專(zhuān)利名稱(chēng)：一種犬重組干擾素α及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開(kāi)了一種犬重組干擾素α，同時(shí)還提供了犬重組干擾素α的制備方法， 為基因工程方法生產(chǎn)重組犬干擾素，屬于生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著國(guó)內(nèi)工作犬(軍犬、警犬、實(shí)驗(yàn)用犬等)、肉用犬以及寵物犬等犬類(lèi)飼養(yǎng)量的大幅度增加，病毒性疾病益成為威脅犬類(lèi)生命的直接原因。人與犬的親密接觸大大增加了人被病毒感染的機(jī)會(huì)。如狂犬病毒、犬細(xì)小病毒和犬瘟熱病毒等，都會(huì)給人類(lèi)健康帶來(lái)極大的威脅，已引起全社會(huì)的關(guān)注。在獸醫(yī)臨床方面，由于疫苗的使用、保存、運(yùn)輸?shù)确矫娴脑?，常?huì)使免疫失敗，而疫苗研究的時(shí)間較長(zhǎng)，不能及時(shí)地用于新病毒的臨床治療。因此，若要綜合控制犬病毒性疾病，需要安全、有效、副作用少的藥物。犬干擾素具有廣譜抗病毒活性，在一定程度上可以滿(mǎn)足上述要求，具有有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。1957年，英國(guó)科學(xué)家Alick Isaacs和lean Lindenmann利用雞胚絨毛尿囊研究流感干擾現(xiàn)象時(shí)，發(fā)現(xiàn)一種能夠干擾病毒繁殖的物質(zhì)，稱(chēng)之為干擾素(interferon，IFN).從此以后，IFN—直是病毒學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).目前，重組人干擾素已廣泛應(yīng)用于治療乙肝、心肌炎等病毒性感染且獲得了較好的療效。Himmler等于1987年首先開(kāi)始研究犬干擾素(CaIFN-α )基因，利用人干擾素α 的cDNA為探針，從犬的全基因組文庫(kù)中克隆出CaIFN-α基因，報(bào)道了該序列并申請(qǐng)了專(zhuān)利，其對(duì)犬細(xì)胞的生物活性為3X105IU/L。我國(guó)科研工作者也相繼展開(kāi)了關(guān)于犬干擾素α重組、表達(dá)等方面的研究，并獲得了一系列成果。夏春等利用PCR技術(shù)擴(kuò)增、克隆了拉布拉多犬和德國(guó)牧羊犬的干擾素基因 alphaIFN并進(jìn)行了測(cè)序夏春，汪明，夏兆飛.拉布拉多犬和德國(guó)牧羊犬干擾素alpha基因克隆及測(cè)序.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)1999，7 (3)但未進(jìn)行表達(dá)，應(yīng)用方面的研究。項(xiàng)黎麗等克隆了犬干擾素α基因序列，利用IPTG化學(xué)試劑進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)純化獲得了純度較好的犬α干擾素項(xiàng)黎麗，閆若潛，盛敏等，犬α干擾素的克隆、表達(dá)及純化.中國(guó)動(dòng)物檢疫 2010, 27 (1)35-38，但未對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)一步研究；本發(fā)明進(jìn)行了不同程度的發(fā)酵培養(yǎng)研究且獲得了高純度的犬重組干擾素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種犬重組干擾素α。本發(fā)明還提供了犬重組干擾素α的制備方法。本發(fā)明公開(kāi)的犬重組干擾素α，其特征在于將犬干擾素α基因與表達(dá)載體 PBV220進(jìn)行連接。所述犬重組干擾素α的基因，為以下序列
