專利名稱：檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因型的引物組及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因型的引物組及其應(yīng)用，特別涉及一種利用焦磷酸測(cè)序檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因型的引物組及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國(guó)是養(yǎng)雞大國(guó)，2006年存欄蛋雞14億只，產(chǎn)蛋量1700萬(wàn)噸居世界第一位，雞肉產(chǎn)量800萬(wàn)噸，僅次于美國(guó)。雞白血病是造成養(yǎng)雞業(yè)巨大損失的重要疾病之一。該病的發(fā)病率一般在3% 30%之間，有時(shí)可高達(dá)38. 2% (王全勝等，2007)。而且多數(shù)感染雞無(wú)特征性臨床癥狀，卻能引起雞只增重緩慢，性成熟延遲，蛋小，蛋殼薄，產(chǎn)蛋量下降，受精率和孵化率低，胴體廢棄率增加，死亡率增高等，造成直接經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)還可引起機(jī)體非特異性抵抗力下降和免疫抑制，易感染其他疾病，造成間接經(jīng)濟(jì)損失。而且雞白血病病毒不僅能水平傳播，還能垂直傳播，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)危害很大。目前已經(jīng)鑒定出四種雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVA、TVB、TVC以及TVJ。其中 TVA基因所編碼的細(xì)胞受體能夠與ALVA結(jié)合，從而使A亞群病毒進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部，引發(fā)機(jī)體的感染過(guò)程(Bates et al.，1993 ；Gilbert et al.，1994)。TVC 的功能是編碼能夠與 ALVC 結(jié)合并使C亞群病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)胞受體(Elleder et al.，2004)。TVJ基因編碼的細(xì)胞受體與J亞群病毒結(jié)合，從而使ALVJ進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體感染過(guò)程(Chai and Bates, 2006)。而TVB是這四種細(xì)胞受體基因中最為復(fù)雜的一種，它所編碼的細(xì)胞受體能夠介導(dǎo)ALVB、ALVD以及ALVE三種病毒亞群進(jìn)入細(xì)胞引發(fā)感染的過(guò)程(Payne and Biggs, 1966 ；Smith et al.,1998 ；Klucking et al. ,2002 ；Zhang et al. ,2005 ；Zhang et al., 2007)。通過(guò)對(duì)TVB基因序列的分析發(fā)現(xiàn)，根據(jù)兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs，TVB基因編碼序列的第172位C/T ；TVB基因編碼序列的第184位:A/T ；)可以將TVB分為三種基因型 TVB^Sl (172 =C ； 184 :T)、TVB*S3(172 :C ； 184 :A)以及 TVB*R(172 :T ；184 :Τ 或 172 :Τ ； 184 A) (Adkins et al.，2000 ；Zhang et al.，2007)。其中TVB*S1編碼的細(xì)胞受體能夠誘導(dǎo)三種亞群的病毒進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程；TVB*S3編碼的細(xì)胞受體不能介導(dǎo)ALVE進(jìn)入宿主細(xì)胞，只能介導(dǎo)ALVB和ALVD的進(jìn)入過(guò)程；TVB*R所編碼的細(xì)胞受體屬于功能失調(diào)受體，不能和任何亞群的病毒結(jié)合(Klucking et al.，2002)。所以在這三種基因型中，TVB*R的抗性最強(qiáng)，TVB*S1 的易感性最強(qiáng)。而且，TVB*S1對(duì)TVB*S3和TVB*R是完全顯性，TVB*S3對(duì)TVB*R是完全顯性 (Zhang et al. ，2007)。目前，還沒(méi)有治療雞白血病的方法，而且也沒(méi)有研究出行之有效的預(yù)防此病的疫苗。現(xiàn)在，雞場(chǎng)主要通過(guò)淘汰陽(yáng)性雞來(lái)達(dá)到控制疾病的目的。以前，對(duì)雞白血病病毒細(xì)胞受體TVB基因的判型主要利用PCR-RFLP的方法進(jìn)行，需要進(jìn)行雙酶切才能將所有的基因型區(qū)分開來(lái)。因此，此方法較復(fù)雜，而且很可能由于主觀因素而發(fā)生判型錯(cuò)誤。近幾年出現(xiàn)一種新型的SNP判型技術(shù)-焦磷酸測(cè)序。與PCR-RFLP方法相比，利用焦磷酸測(cè)序儀進(jìn)行TVB基因的判型分析更便捷，而且屬于中通量檢測(cè)方法。因?yàn)橹恍枰淮蜳CR，然后通過(guò)測(cè)序分析直接可以得到兩個(gè)SNP位點(diǎn)的類型，從而直接推斷出其基因型。并且此方法重復(fù)性好，不會(huì)由于主觀因素造成錯(cuò)判，準(zhǔn)確性高。