專利名稱：一種β諾達(dá)病毒基因組全序列及其克隆方法
一種β諾達(dá)病毒基因組全序列及其克隆方法
本專利申請由天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/細(xì)胞遺傳與分子調(diào)控天津市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，得到國家自然科學(xué)基金(30901094)，天津市科技計(jì)劃(09JCYBJC15000)，天津市教委基金(20080618)以及國家科技支撐計(jì)劃(2011BAD13B07，201IBAD13Β04)的資助。技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于應(yīng)用生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及β諾達(dá)病毒檢測方面的應(yīng)用。更具體的說是一種β諾達(dá)病毒基因組全序列及其克隆方法。
背景技術(shù)：
病毒性神經(jīng)壞死病(Viral nervous necrosis,VNN)又稱病毒性腦病和視網(wǎng)膜病 (Viral encephalopathy and retinopathy)，流行于除美洲和非洲外幾乎世界所有地區(qū)的海水魚類，對仔魚和幼魚危害很大，嚴(yán)重者在一周內(nèi)死亡率可達(dá)100%，且近年受感染的魚類種類和受危害程度迅速增加。病魚表現(xiàn)厭食，上浮于水面，表現(xiàn)螺旋狀或旋轉(zhuǎn)游動(dòng)，或腹部朝上漂浮于水面，難于下沉，病魚腹部腫大，有的鰾腫大充血，外觀無其它明顯病變。組織學(xué)檢查可見中樞神經(jīng)組織腦細(xì)胞和視網(wǎng)膜細(xì)胞空泡化。該病的病原屬諾達(dá)病毒科。
魚類病毒性神經(jīng)壞死病是近年來嚴(yán)重危害海水魚類，引起暴發(fā)性流行的重大病害之一。目前，已知受神經(jīng)壞死病毒感染的魚類達(dá)40多種。該病毒包括4種血清型，即紅鰭東方飩神經(jīng)壞死病毒、擬鰺神經(jīng)壞死病毒、條斑星鰈神經(jīng)壞死病毒、赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒?；疾◆~常表現(xiàn)出游泳異常，身體失去平衡等典型神經(jīng)性疾病癥狀，病理組織學(xué)觀察可見中樞神經(jīng)系統(tǒng)特別是腦和視網(wǎng)膜出現(xiàn)嚴(yán)重的壞死、空泡化。病毒可通過垂直和水平兩種途徑傳播。
諾達(dá)病毒科只有一個(gè)屬。本屬內(nèi)的諾達(dá)病毒首次分離于日本的Nodamura村，因而得名。過去也將其稱為野田村病毒。病毒的基因組由兩分子的ssRNA組成，分子量為 1. IX IOfiDa和0.48 X IOf5Datl兩個(gè)分子在5 ‘端都有一個(gè)帽，而;T端無多聚㈧尾。病毒在細(xì)胞漿中復(fù)制，放線菌素D不影響病毒RNA的合成。感染細(xì)胞中有3種病毒RNA，即RNAl (分子量IX I(^Da)、RNA2(分子量0. 5X106Da)和一個(gè)亞基因RNA3(分子量0. 15X IO6Da )。RNAl編碼蛋白A(分子量112X IO3Da)，后者可能是病毒RNA聚合酶的成份；RNA2編碼衣殼蛋白的前身即α蛋白；RNA3編碼蛋白B (分子量IOX IO3Da),可能在合成正鏈RNA過程中起作用。用分離的RNAl感染細(xì)胞，能合成RNAl和RNA3，但不能合成RNA2。RNAl和RNA2 均是形成病毒粒子所必須的。諾達(dá)病毒在細(xì)胞中的增殖力很低，但它能在34°C的低溫條件下，通過病毒RNA對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染而傳代培養(yǎng)。