ATG TGC CAT CTG COG GAC AOC CAT GGC CTG OGT AAT TGG OGT GTG CTG AOG CTG CTG GGC 60CAG ATG OGT OGT CTG AGC GCG GGT AGC TGC GAC CAT TAT AOC AAC GAT TTT GCG TTC COG 120 AAA GAG CTG TTT GAT GGT CM OGT CTG CAA GM GCC CAG GCG CTG AGC GTG GTG CAT GTG 180 ATG ACC CAG AM GTG TTT CAC CTG ITT TGC QjG GAT AOG AGC AGC GCG OCA TGG AAT ATG 240 AOC CTG CTG GAA GAA CTG TGC AGC GGC CTG AGC GAA CAG CTG GAT GAT CTG GAA GCG TGC 300 OCA CTG CAG GM GCC GGT CTG GCG GM ACC COG CTG ATG CAT GM GAT AGC ACC CTG OGC 360 ACC TAC TTT CAG OGC ATT AGC CTG TAT CTG CAG GAC OGT AAC CAT AGC COG TGC GCG TGG 420 GM ATG GTG OGT GCG GM Απ GGC OGT AGC ITT TTC AGC AGC AOG ATC CTG CAA GAG OGT 480 Απ OGT OGT GGC AM TM498
本發(fā)明公開(kāi)的犬重組干擾素α的制備方法，包括以下步驟
1)編碼犬重組干擾素α基因的獲得
利用CaIFN- α基因序列合成權(quán)利要求2所述的目的基因片段； 將上述基因片段與大腸桿菌升溫誘導(dǎo)型載體(PBV220 )進(jìn)行重組 用限制性?xún)?nèi)切酶(EcoR I和Ml I )消化酶切表達(dá)載體，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳切下目的DNA帶，以外源目的DNA和載體DNA5:1的末端比例，用Τ4 DNA連接酶進(jìn)行粘性末端定向連接，得重組目的基因片段；
2)E. coli BL21工程菌的獲得
取37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜的E. coli BL21菌種，接種于LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2_3小時(shí)；冰浴10min，4°C 4000r/min離心IOmin收集菌體，用預(yù)冷的IOOmMCaCl2溶液懸浮細(xì)胞， 離心收集細(xì)胞，再用預(yù)冷的IOOmM CaCl2溶液懸浮細(xì)胞，得到E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞；
將重組目的基因片段與100 μ 1 Ε. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰浴30min，42°C水浴 90s，再冰浴2min，加入0. 5mlLB培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)1小時(shí)后涂布于含100 μ g/mlAmpicillin 的LB瓊脂板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜；挑取轉(zhuǎn)化子接種于含Ampicillin的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩過(guò)夜；收集菌體，得E. coli BL21工程菌；
3)發(fā)酵表達(dá)
按接種量將工程菌接種于200ml LB培養(yǎng)液中，30°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；按5%接種于IL LB培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)二代30°C培養(yǎng)至OD值為0. 6時(shí)，按10%接種于發(fā)酵罐中，30°C培養(yǎng)至OD為 1-2時(shí)，快速升溫至42°C，菌體表達(dá)，培養(yǎng)4-5小時(shí)，4000r/min離心30min，收集表達(dá)菌體；
3)菌體破碎
將上述菌體冰浴條件下超聲破碎頻率為20kHz，破碎時(shí)間為5s，間隔時(shí)間為5s，連續(xù) 30min ； 10000r/min離心15min，收集沉淀，得包涵體；將包涵體用4mol/L尿素，pH=8. 5按 1:5溶解，得包涵體懸浮液；
4)犬重組干擾素的變性
將上述包涵體懸浮液lOOOOr/min離心15min，收集沉淀；將沉淀按1 5溶于7mol/L鹽酸胍中，混合均勻，裂解作用2-3小時(shí)，得到裂解液；
5)犬重組干擾素的復(fù)性
將裂解液用2. 5mol/L鹽酸胍稀釋后，按1:8懸浮0. 15mol/L硼酸溶液中，4°C作用18h， 得到復(fù)性液；
