRS1.35×103＞9.0×103＞6.0×1031.66×1042.3×102＞1.0×1049.6×102TPYP 0＞9.0×103＞6.0×103＞3.0×1044.6×1020 8.0×103RCM5.5 0＞9.0×103＞6.0×1031.7×103ND1.1×1031.5×103ROG1.37×102＞9.0×103＞6.0×1034.4×1024.5×1031.7×1036.1×103TSAYE 1.4×103＞9.0×103ND ND NDND NDLLA6.3×102＞9.0×103＞6.0×103ND 3.0×102ND NDRCMNDND ND ＞3.0×104ND ＞1.0×104ND“勻漿”溶液MRS00 ＞6.0×103TPYP 00 ＞6.0×103RCM5.5 00 2.5×102ROG00 ＞6.0×103TSAYE 3.9×1010 ＞6.0×103LLA1.9×1016.57×102＞6.0×103RCM00 NDND未測定樣品A(回腸)和316(闌尾)具有最低計數(shù)，大約為每克組織102個分離的細胞。相比之下，從其它樣品中回收103cfu/g組織以上細胞。在“洗滌”和“樣品”步驟期間分離相似數(shù)目的細菌，在433(回腸-盲腸)的“樣品”溶液中計數(shù)略高。
發(fā)酵及生長特性使用LKB Bromma，Aminex HPX-87H高效液相層析柱，檢測碳水化合物葡萄糖的代謝及隨后的有機酸終產(chǎn)物。將該柱保持在60℃，流速為0.6ml/分鐘(恒壓)。使用的HPLC緩沖液為0.01N H2SO4。在分析之前，將該柱用10mM檸檬酸鹽，10mM葡萄糖，20mM乳酸鹽和10mM乙酸鹽作為標準校準。將培養(yǎng)物在修飾的MRS肉湯中(乳桿菌菌株)，在37℃厭氧繁殖1-2天。在14000g離心10分鐘后，將上清用HPLC緩沖液1∶5稀釋，并取200μl在HPLC中分析。所有上清均以一式兩份進行分析。
確定細菌分離株的生物化學(xué)和生理性狀以助于鑒別。分析硝酸鹽還原作用，吲哚形成及β-半乳糖苷酶活性表達情況。確定在15℃和45℃這兩個溫度下的生長狀況，在存在濃度增加直至5.0％的NaCl的情況下的生長狀況及在明膠上的蛋白酶活性。對菌株在石蕊牛奶中的生長特性也加以確定。
從不同的樣品中選擇大約1500個過氧化氫酶陰性細菌分離株，根據(jù)其革蘭氏反應(yīng)，細胞大小和形態(tài)，在15℃和45℃下的生長狀況及從葡萄糖發(fā)酵的終產(chǎn)物加以鑒定(數(shù)據(jù)未示出)。測試的分離株中有60％以上是革蘭氏陽性的以四個一組、鏈或分叉形式排列的同型發(fā)酵球菌(HOMO-)。18％的分離株是革蘭氏陰性桿菌和異型發(fā)酵球桿菌(HETERO-)。剩余的分離株(22％)主要是同型發(fā)酵球桿菌。對38個菌株加以更詳盡鑒定，其中樣品433鑒定13株，樣品423鑒定4株，樣品312鑒定8株，樣品356鑒定9株，樣品176鑒定3株及樣品316鑒定1株。所有測試的38個分離株的硝酸鹽還原作用及從色氨酸中產(chǎn)生吲哚均是陰性的。記錄在不同溫度，NaCl濃度下的生長和明膠水解，如下表2所示。
表2菌株 來源發(fā)酵模式 溫度曲線 ％NaCl*明膠水解 石蕊牛奶中的反應(yīng)15℃ 45℃ pH**REDnAH102 S1 ROG HOMO- +(s) -3.0 -6.3 NRAH103 S1 HETERO- - -3.0 -5.2 RpCpRCM5.5AH105 S1 HOMO- - -0.8 -4.9 RpCpMRSPAH109 S1 TPY HOMO- - -5.0 -6.0 NRAH110 S1 ROG HOMO- - -5.0 -4.9 RpCpHOMO-，同型發(fā)酵；HETERO-，異型發(fā)酵；-，反應(yīng)/生長陰性；+，反應(yīng)/生長陽性；+(s)，緩慢生長；REDn，還原；NR，無反應(yīng)；Rp，部分還原；Cp，部分凝固；*所述菌株能生長的NaCl最大濃度**在37℃于石蕊牛奶中溫育24小時后的pH菌種鑒別使用API 50CHL(BioMerieux SA，法國)通過乳桿菌的碳水化合物發(fā)酵分布圖試驗性鑒別乳桿菌菌種。離心收獲過夜MRS培養(yǎng)物并再懸浮于所述試劑盒提供的懸浮培養(yǎng)基中。根據(jù)廠商指導(dǎo)接種API條帶并加以分析(在24和48小時后)。然后通過總細胞蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(SDS-PAGE)檢測乳桿菌菌種(Bruno Pot，Ghent大學(xué)，Belgium，私人交流)。最后，使用16s RNA分析及ribotyping證實菌株身份。
API 50CHL可以快速鑒別乳桿菌分離株。通過SDS-PAGE，16sRNA分析及ribotyping對乳桿菌菌種的總細胞蛋白進行的分析揭示了所述特異菌種的進一步信息(Bruno Pot，個人信息)。下表3示出通過4種不同的方法對五個乳桿菌菌株的鑒別。