此病毒于1989年發(fā)現(xiàn)，1990年首次報(bào)道。此后，在世界各地相繼有3目8科15種海水養(yǎng)殖魚類發(fā)生過此病。幼魚期病魚可出現(xiàn)螺旋式垂直游動(dòng)，死亡率較仔魚期低。組織學(xué)檢查可見腦細(xì)胞和視網(wǎng)膜因細(xì)胞壞死和毀壞形成的空胞。電鏡觀察可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)球形病毒粒子，直徑25 30 nm,病毒基因由兩段單鏈RNA組成，RNAl編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，RNA2編碼一種主要的結(jié)構(gòu)蛋白。
目前，對于諾達(dá)病毒基因復(fù)制和蛋白成熟過程，科學(xué)家們已經(jīng)有了較多的了解，但快速診斷技術(shù)尚不完備，常用的診斷方法例如行為體色觀察、組織病理檢查、RT-PCR法檢測病毒衣殼蛋白基因、原位雜交法檢測病毒核酸在組織中的分布、免疫學(xué)方法等。

發(fā)明內(nèi)容
一種β諾達(dá)病毒全基因組序列，其特征在于該病毒基因組由兩條不等長RNA組成，RNAl節(jié)段全長3104個(gè)核苷酸，5，UTR和3，UTR分別由78和77個(gè)核苷酸組成，ORF區(qū)含有四49個(gè)堿基，編碼病毒自身的RNA依賴的RNA聚合酶，在其編碼區(qū)內(nèi)部嵌套有另一重疊閱讀框(位置27534980 nt)，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白B2，序列為SEQ ID No. 1所示；RNA2節(jié)段長度為1433個(gè)核苷酸，5，UTR和3，UTR分別由沈和390個(gè)核苷酸組成，ORF區(qū)含有1017 個(gè)核苷酸，序列為SEQ ID No. 2所示。本發(fā)明所述β諾達(dá)病毒基因組全序列，其中β諾達(dá)病毒基因組RNAl節(jié)段編碼長度為982個(gè)氨基酸，其序列如SEQ ID No. 3所示。本發(fā)明所述β諾達(dá)病毒基因組全序列，其中β諾達(dá)病毒全基因組RNAl節(jié)段嵌套的Β2蛋白長度為75個(gè)氨基酸，其序列如SEQ ID No. 4所示。本發(fā)明所述β諾達(dá)病毒基因組全序列，其中β諾達(dá)病毒基因組RNA2節(jié)段編碼長度為338個(gè)氨基酸，其序列如SEQ ID No. 5所示。本發(fā)明主要完成了如下的內(nèi)容
1. β諾達(dá)病毒基因組全序列的確認(rèn)
本發(fā)明的方法采用長距離逆轉(zhuǎn)錄酶和長距離高保真聚合酶，依據(jù)RT-PCR原理擴(kuò)增出一種β諾達(dá)病毒基因組兩條RNA的全長cDNA，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到T載體進(jìn)行測序比對分析，獲得具有正確堿基序列的克隆。2. β諾達(dá)病毒基因組全序列的制備方法(具體見實(shí)施例1) 包括RNA抽提，cDNA合成，基因組擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測序及比對分析 3. β諾達(dá)病毒基因組全序列的用途
β諾達(dá)病毒基因組全序列確定后，可根據(jù)該基因組的序列進(jìn)行β諾達(dá)病毒的分子檢測(具體見實(shí)施例2)。4. β諾達(dá)病毒基因組全序列編碼氨基酸序列的用途
β諾達(dá)病毒基因組全序列編碼的氨基酸序列確定后，可根據(jù)該序列制備β諾達(dá)病毒相關(guān)蛋白的抗體(具體見實(shí)施例3)。


圖1擴(kuò)增RNAl節(jié)段全序列的結(jié)果；Μ: DNA分子量標(biāo)記DL2000 ；1 對照；2 =RNAl擴(kuò)增產(chǎn)物；