6)犬重組干擾素α的純化
上述復(fù)性液經(jīng)0. 45 μ m濾膜過(guò)濾，上載疏水層析柱和分子篩層析柱進(jìn)行純化；疏水層析(hydrophobic interaction chromatography HIC)疏水層析柱予頁(yè)先用 (50mmol/L PB、1.5mol/L (NH4)2SO4 ρΗ7· 8)液體平衡，用(50mmol/L PB、lmol/L (NH4)2SO4 PH7.8)洗脫，用(0.5mol/L NaOH)洗脫以再生層析柱，得到純化的重組犬干擾素α樣品；
分子篩層析(S印hacryl-S-100):將上述純化樣品上載分子篩層析柱 (S印hacryl-S-100)，預(yù)先用(20mmol/L PB,0. 85% NaCl pH7. 4)平衡層析柱；樣品上載后用(20mmol/L PB,0. 85% NaCl pH7. 4)洗脫，用(0. lmol/L NaOH)洗脫以再生層析柱，得到高純度的犬重組干擾素α樣品。犬重組干擾素α濃度的測(cè)定
本發(fā)明采用Lowry法測(cè)定犬重組干擾素α的濃度。Lowry法即R)Iin酚法測(cè)定純化后重組犬干擾素的蛋白含量。其原理為磷鉬酸和磷鎢酸在堿性條件下，易被酚類(lèi)化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)。蛋白質(zhì)中含有代酚基的酪氨酸，所以可用此反應(yīng)測(cè)定蛋白含量。犬重組干擾素α純度的測(cè)定
本發(fā)明采用SDS聚丙烯凝膠電泳法測(cè)定犬重組干擾素α的純度。待測(cè)純度樣品經(jīng)SDS 聚丙烯凝膠電泳獲得的電泳圖譜，用BandScan軟件分析即可得到樣品的純度。犬重組干擾素α的生物活性測(cè)定
本發(fā)明利用MDCK (犬腎細(xì)胞)和VSV (水泡性口炎)病毒，采用細(xì)胞病變抑制法測(cè)量犬重組干擾素α生物活性，并計(jì)算其比活性。犬重組干擾素α內(nèi)毒素檢測(cè)
本發(fā)明利用鱟試劑來(lái)檢測(cè)或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素。細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位(EU)表示。確定最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)最大有效稀釋倍數(shù)是指在試驗(yàn)中供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過(guò)此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測(cè)。根據(jù)最大有效稀釋倍數(shù)稀釋犬重組干擾素α樣品，檢查其細(xì)菌內(nèi)毒素。用以下公式來(lái)確定MVD MVD=cL/λ
式中，L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值； c為供試品溶液的濃度；
λ為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度(EU/ml)，或是在光度測(cè)定法中所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上最低的內(nèi)毒素濃度。本發(fā)明的積極效果在于將犬干擾素α的重組基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)復(fù)性和純化過(guò)程，獲得了純度大于98%的犬干擾素α。利用MDCK (犬腎細(xì)胞)-VSV (水泡性口炎)病毒體系對(duì)其生物活性進(jìn)行測(cè)定，其比活性達(dá)到了 2-3Χ 107IU/mg。


圖1為目的基因片段l、CaIFN_a雙酶切，2、marker。圖2為連接表達(dá)載體后的重組基因片段1_4、pBV220-CaIFN-a雙酶切，5、 markerο圖3為重組犬干擾素α發(fā)酵表達(dá)1、誘導(dǎo)前，2、marker，3_6、誘導(dǎo)l_4h，7、誘導(dǎo) 4. 5h，8、誘導(dǎo) 5h。圖4為純化重組犬干擾素α電泳圖；1、marker，2、純化后樣品。