表3菌株糖發(fā)酵分布圖 總細胞蛋白 16s RNA分析 Ribotyping(SDS-PAGE)*AH102 L.salivarius L.salivariusL.salivarius L.salivariussubsp.salivarius subsp.saliciniusAH103 L.salivarius L.salivariusL.salivarius L.salivariussubsp.salivarius subsp.saliciniusAH105 L.salivarius L.paracasei L.salivarius L.salivariussubsp.paracaseiAH109 L.salivarius L.salivariusL.salivarius L.salivariussubsp.salivarius subsp.saliciniusAH110 L.salivarius L.salivariusL.salivarius L.salivariussubsp.salivarius subsp.salicinius酶活性譜使用API ZYM系統(tǒng)(BioMerieux，法國)半定量測定乳桿菌分離株產(chǎn)生的組成型酶。得自晚期對數(shù)生長期的細菌細胞通過在14000g離心10分鐘而收獲。洗滌沉淀的細胞并再懸浮于50mM磷酸鹽緩沖液(pH6.8)中至相同的光密度。根據(jù)廠商指導(dǎo)接種該條帶，在37℃溫育4小時并記錄顏色產(chǎn)生情況。
5個菌株AH102，AH103，AH105，AH109和AH110的酶活性譜示于下表4。無一菌株呈現(xiàn)脂酶，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，α-葡糖醛酸糖苷酶，α-甘露糖苷酶或α-巖藻糖苷酶活性。
表4
抗生素敏感性譜(profile)所述分離株的抗生素敏感性譜使用“圓盤敏感性”分析確定。將培養(yǎng)物在合適的肉湯培養(yǎng)基中生長24-48小時，涂布(100ul)于瓊脂培養(yǎng)基上，并將含有已知濃度抗生素的圓盤置于該瓊脂上。在厭氧條件下在37℃溫育1-2天后，檢測菌株的抗生素敏感性。如果觀測到1mm或更大的抑制圈，則認為菌株是敏感的。
使用人體臨床重要的抗生素確定5個乳桿菌菌株的抗生素敏感性(μg/ml)譜。測試的每種乳桿菌均對氨芐青霉素，阿莫西林(amoxacillin)，ceftaxime，頭孢曲松(ceftriaxone)，環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)，頭孢拉定(cephradine)，利福平和氯霉素敏感。唾液乳桿菌AH102，AH103，AH105，AH109和AH110的抗生素敏感性(μg/ml)如下表5所示。
表5
R，抗性；S，敏感的；ND，未測定乳桿菌在低pH情況下的生長通過經(jīng)鼻飼胃管(Mercy醫(yī)院，Cork，Ireland)抽吸從健康人體中獲得胃液。將其在13000g立即離心30分鐘以除去所有固體顆粒，通過0.45μm和0.2μm濾膜過濾滅菌，分成40ml等份貯存在4℃和-20℃。
在實驗應(yīng)用之前，測定樣品的pH和胃蛋白酶活性。胃蛋白酶活性使用定量血紅蛋白分析測定。簡而言之，將等份胃液(1ml)加入5ml底物(0.7M脲，0.4％(w/v)牛血紅蛋白(Sigma Chemical Co.)，0.25M KCl-HCl緩沖液，pH2.0)中，在25℃溫育。以0，2，4，6，8，10，20和30分鐘間隔取出樣品。加入5％三氯乙酸(TCA)終止反應(yīng)及不攪動靜止30分鐘。然后將分析混合物過濾(Whatman，no.113)，在14000g離心15分鐘，測定在280nm的吸光度。1單位的胃蛋白酶活性是指使用血紅蛋白作為底物，測定TCA可溶產(chǎn)物在pH2.0每分鐘提高A280nm 0.001單位所需要的酶的量。
為確定乳桿菌菌株在低pH值的生長狀況與在胃中發(fā)現(xiàn)的那些生長狀況是否相等，將過夜培養(yǎng)物接種于(1％)新鮮MRS肉湯中，并用1N HCl將pH調(diào)節(jié)為4.0，3.0，2.0和1.0。在定期間隔取等份(1.5ml)，測定在600nm的光密度(OD600)，并使用平板計數(shù)方法計算菌落形成單位/ml(cfu/ml)。在24-48小時期間監(jiān)測生長。
使用兩種分析研究菌株在體外在低pH下的存活力(a)從新鮮過夜培養(yǎng)物中收集細胞，在磷酸鹽緩沖液(pH6.5)中洗滌兩次并再懸浮于MRS肉湯中，用1N HCl將pH調(diào)節(jié)為3.5，3.0，2.5和2.0，至乳桿菌終濃度為大約108cfu/ml。在37℃溫育并在5，30，60和120分鐘間隔使用平板計數(shù)方法測定存活力。
(b)將乳桿菌在緩沖的MRS肉湯(pH6.0)中繁殖5天。收獲細胞，洗滌并再懸浮于pH經(jīng)調(diào)節(jié)的MRS肉湯中，使用平板計數(shù)方法在2小時的時間測定存活力。