因此，采用快速便捷準(zhǔn)確的焦磷酸測(cè)序方法檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因型， 將對(duì)我國(guó)雞群抗雞白血病的抗病育種具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供PCR擴(kuò)增雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因片段的引物組。本發(fā)明所提供的PCR擴(kuò)增雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因片段的引物組，由用于擴(kuò)增雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因片段的特異引物對(duì)以及通用引物組成；所述雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因片段為包括所述TVB基因編碼序列的第172位和第 184位核苷酸在內(nèi)的所述雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因片段；所述通用引物的核苷酸序列是序列表中序列3 ；所述特異引物對(duì)由兩條特異引物組成，其中一條特異引物的5’端連接有所述通用引物，將該引物稱為特異引物A ；另一條特異引物的5 ’端不連接所述通用引物，將該引物稱為特異引物B。在PCR擴(kuò)增所述TVB基因片段的反應(yīng)中，所述特異引物A、所述特異引物B和所述通用引物的摩爾比為1 10 9。該引物組中的通用引物(序列3)是發(fā)明人根據(jù)與生物的基因組DNA沒(méi)有特異性雜交的原則設(shè)計(jì)的單鏈DNA。如果沒(méi)有引入該通用序列，則每次進(jìn)行TVB基因型檢測(cè)時(shí)都需要合成加有生物素標(biāo)記的特異性擴(kuò)增TVB基因的上游或下游引物。這是因?yàn)榻沽姿釡y(cè)序儀需要PCR產(chǎn)物具有生物素標(biāo)記，以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。如果引入該通用引物，則在通用引物的 5'端加生物素標(biāo)記，不僅可以應(yīng)用于TVB基因的焦磷酸檢測(cè)，還可以應(yīng)用于用焦磷酸測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)的所有試驗(yàn)。所以引入通用引物之后，可以降低焦磷酸測(cè)序儀器的整體試劑消耗成本，從而降低每個(gè)試驗(yàn)的檢測(cè)成本。將5'端加生物素標(biāo)記的通用引物稱之為通用引物C，在進(jìn)行TVB基因PCR擴(kuò)增時(shí)，特異引物A、特異引物B和通用引物C都溶解為lOpmol/μ 1。在PCR擴(kuò)增體系中分別加入0. 1μ 1特異引物Α、1μ 1特異引物B和0.9μ 1通用引物C。在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，首先特異引物A和特異引物B之間相互作用進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由于特異引物A的5'端加上了通用引物，所以以特異引物A和特異引物B之間相互作用產(chǎn)生的PCR片段增加了通用引物C的序列。在特異引物A消耗完之后，再以特異引物A和特異引物B之間相互作用產(chǎn)生的PCR 片段為模板，特異引物B和通用引物C之間相互作用繼續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最后所得大部分產(chǎn)物都含有加有生物素標(biāo)記的通用引物C。所述特異引物A的核苷酸序列為序列表中的序列2 ；所述特異引物B的核苷酸序列為序列表中的序列1。其中，序列1由18個(gè)核苷酸組成；序列2由41個(gè)核苷酸組成，前20個(gè)核苷酸與序列3 (通用引物)的20個(gè)核苷酸完全一致；序列3由20個(gè)核苷酸組成。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因型的引物組。為了通過(guò)焦磷酸測(cè)序檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB的基因型，本發(fā)明所提供的檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因型的引物組，除了包括上述PCR擴(kuò)增雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因片段的引物組外，還包括對(duì)用所述引物組(上述特異引物A、 特異引物B和通用引物C)PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序的測(cè)序引物。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因型的引物組，具體由通用引物、特異引物A、特異引物B和測(cè)序引物組成。其中所述通用引物的序列為序列表中的序列3 ；特異引物A的序列為序列表中的序列2 ；特異引物B的序列為序列表中的序列1 ；測(cè)序引物的序列為序列表中的序列4。所述序列4由16個(gè)核苷酸組成。所述引物組(包括上述PCR擴(kuò)增雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因片段的引物組和檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因型的引物組)在制備1)或2)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍1)PCR擴(kuò)增雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因片段的試劑或試劑盒；2)檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因型的試劑或試劑盒。