圖5為重組犬干擾素α發(fā)酵表達(dá)；1、marker，2、誘導(dǎo)前，3-7、誘導(dǎo)1_證。圖6為純化重組犬干擾素α電泳圖；1、marker，2、純化后樣品。圖7為重組犬干擾素α發(fā)酵表達(dá)；1、marker，2、誘導(dǎo)前，3-7、誘導(dǎo)1_證。圖8為純化重組犬干擾素α電泳圖；1、純化后樣品，2、marker。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1
1)編碼犬重組干擾素α基因的獲得
參照CaIFN-α基因序列，合成目的基因片段，基因序列如下
ATG TGC CAT CTG COG GAC AOC CAT GGC CTG OGT AAT TGG OGT GTG CTG AOG CTG CTG GGC 60 CAG ATG OGT OGT CTG AGC GCG GGT AGC TGC GAC CAT TAT AOC AAC GAT TTT GCG TTC COG 120 AAA GAG CTG TTT GAT GGT CM OGT CTG CAA GM GCC CAG GCG CTG AGC GTG GTG CAT GTG 180 ATG ACC CAG AM GTG TTT CAC CTG TTT TGC OOG GAT AOG AGC AGC GCG CCA TGG AAT ATG 240 AOC CTG CTG GAA GAA CTG TGC AGC GGC CTG AGC GAA CAG CTG GAT GAT CTG GAA GCG TGC 300 OCA CTG CAG GM GCC GGT CTG GCG GM ACC OOG CTG ATG CAT GAA GAT AGC AOC CTG OGC 360 ACC TAC ITT CAG OGC ATT AGC CTG TAT CTG CAG GAC OGT MC CAT AGC COG TGC GCG TGG 420 GAA ATG GTG OGT GCG GAA ATT GGC OGT AGC TTT TTC AGC AGC AOG ATC CTG CM GAG OGT 480 Απ OGT OGT GGC AM TM498
做瓊脂糖凝膠電泳鑒定其基因片段大小與理論大小相符(見(jiàn)圖1)；將基因片段與大腸桿菌升溫誘導(dǎo)型載體(PBV220)重組，方法如下。用限制性?xún)?nèi)切酶(EcoR I和Ml I )消化酶切表達(dá)載體，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳切下目的DNA帶，以外源目的DNA和載體DNA5:1的末端比例，用T4 DNA連接酶進(jìn)行粘性末端定向連接，得重組目的基因片段(見(jiàn)圖2)；
2)E. coli BL21工程菌的獲得
取37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜的E. coli BL21菌種，接種于LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2_3小時(shí)；冰浴10min，4°C 4000r/min離心IOmin收集菌體，用預(yù)冷的IOOmMCaCl2溶液懸浮細(xì)胞， 離心收集細(xì)胞，再用預(yù)冷的IOOmM CaCl2溶液懸浮細(xì)胞，得到E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞；
將重組目的基因片段與100 μ 1 Ε. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰浴30min，42°C水浴 90s，再冰浴2min，加入0. 5mlLB培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)1小時(shí)后涂布于含100 μ g/mlAmpicillin 的LB瓊脂板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜；挑取轉(zhuǎn)化子接種于含Ampicillin的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩過(guò)夜；收集菌體，得E. coli BL21工程菌；
3)發(fā)酵表達(dá)