為確定乳桿菌菌株在經(jīng)過胃后的存活力，使用人胃液進行源于體內(nèi)的分析。從新鮮過夜培養(yǎng)物中收獲細胞，在緩沖液(pH6.5)中洗滌兩次并再懸浮于人胃液中，終濃度根據(jù)菌株為106-108cfu/ml。在37℃溫育30-60分鐘期間監(jiān)測存活力。使用pH≈1.2(未調(diào)節(jié)的)和pH2.0和pH2.5(用1N NaOH調(diào)節(jié))的胃液進行試驗。
每種乳桿菌菌株在pH6.8和pH4.5均正常生長，在8小時后達到穩(wěn)定期，倍增時間為80-100分鐘。在pH3.5生長受限，倍增時間提高至6-8小時。在pH2.5或更低值觀測無生長，因此檢測該菌株在低pH的存活力。
每種乳桿菌菌株對pH3.5，3.0和2.5均有抗性，唾液乳桿菌AH102和AH105在pH2.0也呈現(xiàn)抗性(數(shù)據(jù)未示出)。
為確定乳桿菌菌株在人胃中遇到的條件下的存活力，在pH1.2和pH2.5的人胃液中測試5個菌株的存活能力，如表6所示。存活力以log10cfu/ml表示(nd＝未確定)。
表6時間(分鐘)菌株 pH 05 3060乳桿菌AH102 1.2 9.16 8.846.81 nd2.5 9.49 9.349.53 9.25AH103 1.2 9.17 8.773.30 nd2.5 9.73 9.719.50 9.44AH105 1.2 9.38 9.005.87 nd2.5 9.69 9.499.62 9.51AH109 1.2 9.79 8.714.20 nd2.5 9.76 9.599.68 9.72AH110 1.2 9.49 8.846.81 nd2.5 9.77 9.659.39 9.59培養(yǎng)物在存在膽汁的條件下的生長將新鮮培養(yǎng)物在補加牛膽汁(B-8381，Sigma Chemical有限公司，Poole)和豬膽汁(B-8631，Sigma Chemical有限公司，Poole)的MRS瓊脂平板上劃線，所述牛膽汁的濃度為0.3，1.0，1.5，5.0和7.5％(w/v)，所述豬膽汁濃度為0.3，0.5，1.0，1.5，5.0和7.5％(w/v)。將平板在37℃在厭氧條件下溫育，并記錄24-48小時后生長狀況。
將從一些人膽囊中分離的膽汁樣品在使用之前貯存在-80℃。為進行實驗研究，將樣品解凍，集合并在80℃滅菌10分鐘。人膽汁的膽汁酸組分使用反相高效液相層析(HPLC)組合Dekker等所述方法(20)的脈沖電流檢測儀確定。將人膽汁以0.3％(w/v)濃度加入MRS/TPY瓊脂培養(yǎng)基中。在24和48小時后檢測新鮮劃線培養(yǎng)物的生長。
人膽囊膽汁的膽汁酸濃度為50-100mM，在小腸中稀釋后濃度降低至5-10mM。另外，在生理條件下，膽汁酸以鈉鹽形式存在。因此，篩選培養(yǎng)物在含有以下每種膽汁酸的鈉鹽(Sigma Chemical有限公司，Poole)的MRS瓊脂平板上的生長(a)綴合形式?；悄懰?TCA)；甘氨膽酸(GCA)；?；敲撗跄懰?TDCA)；甘氨脫氧膽酸(GDCA)；牛磺鵝脫氧膽酸(TCDCA)和甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)；(b)早期解離(deconjugated)形式石膽酸(LCA)；鵝脫氧膽酸(CDCA)；脫氧膽酸(DCA)和膽酸(CA)。針對每種膽汁酸，使用濃度為1，3和5mM。在厭氧溫育24和48小時后，記錄生長狀況。
使用定性(瓊脂平板)和定量(HPLC)這兩種分析確定每個菌株的早期解離活性。
平板分析將所有培養(yǎng)物在補加(a)0.3％(w/v)豬膽汁，(b)3mM TDCA或者(c)3mM GDCA的MRS瓊脂平板上劃線培養(yǎng)。在集落周圍出現(xiàn)不透明的沉淀物作為觀測到早期解離的標示。
高效液相層析(HPLC)使用HPLC進行人膽汁早期解離的體外分析。簡而言之，將過夜培養(yǎng)物接種于(5％)補加0.3％(w/v)人膽汁的MRS肉湯中，在37℃厭氧溫育。在24小時溫育期間以不同間隔取樣品(1ml)，在14000rpm離心10分鐘。然后將未稀釋的無細胞上清(30μl)通過HPLC進行分析。
唾液乳桿菌AH102，AH103，AH105，AH109和AH110能在所使用的三種來源的膽汁中生長(膽汁酸抗性)。觀測到對牛膽汁的抗性大大高于對豬膽汁的抗性。每種乳桿菌菌株對濃度直至并包括5.0％的牛膽汁有抗性(數(shù)據(jù)未示出)。
豬膽汁更具抑制性，如下表7所示。
表7
不管在存在牛和豬這兩種膽汁的情況下膽汁抗性譜如何，每個乳桿菌菌株在0.3％(v/v)生理濃度的人膽汁中均生長至鋪滿(數(shù)據(jù)未示出)。
當特異性分析對各種膽汁酸的抗性時，每個乳桿菌菌株在存在?；撬峋Y合的膽汁酸的情況下均生長良好，在含有直至并包括5mM?；撬峋Y合物TCA，TDCA和TCDCA的瓊脂培養(yǎng)基上，每個乳桿菌分離株均生長至鋪滿。測試的甘氨酸綴合物中，GCDCA一般是最具抑制性的。在三種甘氨酸綴合物中GDCA抑制性略低，GCA抑制性最低。每個菌株在補加5mM GCA的瓊脂培養(yǎng)基上均生長，如下表8所示。