圖2擴(kuò)增RNA2節(jié)段全序列的結(jié)果；Μ: DNA分子量標(biāo)記DL2000 ；1 對照；2 :RNA2擴(kuò)增產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例說明本發(fā)明，這里所述實(shí)施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng)視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)由權(quán)利要求來限定。特別加以說明的是，本發(fā)明使用的試劑材料均有市售；其中大腸桿菌(DH5ci )購于購自天根生化公司；牙鲆幼苗由天津海發(fā)珍品養(yǎng)殖中心提供。
實(shí)施例1β諾達(dá)病毒基因組全序列的制備 1. RNA抽提I；將牙鲆置于預(yù)冷的解剖盤上，用經(jīng)180°C烘烤8個(gè)小時(shí)的剪刀和鑷子解剖，將其腦部組織迅速轉(zhuǎn)移到無RNase的1. 5mL離心管中，加入ImL Trizol于冰浴中充分勻漿，室溫靜置 5min,于 4°C條件下 12000rpm 離心 IOmin ；②?、偕锨宓揭恢碌?.5mL離心管中，加入200 μ L氯仿振蕩15s，之后靜置^iin ；③將上述②中的液體于4°C下，12000rpm離心15min后取無色上清；④向上述③中上清加入500μ L異丙醇將管中液體輕輕混勻，室溫靜置15min，沉淀RNA ；⑤將上述④溶液于4°C，12000rpm離心lOmin，棄上清；⑥向上述⑤中沉淀加入ImL75%乙醇，輕輕洗滌。之后4°C，7500rpm離心6min，棄上清；⑦將上述⑥中沉淀晾干，加入適量的H2O溶解(65°C促溶10-15min)，然后置于-80°C保存。
2. cDNA 合成 RNA變性
權(quán)利要求
1.一種β諾達(dá)病毒基因組全序列，其特征在于該病毒基因組由兩條不等長RNA組成，RNAl節(jié)段全長3104個(gè)核苷酸，5，UTR和3，UTR分別由78和77個(gè)核苷酸組成，ORF區(qū)含有四49個(gè)堿基，編碼病毒自身的RNA依賴的RNA聚合酶，在其編碼區(qū)內(nèi)部嵌套有另一重疊閱讀框，位置2753-^80 nt，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白B2，序列為SEQ ID No. 1所示；RNA2節(jié)段長度為1433個(gè)核苷酸，5，UTR和3，UTR分別由沈和390個(gè)核苷酸組成，ORF區(qū)含有1017 個(gè)核苷酸，序列為SEQ ID No. 2所示。
2.權(quán)利要求1所述β諾達(dá)病毒基因組全序列，其中β諾達(dá)病毒基因組RNAl節(jié)段編碼長度為982個(gè)氨基酸，其序列如SEQ ID No. 3所示。
3.權(quán)利要求1所述β諾達(dá)病毒基因組全序列，其中β諾達(dá)病毒全基因組RNAl節(jié)段嵌套的Β2蛋白長度為75個(gè)氨基酸，其序列如SEQ ID No. 4所示。
4.權(quán)利要求1所述β諾達(dá)病毒基因組全序列，其中β諾達(dá)病毒基因組RNA2節(jié)段編碼長度為338個(gè)氨基酸，其序列如SEQ ID No. 5所示。
5.權(quán)利要求1所述的β諾達(dá)病毒基因組全序列在制備β諾達(dá)病毒蛋白抗體方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種β諾達(dá)病毒基因組全序列及其克隆方法，該方法采用長距離逆轉(zhuǎn)錄酶和長距離高保真聚合酶，依據(jù)RT-PCR原理擴(kuò)增一種β諾達(dá)病毒基因組兩條RNA的全長cDNA，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到T載體進(jìn)行測序比對分析，獲得具有正確堿基序列的克隆。本發(fā)明有利于設(shè)計(jì)病毒檢測方法，了解病毒的分類、致病性及分子流行病學(xué)等，也能通過人工改造將其作為基因轉(zhuǎn)移載體使用。
文檔編號(hào)C12N15/40GK102492702SQ20111040775
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者劉逸塵, 孫金生, 張亦陳, 杜宏薇, 耿緒云, 顧中華 申請人:天津師范大學(xué)