按接種量將工程菌接種于200ml LB培養(yǎng)液中，30°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；按5%接種于IL LB培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)二代30°C培養(yǎng)至OD值為0. 6時(shí)，按10%接種于10L發(fā)酵罐中，30°C培養(yǎng)至 OD為1-2時(shí)，快速升溫至42°C，菌體表達(dá)，培養(yǎng)4-5小時(shí)，4000r/min離心30min，收集表達(dá)菌體50g ；目的蛋白表達(dá)量約占菌體總蛋白的20% (見(jiàn)圖3)；
4)菌體破碎將上述菌體冰浴條件下超聲破碎頻率為20kHz，破碎時(shí)間為5s，間隔時(shí)間為5s，連續(xù) 30min ； 10000r/min離心15min，收集沉淀，得包涵體；將包涵體用4mol/L尿素，pH=8. 5按 1:5溶解，得包涵體懸浮液；
5)犬重組干擾素的變性
將上述包涵體懸浮液lOOOOr/min離心15min，收集沉淀；將沉淀按1 5溶于7mol/L鹽酸胍中，混合均勻，裂解作用2-3小時(shí)，得到裂解液；
6)犬重組干擾素的復(fù)性
將裂解液用2. 5mol/L鹽酸胍稀釋后，按1:8懸浮0. 15mol/L硼酸溶液中，4°C作用18h， 得到復(fù)性液；
7)犬重組干擾素α的純化
上述復(fù)性液經(jīng)0. 45 μ m濾膜過(guò)濾，上載疏水層析柱和分子篩層析柱進(jìn)行純化； 疏水層析(hydrophobic interaction chromatography HIC)疏水層析柱予頁(yè)先用 (50mmol/L PB、1.5mol/L (NH4)2SO4 ρΗ7· 8)液體平衡，用(50mmol/L PBUmol/L (NH4)2SO4 PH7.8)洗脫，用(0.5mol/L NaOH)洗脫以再生層析柱得到純化重組犬干擾素α樣品；
分子篩層析(S印hacryl-S-100):將上述純化樣品上載分子篩層析柱 (S印hacryl-S-100)，預(yù)先用(20mmol/L PB,0. 85% NaCl pH7. 4)平衡層析柱；樣品上載后用(20mmol/L PB,0. 85% NaCl pH7. 4)洗脫，用(0. lmol/L NaOH)洗脫以再生層析柱，得到純度大于98%的犬重組干擾素α蛋白(見(jiàn)圖4);
8)犬重組干擾素的活性檢測(cè)
利用細(xì)胞病變抑制法，依據(jù)抑制VSV病毒攻擊MDCK細(xì)胞病變的方法，設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照和空白對(duì)照組，用結(jié)晶紫染液染色細(xì)胞，酶標(biāo)儀上檢測(cè)測(cè)定波長(zhǎng)為570nm，參比波長(zhǎng)為 630nm，經(jīng)SOFT max PRO軟件測(cè)定輸入相關(guān)參數(shù)及稀釋倍數(shù)后，記錄測(cè)定結(jié)果。測(cè)定犬重組干擾素α純化產(chǎn)物的活性約為4700080IU。9)犬重組干擾素的蛋白含量測(cè)定
利用Folin酚法測(cè)定重組犬重組干擾素α的蛋白含量為200 μ g/ml。10)犬重組干擾素的內(nèi)毒素檢測(cè)
利用鱟試劑檢測(cè)純化后重組犬干擾素的內(nèi)毒素< 10EU/mg 11)犬重組干擾素比活性計(jì)算
比活性為生物學(xué)活性與蛋白質(zhì)含量之比，計(jì)算得到重組犬干擾素的比活性為 2. 4X107IU/mg。12)犬重組干擾素生產(chǎn)工藝各步驟質(zhì)量及收率
純度濃度比活性?xún)?nèi)毒素發(fā)酵表達(dá)20%復(fù)性52%40 μ g/mlsS lOOOEU/mg疏水層析85%780 μ g/ml1. 1X 107IU/mgsS 50EU/mg分子篩98%200 μ g/ml2. 4X107IU/mgsS lOEU/mg
實(shí)施例2
1)編碼犬干擾素α重組基因的獲得
方法參照實(shí)施例1獲得犬重組干擾素α基因
2)Ε. coli BL21工程菌的獲得方法參照實(shí)例1經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得該重組基因的E. coli BL21工程菌的獲得。3)發(fā)酵表達(dá)
按接種量將工程菌接種于200ml LB培養(yǎng)液中，30°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；按5%接種于IL LB培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)二代30°C培養(yǎng)至OD值為0. 6時(shí)，按10%接種于50L發(fā)酵罐中，30°C培養(yǎng)至 OD為1-2時(shí)，快速升溫至42°C，菌體表達(dá)，培養(yǎng)4-5小時(shí)，4000r/min離心30min，收集表達(dá)菌體270g ；目的蛋白表達(dá)量約占菌體總蛋白的22% (見(jiàn)圖5)；