表8
-無生長；+鋪滿生長對在存在早期解離的膽汁酸的情況下的生長狀況也進行測試。每個菌株均對5mM LCA抗性。對在存在CA的情況下的生長狀況也進行測試。如下表9所示，5個菌株中有3個，即AH102，AH105和AH109在存在1mM CA的情況下生長。在存在1mM CDCA的情況下沒有菌株可以生長(數(shù)據(jù)未示出)。
表9菌株 膽酸0 1 3 5乳桿菌AH102 + + - -AH103 + - - -AH105 + + - -AH109 + + - -AH110 + - - -檢測抗微生物活性使用指定方法檢測抗微生物活性(21)。在初始篩選中使用的指示微生物是L.innocua，L.fermentum KLD，P.flourescens和大腸桿菌V157。簡而言之，將乳桿菌(MRS)分別溫育12-16小時和36-48小時。將10倍系列稀釋液涂布于(100μl)MRS/TRY瓊脂培養(yǎng)基上。在過夜溫育后，將具有獨特菌落的平板用指示菌覆蓋。指示菌菌苔通過用2％(v/v)過夜指示菌培養(yǎng)物接種一層熔融覆蓋物而制備，所述接種的熔融覆蓋物傾注于接種的MRS平板表面上。將該平板在適于指示菌生長的條件下再溫育過夜。觀測到半徑大于1mm的抑制帶的指示菌培養(yǎng)物被認為對測試細菌敏感。
由于噬菌體活性所致的抑制通過上下翻轉(zhuǎn)接種的MRS/TPY瓊脂平板及用指示菌覆蓋而除去。噬菌體不通過瓊脂擴散。
篩選唾液乳桿菌AH102，AH103，AH105，AH109和AH110菌株的抑制活性，使用Ls.innocua，L.fermentum KLD，P.flourescens和大腸桿菌作為指示微生物。當測試菌株接種于未緩沖的MRS上時，觀測四個指示菌的抑制情況。測定大小為1mm-5mm的條帶。每個乳桿菌對Ls.innocua的抑制均產(chǎn)生最大的條帶。
實施例2益生菌與胃腸道上皮細胞的粘附粘附分析使用對前述方法加以修改的形式進行益生菌菌株粘附(22)。在無菌22m2玻璃蓋片上制備單層的HT-29和Caco-2細胞，濃度為4×104個細胞/ml，將玻璃蓋片置于Corning組織培養(yǎng)皿中。將細胞每兩天補充一次新鮮培養(yǎng)基。在大約10天及發(fā)生單層分化后，將該單層用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌兩次。在每個培養(yǎng)皿中加入無抗生素的DMEM(2ml)及2ml含有109cfu/ml的約18小時乳桿菌懸浮液，并將細胞在含有5％CO2的潮濕大氣下在37℃溫育2小時。在溫育之后，將該單層用PBS洗滌5次，在甲醇(BDH實驗室提供，Poole，UK)中固定3分鐘，進行革蘭氏染色(Gram Stain Set，Merck)并在油浸下經(jīng)顯微鏡檢測。針對每個玻璃蓋片單層，在10個顯微鏡視野計數(shù)每20個上皮細胞粘附的細菌數(shù)目。計算每20個上皮細胞粘附的細菌的平均值和標準誤差。一式兩份進行每個粘附分析。
在另一種方法中，在PBS中洗滌5次后，通過將細胞單層在冷卻的無菌水中劇烈渦旋以除去粘附的細菌。將細菌細胞通過在1/4強度的Ringer’s溶液(Oxoid)中系列稀釋及在MRS(乳桿菌)上溫育而計數(shù)。
五個乳桿菌AH102，AH103，AH105，AH109和AH110均粘附于胃腸道上皮細胞(圖1)。這些益生菌菌株適用作疫苗/藥物輸送載體，因為它們粘附于胃腸道上皮并因此與相關(guān)的宿主組織相互作用。
實施例3確定乳桿菌菌株對PBMC產(chǎn)生細胞因子的作用通過密度梯度離心從健康供體(19名)中分離周圍血單核細胞。在37℃將PBMC用益生菌菌株刺激72小時。在此時收集培養(yǎng)上清，離心，等份并貯存于-70℃直至使用ELISA(Boehringer Mannheim)確定IL-8，IL-10，IL-12和IFNγ水平。
AH102，AH103和AH105刺激PBMC產(chǎn)生IFNγ(圖2)。
AH102，AH103，AH109和AH11共溫育不明顯改變IL-10水平(圖3)。用AH105刺激明顯降低PBMC分泌IL-10。
AH102，AH105，AH109和AH110共同溫育明顯正調(diào)節(jié)PBMC產(chǎn)生IL-12(圖4)。AH103對IL-12產(chǎn)生無明顯作用。
5個乳桿菌菌株中無一刺激分離自健康供體的PBMC體外產(chǎn)生IL-8。在每種情況中，IL-8水平實際上降低(圖5)。
實施例4確定在與AH103和AH110溫育后在上皮/PBMC共培養(yǎng)模型中的細胞因子水平與腸道生理學(xué)相關(guān)的合適的體外模型是一個摻入上皮細胞，T細胞，B細胞，單核細胞和細菌菌株的培養(yǎng)系統(tǒng)。為此，將人Caco-2上皮細胞以5×105個細胞/ml種植于孔大小為3μm的25mm transwell插入物(Costar)頂端表面上。將這些細胞在補加10％胎牛血清，谷氨酰胺，青霉素和鏈霉素的RPMI-1640中，在37℃在5％CO2環(huán)境中培養(yǎng)4周。每三天更換一次培養(yǎng)基。當上皮細胞完全分化時，通過密度梯度離心分離人周圍血單核細胞(PBMC)。將1×106個洗滌的PBMC在上皮細胞基底外側(cè)溫育，并與1×107個益生菌一起培養(yǎng)。對照組只含有培養(yǎng)基。在這個模型系統(tǒng)中PBMC和上皮細胞之間無直接細胞-細胞接觸是可能的，而且細胞通訊只由可溶因子介導(dǎo)。