所述引物組(包括上述PCR擴(kuò)增雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因片段的引物組和檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因型的引物組)在PCR擴(kuò)增雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因片段，或檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因型中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述應(yīng)用中，利用所述通用引物、所述特異引物A和所述特異引物B對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；必要時(shí)，再利用所述測(cè)序引物對(duì)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序；根據(jù)測(cè)序結(jié)果確定雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB的基因型。所述待測(cè)樣品來(lái)自雞，如北京油雞、絲羽烏雞或白來(lái)航雞。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述PCR擴(kuò)增具體為降落PCR擴(kuò)增，其具體擴(kuò)增反應(yīng)程序如表2所示。根據(jù)所述焦磷酸測(cè)序的結(jié)果，判斷所述TVB基因的基因型，如果兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分別為(TVB基因序列的第172位，對(duì)應(yīng)序列5的第1位C，TVB基因序列的第 184位，對(duì)應(yīng)序列5的第13位T)，則所述TVB基因的基因型為TVB*S1 ；如果兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分別為(TVB基因序列的第172位，對(duì)應(yīng)序列5的第1位C，TVB基因序列的第 184位，對(duì)應(yīng)序列5的第13位A)，則所述TVB基因的基因型為TVB*S3 ；如果兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分別為(TVB基因序列的第172位，對(duì)應(yīng)序列5的第1位T，TVB基因序列的第 184位，對(duì)應(yīng)序列5的第13位Τ或Α)，則所述TVB基因的基因型為TVB*R。所述TVB基因序列的第172位和第184位是以TVB基因編碼區(qū)起始密碼子ATG中的A作為第1位算起。所述引物組(包括上述PCR擴(kuò)增雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因片段的引物組和檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因型的引物組)在雞育種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。應(yīng)用本發(fā)明所提供的引物組對(duì)雞群進(jìn)行抗病育種，包括用所述引物組檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB的基因型，選擇TVB*R/R基因型的雞進(jìn)行育種的步驟。所述TVB*R/ R基因型是以TVB基因編碼區(qū)起始密碼子ATG中的A作為第1位算起，第172位核苷酸(對(duì)應(yīng)序列表中序列5的第1位)為T，同時(shí)第184位核苷酸(對(duì)應(yīng)序列表中序列5的第13位) 為T或A的純合型。所述北京油雞、所述絲羽烏雞、所述白來(lái)航雞等均屬于可用于檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因型的雞。
本發(fā)明采用焦磷酸測(cè)序法對(duì)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因進(jìn)行基因型判定，與傳統(tǒng)的PCR-RFLP方法相比，利用焦磷酸測(cè)序?qū)蛐瓦M(jìn)行判定，分析更加便捷，只需要一次 PCR，然后通過(guò)測(cè)序分析直接可以得到兩個(gè)SNP位點(diǎn)的類型，從而直接推斷出其基因型。并且此方法重復(fù)性好，不會(huì)由于主觀因素造成錯(cuò)判，準(zhǔn)確性高。本發(fā)明在此基礎(chǔ)上，首次引入一條通用引物，降低了焦磷酸測(cè)序判斷TVB基因型的成本。本發(fā)明對(duì)于雞群的抗病育種將會(huì)有重大的應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)效益。