4)菌體破碎
將上述菌體冰浴條件下超聲破碎頻率為20kHz，破碎時(shí)間為5s，間隔時(shí)間為5s，連續(xù) 30min ； 10000r/min離心15min，收集沉淀，得包涵體；將包涵體用4mol/L尿素，pH=8. 5按 1:5溶解，得包涵體懸浮液；
5)犬重組干擾素的變性
將上述包涵體懸浮液lOOOOr/min離心15min，收集沉淀；將沉淀按1 5溶于7mol/L鹽酸胍中，混合均勻，裂解作用2-3小時(shí)，得到裂解液；
6)犬重組干擾素的復(fù)性
將裂解液用2. 5mol/L鹽酸胍稀釋后，按1:8懸浮0. 15mol/L硼酸溶液中，4°C作用18h， 得到復(fù)性液；
7)犬重組干擾素的純化
純化方法參照實(shí)施例1，得到純度大于98%的犬重組干擾素α蛋白(見(jiàn)圖6);
8)犬重組干擾素的活性檢定
利用MDCK-VSV體系，根據(jù)細(xì)胞病變抑制法檢測(cè)生物學(xué)活性，具體方法參照實(shí)施例1 ；
8)犬重組干擾素的蛋白含量測(cè)定測(cè)定方法參照實(shí)施例1 ；
9)犬重組干擾素的內(nèi)毒素檢測(cè)檢測(cè)方法參照實(shí)施例1 ；
10)犬重組干擾素比活性計(jì)算
比活性為生物學(xué)活性與蛋白質(zhì)含量之比，計(jì)算得到重組犬干擾素的比活性為 2. 56X 107IU/mg。11)犬重組干擾素生產(chǎn)工藝各步驟質(zhì)量及收率
權(quán)利要求
1.一種犬重組干擾素α，其特征在于將犬干擾素α基因與表達(dá)載體pBV220進(jìn)行連接。
2.權(quán)利要求1所述犬重組干擾素α的基因，為以下序列ATG TGC CAT CTG COG GAC ACC CAT GGC CTG OGT AAT TGG OGT GTG CTG AOG CTG CTG GGC 60 CAG ATG OGT OGT CTG AGC GCG GGT AGC TGC GAC CAT TAT ACC AAC GAT TTT GCG TTC COG 120 AAA GAG CTG ITT GAT GGT CAA OGT CTG CAA GAA GCC CAG GCG CTG AGC GTG GTG CAT GTG 180 ATG ACC CAG AAA GTG ITT CAC CTG ITT TGC COG GAT AOG AGC AGC GCG OCA TGG AAT ATG 240 ACC CTG CTG GM GAA CTG TGC AGC GGC CTG AGC GM CAG CTG GAT GAT CTG GAA GCG TGC 300 CCA CTG CAG GM GCC GGT CTG GCG GM AOC QjG CTG ATG CAT GAA GAT AGC AOC CTG OGC 360 ACC TAC ITT CAG OGC Απ AGC CTG TAT CTG CAG GAC OGT MC CAT AGC COG TGC GCG TGG 420 GAA ATG GTG OGT GCG GAA ATT GGC OGT AGC TTT TTC AGC AGC AOG ATC CTG CM GAG OGT 480 Απ OGT OGT GGC AM TM498。
3.權(quán)利要求1所述的犬重組干擾素α的制備方法，包括以下步驟1)編碼犬重組干擾素α基因的獲得利用CaIFN- α基因序列合成權(quán)利要求2所述的目的基因片段； 將上述基因片段與大腸桿菌溫度誘導(dǎo)型載體(PBV220)進(jìn)行重組； 用限制性?xún)?nèi)切酶(EcoR I和Ml I )消化酶切表達(dá)載體，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳切下目的DNA帶，以外源目的DNA和載體DNA5:1的末端比例，用Τ4 DNA連接酶進(jìn)行粘性末端定向連接，得重組目的基因片段；2)E. coli BL21工程菌的獲得取37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜的E. coli BL21菌種，接種于LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2_3小時(shí)；冰浴10min，4°C 4000r/min離心IOmin收集菌體，用預(yù)冷的IOOmMCaCl2溶液懸浮細(xì)胞， 離心收集細(xì)胞，再用預(yù)冷的IOOmM CaCl2溶液懸浮細(xì)胞，得到E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞；將重組目的基因片段與100 μ 1 Ε. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰浴30min，42°C水浴 90s，再冰浴2min，加入0. 5mlLB培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)1小時(shí)后涂布于含100 μ g/mlAmpicillin 的LB瓊脂板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜；挑取轉(zhuǎn)化子接種于含Ampicillin的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩過(guò)夜；收集菌體，得E. coli BL21工程菌；3)發(fā)酵表達(dá)按接種量將工程菌接種于200ml LB培養(yǎng)液中，30°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；按5%接種于IL LB培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)二代30°C培養(yǎng)至OD值為0. 6時(shí)，按10%接種于發(fā)酵罐中，30°C培養(yǎng)至OD為 1-2時(shí)，快速升溫至42°C，菌體表達(dá)，培養(yǎng)4-5小時(shí)，4000r/min離心30min，收集表達(dá)菌體；4)菌體破碎將上述菌體冰浴條件下超聲破碎頻率為20kHz，破碎時(shí)間為5s，間隔時(shí)間為5s，連續(xù) 30min ； 10000r/min離心15min，收集沉淀，得包涵體；將包涵體用4mol/L尿素，pH=8. 5按 1:5溶解，得包涵體懸浮液；5)犬重組干擾素的變性將上述包涵體懸浮液lOOOOr/min離心15min，收集沉淀；將沉淀按1 5溶于7mol/L鹽酸胍中，混合均勻，裂解作用2-3小時(shí)，得到裂解液；6)犬重組干擾素的復(fù)性將裂解液用2. 5mol/L鹽酸胍稀釋后，按1:8懸浮0. 15mol/L硼酸溶液中，4°C作用18h， 得到復(fù)性液；7)犬重組干擾素α的純化上述復(fù)性液經(jīng)0. 45 μ m濾膜過(guò)濾，上載疏水層析柱和分子篩層析柱進(jìn)行純化； 疏水層析(hydrophobic interaction chromatography HIC)疏水層析柱予頁(yè)先用 (50mmol/L PB、1.5mol/L (NH4)2SO4 ρΗ7· 8)液體平衡，用(50mmol/L PB、lmol/L (NH4)2SO4 PH7.8)洗脫，用(0.5mol/L NaOH)洗脫以再生層析柱，得到純化的重組犬干擾素α樣品；分子篩層析(S印hacryl-S-100):將上述純化樣品上載分子篩層析柱 (S印hacryl-S-100)，預(yù)先用(20mmol/L PB,0. 85% NaCl pH7. 4)平衡層析柱；樣品上載后用(20mmol/L PB,0. 85% NaCl pH7. 4)洗脫，用(0. lmol/L NaOH)洗脫以再生層析柱，得到犬重組干擾素α樣品。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種犬重組干擾素α，同時(shí)還提供了犬重組干擾素α的制備方法，將犬干擾素α的重組基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)復(fù)性和純化過(guò)程，獲得了純度大于98％的犬干擾素α。利用MDCK(犬腎細(xì)胞)-VSV(水泡性口炎)病毒體系對(duì)其生物活性進(jìn)行測(cè)定，其比活性達(dá)到了2-3×107IU/mg。
文檔編號(hào)C12N15/21GK102321169SQ20111029189
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者劉新濤, 李瑩瑩, 殷玉和 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)