在與AH103或AH110溫育72小時后，取細胞培養(yǎng)上清，等份并貯存在-70℃。使用標準ELISA試劑盒(R&D系統(tǒng))測定TNFα胞外細胞因子水平。使用來自3個健康志愿者的PBMC一式兩份測定TNFα和IL-8水平。
在用益生菌溫育上皮細胞-PBMC共培養(yǎng)物之后，通過ELISA檢測TNFα和IL-8細胞因子水平(圖6)。AH103明顯降低由這些細胞釋放的IL-8水平。AH110降低由這些細胞釋放的TNFα和IL-8水平。
免疫調(diào)節(jié)人免疫系統(tǒng)在許多人疾病的病原學(xué)和病理學(xué)方面發(fā)揮明顯作用。超免疫和低免疫應(yīng)答導(dǎo)致或者是大多數(shù)疾病狀態(tài)的一個成分。一個生物學(xué)實體家族，稱為細胞因子，對控制免疫過程特別重要。這些精密的細胞因子網(wǎng)的紊亂與許多疾病越來越多地相關(guān)聯(lián)。這些疾病包括但非限于炎癥，免疫缺陷，炎癥性腸病，過敏性腸綜合征，癌癥(特別是胃腸道和免疫系統(tǒng)癌癥)，腹瀉，抗生素相關(guān)的腹瀉，兒童腹瀉，闌尾炎，自身免疫疾病，多發(fā)性硬化，Alzheimer’s病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，腹腔疾病，糖尿病，器官移植，細菌感染，病毒感染，真菌感染，牙周病，泌尿生殖系疾病，性傳播疾病，HIV感染，HIV復(fù)制，HIV相關(guān)的腹瀉，外科手術(shù)相關(guān)的損傷，外科手術(shù)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移性疾病，敗血癥，體重減輕，厭食，發(fā)熱控制，惡病質(zhì)，傷口愈合，潰瘍，腸屏障功能，過敏反應(yīng)，哮喘，呼吸系病變，循環(huán)系病變，冠心病，貧血，凝血系統(tǒng)病變，腎病，中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，肝病，局部缺血，營養(yǎng)失調(diào)，骨質(zhì)疏松，內(nèi)分泌失調(diào)，表皮病變，銀屑病和尋常痤瘡。每個測試的益生菌菌株對細胞因子產(chǎn)生的作用是特異性的。因此，可選擇特異性益生菌以特別針對特異類型疾病而校正單純的細胞因子不均衡。疾病特異治療可使用選擇上述益生菌菌株而實現(xiàn)。
免疫訓(xùn)練腸道菌群對腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育和正確發(fā)揮功能很重要。在沒有腸道菌群的情況下，如在無微生物的動物模型中表明的那樣，腸道免疫系統(tǒng)發(fā)育不全，而且一些功能參數(shù)降低，如巨噬細胞吞噬及免疫球蛋白產(chǎn)生的能力降低(23)。腸道菌群在刺激非損害性免疫應(yīng)答中的重要性變得更明顯。在西方世界中過敏反應(yīng)的影響范圍和嚴重程度的增加與衛(wèi)生學(xué)和衛(wèi)生設(shè)施的增加相關(guān)聯(lián)，伴隨宿主遭遇的感染性攻擊的數(shù)量和范圍降低。這種免疫刺激的缺乏使宿主與非病原性但抗原性因子反應(yīng)而產(chǎn)生過敏或自身免疫性。慎重應(yīng)用一系列非病原性免疫調(diào)節(jié)細菌可為宿主提供必需的及合適的訓(xùn)練刺激，以正確發(fā)育及控制免疫功能。
炎癥炎癥是一個術(shù)語，用于描述液體，血漿蛋白和白細胞在一個部位的局部積聚，所述部位具有持續(xù)的物理損害，感染或者在此有正在進行的免疫應(yīng)答。炎癥應(yīng)答的控制在各種水平上發(fā)揮(24)?？刂埔蜃影毎蜃樱に?例如氫化可的松)，前列腺素，活性中間體及白三烯。細胞因子是低分子量的生物活性蛋白，其參與免疫應(yīng)答和炎性應(yīng)答的產(chǎn)生和控制，而且還調(diào)節(jié)發(fā)育，組織修復(fù)和血細胞生成。它們提供了白細胞自身及與其它類型細胞之間通訊的一種方式。大多數(shù)細胞因子是多效的并表達多種生物學(xué)重疊活性。細胞因子級聯(lián)和網(wǎng)絡(luò)控制炎性應(yīng)答而不是特定細胞因子針對特定類型細胞起作用(25)。炎癥應(yīng)答的衰退產(chǎn)生較低濃度的合適的激活信號及其它炎癥介質(zhì)，引起炎性應(yīng)答停止。TNFα是一種關(guān)鍵的促炎細胞因子，因為其發(fā)起導(dǎo)致炎性狀態(tài)的細胞因子級聯(lián)及生物作用。因此，抑制TNFα的因子，例如infiiximab，通常用于治療炎性疾病。