圖1為雞血樣提取的基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。其中，泳道1為白來(lái)航1，泳道2為白來(lái)航2，泳道3為白來(lái)航3，泳道4為北京油雞1，泳道5為北京油雞2，泳道6為北京油雞3，泳道7為絲羽烏雞1，泳道8為絲羽烏雞2，泳道9為絲羽烏雞3。圖2為TVB基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(IOObp DNAladder Marker)，泳道1為白來(lái)航1的TVB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，泳道2為白來(lái)航2的TVB基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果，泳道4為北京油雞1的TVB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，泳道5為絲羽烏雞1的TVB基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果，泳道3為陰性對(duì)照。圖3為TVB基因的焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖譜，其中，A表示待測(cè)樣品的二倍體基因型為 TVB*S1/S1 ；B表示待測(cè)樣品的二倍體基因型為TVB*S3/R;C表示待測(cè)樣品的二倍體基因型為TVB*S1/R ；D表示待測(cè)樣品的二倍體基因型為TVB*R/R。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1、利用焦磷酸測(cè)序檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因型的引物組的制備本實(shí)施例利用焦磷酸測(cè)序檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因型的引物組由用于PCR擴(kuò)增雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因片段的通用引物、特異引物A和特異引物B，以及對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序的測(cè)序引物組成。上述四個(gè)引物按照如下方法制備在網(wǎng)站NCBI上獲得TVB的基因序列(AF507016. 1)，通過(guò)焦磷酸測(cè)序儀自帶的引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物和測(cè)序引物，選取評(píng)分最高的一組。為了降低試驗(yàn)成本，引入了 5’端加生物素標(biāo)記的通用引物。將通用引物序列加到軟件所給出的下游引物(序列 2的第21-41位)的5’端，得到最終的下游引物(特異引物A，序列2)。TVB基因判型所需引物設(shè)計(jì)如下，并人工合成上游引物(特異引物B，序列1) TGAGGCAAATGACTCCAT下游引物(特異引物A，序列2)GGGACACCGCTGATCGTTTACATTTGGATACTCGGTGTACT通用引物(引物3，序歹Ij 3) :b，GGG ACACCGCTG ATCGTT TA(b，表示生物素)
測(cè)序引物(引物4，序列 4) :GGCAAATGACTCCATC實(shí)施例2、利用引物組對(duì)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因基因TVB進(jìn)行PCR擴(kuò)增和焦磷酸測(cè)序一、利用引物組對(duì)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB進(jìn)行PCR擴(kuò)增1、血液樣本的收集和基因組DNA的提取對(duì)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家家禽測(cè)定中心飼養(yǎng)的北京油雞、絲羽烏雞和白來(lái)航雞群體， 進(jìn)行隨機(jī)抽樣，北京油雞，絲羽烏雞和白來(lái)航雞各取三只。進(jìn)行翅靜脈采血，并采用傳統(tǒng)酚仿法從抗凝血中提取全血基因組DNA。對(duì)提取的基因組DNA用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，所提取的全部基因組DNA均為單一的目的條帶；用ND-2000分光光度儀檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度，結(jié)果顯示0擬60Λ80 > 1. 8，0D260/230 >1.8。這說(shuō)明所提取的基因組DNA質(zhì)量較好，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。2、PCR 擴(kuò)增以步驟1提取的北京油雞、絲羽烏雞以及白來(lái)航雞(具體為白來(lái)航1、白來(lái)航2、北京油雞1、絲羽烏雞1)的基因組DNA為模板，以實(shí)施例1所設(shè)計(jì)合成的上游引物(特異引物B，序列1)、下游引物(特異引物A，序列2)和通用引物(序列3)對(duì)個(gè)體的TVB基因進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(模板為去離子水)。其擴(kuò)增體系見表1，擴(kuò)增程序見表2。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，檢測(cè)樣品白來(lái)航1、白來(lái)航2、北京油雞1和絲羽烏雞1均擴(kuò)增出大小約為65bp的單一的目的條帶，而陰性對(duì)照沒(méi)有目的條帶，這說(shuō)明實(shí)施例1所設(shè)計(jì)的引物具有較高的特異性，擴(kuò)增產(chǎn)物可以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。表1用于TVB基因判型的PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.PCR擴(kuò)增雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因片段的引物組，由用于擴(kuò)增雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因片段的特異引物對(duì)和通用引物組成；所述雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因片段為包括所述TVB基因編碼序列的第172位和第184位核苷酸在內(nèi)的所述雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因片段；所述通用引物的核苷酸序列是序列表中序列3 ；所述特異引物對(duì)由兩條特異引物組成，其中一條特異引物的5’端連接有所述通用引物，將該引物稱為特異引物A ；另一條特異引物的5 ’端不連接所述通用引物，將該引物稱為特異引物B。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組，其特征在于在PCR擴(kuò)增所述TVB基因片段的反應(yīng)中，所述特異引物A、所述特異引物B和所述通用引物的摩爾比為1 10 9。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物組，其特征在于所述特異引物A的核苷酸序列為序列表中的序列2 ；所述特異引物B的核苷酸序列為序列表中的序列1。
4.檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因型的引物組，包括權(quán)利要求1-3中任一所述引物組，和對(duì)用所述特異引物對(duì)PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序的測(cè)序引物。
5.檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因型的引物組，由權(quán)利要求1-3中任一所述引物組，和對(duì)用所述特異引物對(duì)PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序的測(cè)序引物組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的引物組，其特征在于所述測(cè)序引物的核苷酸序列為序列表中的序列4。
7.權(quán)利要求1-6中任一所述的引物組在制備下述1)或2、中的應(yīng)用1)PCR擴(kuò)增雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因片段的試劑或試劑盒；2)檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因型的試劑或試劑盒。
8.權(quán)利要求1-6中任一所述引物組，在PCR擴(kuò)增雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因片段，或檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因型中的應(yīng)用；所述應(yīng)用中，利用權(quán)利要求1-6中任一所述引物組中的通用引物、特異引物A和特異引物B對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；利用權(quán)利要求4-6中任一所述引物組中的所述測(cè)序引物對(duì)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序；根據(jù)測(cè)序結(jié)果確定雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB的基因型。
9.權(quán)利要求1-6中任一所述的引物組在雞育種中的應(yīng)用，所述應(yīng)用中，用權(quán)利要求1-6 中任一所述的引物組檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB的基因型，選擇TVB*R/R基因型的雞進(jìn)行育種；所述TVB*R/R基因型是所述TVB基因序列的第172位核苷酸為T，同時(shí)第184 位核苷酸為T或A的純合型；所述第172位核苷酸對(duì)應(yīng)序列表中序列5的第1位核苷酸，所述第184位核苷酸對(duì)應(yīng)序列表中序列5的第13位核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)雞白血病病毒細(xì)胞受體基因型的引物組及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的引物組由用于擴(kuò)增雞白血病病毒細(xì)胞受體基因TVB基因片段的特異引物對(duì)和通用引物，以及用于對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序的測(cè)序引物組成；所述通用引物的序列是序列3；所述特異引物對(duì)中的一條5’端連接有所述通用引物，另一條5’端不連接所述通用引物。本發(fā)明首次引入一條通用引物，降低了測(cè)序成本；與傳統(tǒng)的PCR-RFLP方法相比，本發(fā)明更加便捷，重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高，只需一次PCR，再通過(guò)焦磷酸測(cè)序分析兩個(gè)SNP位點(diǎn)，就可直接推斷出TVB基因的基因型；同時(shí)本發(fā)明對(duì)于雞群的抗病育種將會(huì)有重大的應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102433333SQ201110408140
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者俞英, 孫東曉, 張沅, 楊寧, 楊潔 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)