現(xiàn)在認為促炎細胞因子在許多炎癥疾病包括炎癥性腸病(IBD)的發(fā)病機理中起主要作用。目前治療IBD的方法是針對降低這些促炎細胞因子包括IL-8和TNFα的水平而進行。這種治療方法在治療全身性炎癥疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中也發(fā)揮明顯作用。
過敏性腸綜合征(IBS)是一種常見的胃腸道病變，在人的一生當中的一些階段影響將近15-20％的人群。最常見的癥狀包括腹痛，腸道習(xí)性紊亂，出現(xiàn)腹瀉或便秘，腸胃脹氣及腹脹。沒有簡便的試驗證實診斷，如果出現(xiàn)這些癥狀而未發(fā)現(xiàn)其它器官病變，則通常診斷為IBS。胃腸病學(xué)家見到的患者中有多如25-50％的患者患有IBS。
認為許多因子參與癥狀的發(fā)作，例如胃腸炎，腹部或盆部手術(shù)，也許由抗生素攝取所致的腸道細菌菌群失調(diào)，及情緒壓力所引起的癥狀。與一般人群相對比，IBS患者的生命質(zhì)量明顯下降，更可能失去工作并使用更多的健康關(guān)懷資源。目前沒有有效的醫(yī)學(xué)處理方法，推薦的治療方法包括鎮(zhèn)痙劑，止瀉劑，膳食纖維補充劑，改變結(jié)腸內(nèi)臟感覺閾值的藥物，止痛劑及抗抑郁劑。
本發(fā)明的每種菌株均具有關(guān)于細胞因子調(diào)節(jié)和抗微生物的獨特性質(zhì)，預(yù)期可以選擇特異性菌株基于這些性質(zhì)用于特異疾病狀態(tài)中。還預(yù)期將具有合適的細胞因子調(diào)節(jié)性質(zhì)和抗微生物性質(zhì)的這組菌株組合將會增強治療效力。
本發(fā)明的菌株可潛在應(yīng)用于治療一系列炎癥疾病，特別是如果與其它抗炎治療如非類固醇抗炎藥物(NSAID)或Infliximab組合使用則更有效。
細胞因子與癌癥廣譜類型腫瘤產(chǎn)生多功能的細胞因子提示在患有癌癥的患者中存在明顯的炎癥應(yīng)答。目前還不清楚為什么這種應(yīng)答的保護性作用在體內(nèi)對抗腫瘤細胞的生長和發(fā)育。然而，這些炎癥應(yīng)答能逆轉(zhuǎn)地影響具有腫瘤的宿主。復(fù)雜的細胞因子相互作用在腫瘤和正常組織內(nèi)參與調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生和細胞增殖(26，27)。長期以來意識到體重喪失(惡病質(zhì))是癌癥患者最常見的單一致死因素，而且最初的營養(yǎng)不良表明不良預(yù)后。就腫瘤的生長和擴散而言，其必須誘導(dǎo)新血管形成及降解胞外基質(zhì)。炎癥應(yīng)答在上述機制中可具有明顯作用，因此促進宿主的衰退和腫瘤的進展。由于唾液乳桿菌的抗炎性質(zhì)，這些細菌菌株可降低惡性細胞轉(zhuǎn)化的速度。另外，腸道細菌從飲食化合物中產(chǎn)生具有基因毒性，致癌性及腫瘤促進活性的物質(zhì)，而且消化道細菌可將前致癌劑激活為DNA活性劑(28)。通常地，乳桿菌菌種與消化道內(nèi)其它菌群如類菌體，真細菌和梭菌相比具有低生物異源代謝酶活性。因此，增加消化道內(nèi)乳桿菌數(shù)量可有益于改變這些酶的活性。
疫苗/藥物輸送大多數(shù)病原微生物通過粘膜表面得以進入體內(nèi)。在這些部位有效接種可對抗特殊的感染因素入侵。目前口服疫苗策略集中使用減毒的活病原生物體或者純化的莢膜抗原(29)。工程化為在體內(nèi)產(chǎn)生來自感染因子抗原的益生菌，可提供有吸引力的另一種選擇，因為這些細菌對人體服用是安全的(GRAS狀態(tài))。
對鼠進行的研究表明服用表達外源抗原的益生菌可激發(fā)保護性免疫應(yīng)答。將編碼破傷風(fēng)毒素片段C(TTFC)的基因在Lactococcuslactis中表達，并將小鼠通過口服途徑免疫。這個系統(tǒng)能誘導(dǎo)抗體滴度足夠高以保護小鼠免于致命毒素攻擊。除了抗原呈遞之外，活細菌載體在體內(nèi)可產(chǎn)生生物活性化合物，如免疫刺激性細胞因子。分泌生物活性人IL-2或IL-6和TTFC的L.lactis在經(jīng)鼻內(nèi)免疫的小鼠中誘導(dǎo)提高10-15倍的血清IgG滴度(30)。然而，就這個特殊的細菌菌株而言，通過與這些細胞因子共表達，總IgA水平未提高。對其它細菌菌株如Streptococcus gordonii也進行測試其作為粘膜疫苗的有效性。在小鼠口腔和陰道內(nèi)建群的重組S.gordonii誘導(dǎo)對這個細菌表達的抗原的粘膜和全身性抗體應(yīng)答(31)。因此使用益生菌作為載體口服免疫不僅保護宿主免于感染，而且可代替病原體正常激發(fā)的免疫學(xué)刺激，因此有助于宿主的免疫學(xué)訓(xùn)練。
益生素(prebiotics)導(dǎo)入益生生物體通過攝取在合適載體內(nèi)的微生物而實現(xiàn)。在大腸中提供促進這些益生菌生長的介質(zhì)是有益的。加入一或多種寡糖，多糖或其它益生素增強胃腸道中乳酸菌的生長。益生菌素指任何非存活的食物成分，其在結(jié)腸中通過土著細菌特異性發(fā)酵，所述土著細菌認為是有陽性價值的，例如雙歧桿菌，乳桿菌。益生素的類型可包括含有果糖，木糖，大豆，半乳糖，葡萄糖和甘露糖的那些益生素。益生菌菌株與一或多種益生化合物組合施用可增強施用的益生菌在體內(nèi)生長，產(chǎn)生更顯著的健康獲益，因此稱為共生的。
其它活性成分應(yīng)意識到益生菌可預(yù)防性施用或者其自身或與上述其它益生菌和/或益生素組合用于治療方法。另外，所述細菌可用作預(yù)防或治療方案的一部分，所述方案還使用如用于治療炎癥或其它病變特別是具有免疫學(xué)參與的那些病變的其它活性物質(zhì)。這種組合可以單一配方形式施用，或者以單獨配方同時或不同時間及使用相同或不同途徑施用。
本發(fā)明非限于前述實施方案，可以加以變化。
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權(quán)利要求
1.一種唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)菌株，其選自菌株AH102，AH103，AH105，AH109或AH110或其突變體或變體中的任一種。
2.唾液乳桿菌菌株AH102或其突變體或變體。
3.唾液乳桿菌菌株AH103或其突變體或變體。
4.唾液乳桿菌菌株AH105或其突變體或變體。
5.唾液乳桿菌菌株AH109或其突變體或變體。
6.唾液乳桿菌菌株AH110或其突變體或變體。
7.前述任一權(quán)利要求的唾液乳桿菌菌株，其中所述突變體是遺傳修飾的突變體。
8.前述任一權(quán)利要求的唾液乳桿菌菌株，其中所述變體是唾液乳桿菌天然發(fā)生的變體。
9.選自AH102，AH103，AH105，AH109或AH110任一菌株的一種唾液乳桿菌菌株生物學(xué)純培養(yǎng)物。
10.前述任一權(quán)利要求的唾液乳桿菌菌株，其是活細胞形式。
11.前述任一權(quán)利要求的唾液乳桿菌菌株，其是非活細胞形式。
12.權(quán)利要求1-11任一項的唾液乳桿菌菌株，其中所述菌株分離自切除并洗滌的人胃腸道中。
13.前述任何一權(quán)利要求的唾液乳桿菌菌株，其中所述菌株在人體口服攝取后具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用。
14.一種配方，其包含至少一種權(quán)利要求1-13任一項的菌株。
15.權(quán)利要求14的配方，其包括另一種益生材料。
16.權(quán)利要求14或15任一項的配方，其包括一種益生素。
17.權(quán)利要求14-16任一項的配方，其包括一種可攝食載體。
18.權(quán)利要求17的配方，其中可攝食載體是一種藥物可接受的載體如膠囊，片劑或粉末。
19.權(quán)利要求17或18的配方，其中可攝食載體是一種食品如酸奶，酸乳酪，冷凍酸乳酪，奶粉，濃縮奶，奶酪，調(diào)味品或飲料。
20.權(quán)利要求14-19任一項的配方，其還包括一種蛋白質(zhì)和/或肽，特別是含有豐富谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白質(zhì)和/或肽，一種脂質(zhì)，一種碳水化合物，一種維生素，礦物質(zhì)和/或微量元素。
21.權(quán)利要求14-20的配方，其中所述唾液乳桿菌菌株在配方中的量高于106cfu/g。
22.權(quán)利要求14-21的配方，其包括一種佐劑。
23.權(quán)利要求14-22的配方，其包括一種細菌成分。
24.權(quán)利要求14-23的配方，其包括一種藥物本體。
25.權(quán)利要求14-24的配方，其包括一種生物學(xué)化合物。
26.權(quán)利要求14-25的配方，其用于免疫和接種方案中。
27.權(quán)利要求1-13任一項的唾液乳桿菌菌株或者權(quán)利要求14-26任一項的配方用于食品中。
28.權(quán)利要求1-13任一項的唾液乳桿菌菌株或者權(quán)利要求14-26任一項的配方用作藥物。
29.權(quán)利要求1-13任一項的唾液乳桿菌菌株或者權(quán)利要求14-26任一項的配方用于預(yù)防和/或治療非所希望的炎性。
30.權(quán)利要求1-13任一項的唾液乳桿菌菌株或者權(quán)利要求14-26任一項的配方用于預(yù)防和/或治療非所希望的胃腸道炎性，如炎癥性腸病如Crohns疾病或潰瘍性結(jié)腸炎；過敏性腸綜合征；囊炎；或者感染后結(jié)腸炎。
31.權(quán)利要求30的唾液乳桿菌菌株，其中所述炎性是過敏性腸綜合征。
32.權(quán)利要求1-13任一項的唾液乳桿菌菌株或者權(quán)利要求14-26任一項的配方用于預(yù)防和/或治療胃腸道癌癥。
33.權(quán)利要求1-13任一項的唾液乳桿菌菌株或者權(quán)利要求14-26任一項的配方用于預(yù)防和/或治療全身性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
34.權(quán)利要求1-13任一項的唾液乳桿菌菌株或者權(quán)利要求14-26任一項的配方用于預(yù)防和/或治療由于非所希望的炎性所致的自身免疫系統(tǒng)病變。
35.權(quán)利要求1-13任一項的唾液乳桿菌菌株或者權(quán)利要求14-26任一項的配方用于預(yù)防和/或治療由于非所希望的炎性所致的癌癥。
36.權(quán)利要求1-13任一項的唾液乳桿菌菌株或者權(quán)利要求14-26任一項的配方用于預(yù)防癌癥。
37.權(quán)利要求1-13任一項的唾液乳桿菌菌株或者權(quán)利要求14-26任一項的配方用于預(yù)防和/或治療由于非所希望的炎性所致的腹瀉，如艱難梭菌相關(guān)的腹瀉，輪狀病毒相關(guān)的腹瀉或者感染后腹瀉或者由于感染因子如大腸桿菌導(dǎo)致的腹瀉疾病。
38.權(quán)利要求1-13任一項的唾液乳桿菌菌株或者權(quán)利要求14-26任一項的配方用于制備預(yù)防和/或治療非所希望的炎性的抗炎生物治療劑。
39.權(quán)利要求1-13任一項的唾液乳桿菌菌株或者權(quán)利要求14-26任一項的配方，其中所述菌株通過拮抗胃腸道中促炎微生物并將其清除而發(fā)揮作用。
40.權(quán)利要求1-13任一項的唾液乳桿菌菌株或者權(quán)利要求14-26任一項的配方用于制備降低促炎細胞因子的水平的抗炎生物治療劑。
41.權(quán)利要求40的唾液乳桿菌菌株，用于制備降低IL-8水平的抗炎生物治療劑。
42.選自AH102，AH103或AH105的任一種唾液乳桿菌菌株用于制備改變IFNγ水平的抗炎生物治療劑。
43.一種唾液乳桿菌菌株AH110用于制備改變TNFα水平的抗炎生物治療劑。
44.選自AH102，AH103，AH105，AH109或AH110菌株的任一唾液乳桿菌菌株作為抗感染益生菌菌株的應(yīng)用。
45.一種治療或預(yù)防治療對象非所希望的炎性或炎癥疾病的方法，包括為所述對象施用權(quán)利要求1-13任一項的唾液乳桿菌菌株或者權(quán)利要求14-26任一項的配方。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述非所希望的炎性是胃腸道炎性。
47.權(quán)利要求45的方法，其中所述非所希望的炎性是炎癥性腸病如Crohns疾病或潰瘍性結(jié)腸炎；過敏性腸綜合征；囊炎；或感染后結(jié)腸炎。
48.權(quán)利要求45的方法，其中所述非所希望的炎性是過敏性腸綜合征。
49.一種治療或預(yù)防癌癥的方法，包括為治療對象施用權(quán)利要求1-13任一項的唾液乳桿菌菌株或者權(quán)利要求14-26任一項的配方。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述癌癥是胃腸道癌癥或由于炎癥所致癌癥。
51.一種治療或預(yù)防與炎癥相關(guān)的全身性疾病的方法，包括為治療對象施用權(quán)利要求1-13任一項的唾液乳桿菌菌株或者權(quán)利要求14-26任一項的配方。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述全身性疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
53.一種治療或預(yù)防由炎癥所致自身免疫失調(diào)的方法，包括為治療對象施用權(quán)利要求1-13任一項的唾液乳桿菌菌株或者權(quán)利要求14-26任一項的配方。
54.一種治療或預(yù)防腹瀉疾病的方法，包括為治療對象施用權(quán)利要求1-13任一項的唾液乳桿菌菌株或者權(quán)利要求14-26任一項的配方。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述腹瀉疾病是艱難梭菌相關(guān)的腹瀉，輪狀病毒相關(guān)的腹瀉，感染后腹瀉或者由于感染因子如大腸桿菌導(dǎo)致的腹瀉疾病。
全文摘要
一種唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)菌株AH102，AH103，AH105，AH109或AH110或其突變體或變體，其可用于預(yù)防和/或治療炎性，尤其非所希望的胃腸道炎性，如炎癥性腸病或過敏性腸綜合征。
文檔編號A61P31/04GK1639317SQ02818580
公開日2005年7月13日 申請日期2002年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月26日
發(fā)明者約翰·凱文·柯林斯, 杰拉爾德·克里斯托弗·奧沙利文, 利亞姆·奧馬霍尼, 弗格斯·沙納漢, 巴里·基利 申請人:營養(yǎng)健康有限公司