專(zhuān)利名稱(chēng)：一種玉米綜合抗病性鑒定有效ssr標(biāo)記的開(kāi)發(fā)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種農(nóng)作物抗病性鑒定標(biāo)記的開(kāi)發(fā)方法。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)期以來(lái)，玉米病害以其種類(lèi)多、分布廣、危害重等特點(diǎn)，已成為限制玉米產(chǎn)量的主要因素之一，常年損失為6-10%，大發(fā)生時(shí)達(dá)30% 40%，且嚴(yán)重降低了玉米品質(zhì)。近年來(lái)，由于單交種的大面積推廣種植，生態(tài)環(huán)境的改變、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)條件的改善和國(guó)際間材料交流的日益頻繁，使得玉米病害的發(fā)生趨勢(shì)呈兩種一度曾被控制的病害再度爆發(fā)流行，病害種類(lèi)增加；一些次要病害上升為主要病害。其中，由真菌引起的病害，如玉米絲黑穗病、大小斑病、莖腐病、紋枯病、彎孢菌葉斑病、銹病等真菌性病害，在玉米病害中更是占有舉足輕重的地位。發(fā)掘玉米種質(zhì)的抗病基因及其緊密連鎖的分子標(biāo)記，是抗病分子標(biāo)記輔助育種的前提和必要過(guò)程。近10年來(lái)，隨著分子生物學(xué)突飛猛進(jìn)的發(fā)展，分子標(biāo)記拓展出許多可以檢測(cè)DNA多態(tài)性的新方法。在各種基于DNA變異的分子標(biāo)記中，SSR技術(shù)以孟德?tīng)柗绞竭z傳，為共顯性標(biāo)記，高多態(tài)性，雜合度高，分布廣泛而均勻，靈敏度好，退火溫度高，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在玉米育種中得到了更為廣泛的應(yīng)用。SSR標(biāo)記的發(fā)展應(yīng)用，使玉米抗病育種進(jìn)入分子育種水平，不僅可以定位多個(gè)目標(biāo)性狀，而且縮短育種年限，降低育種成本?？梢?jiàn)，加強(qiáng)玉米抗病分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究，把現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與常規(guī)育種緊密結(jié)合，開(kāi)展分子育種將對(duì)加速培育抗病蟲(chóng)品種，防止病蟲(chóng)危害，提高玉米產(chǎn)量等具有重要意義。當(dāng)前的玉米抗病性鑒定主要是通過(guò)大田種植，人工調(diào)查的方法獲得抗病種質(zhì)，該方法耗時(shí)長(zhǎng)，病害種類(lèi)鑒定單一，人為影響因素大，且需要一定數(shù)量的土地種植材料，成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種玉米綜合抗病性鑒定有效SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)方法，從而克服現(xiàn)有玉米抗病性鑒定的不足。玉米綜合抗病性鑒定有效SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)方法，包括如下步驟(1)對(duì)大量玉米種質(zhì)進(jìn)行三大病害抗病性調(diào)查；(2)對(duì)供試材料進(jìn)行SSR標(biāo)記分析；(3)綜合抗病性鑒定有效SSR標(biāo)記的篩選。本發(fā)明方法具有耗時(shí)短，成本低，得到的結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式(1)在試驗(yàn)基地種植我國(guó)常用玉米自交系，其多為育種中常用的雜交種親本，包括常用雜種優(yōu)勢(shì)群和具代表性的自交系類(lèi)群。采用單粒點(diǎn)播，兩行區(qū)，行長(zhǎng)5. 0m，行距0. 6m, 每行15株，Mol7、黃早四分別是玉米絲黑穗病的抗感對(duì)照，齊319、掖478分別是玉米莖腐病的抗感對(duì)照。采用人工接種方法，大斑病菌株于7月中旬(12葉期)采用噴霧法進(jìn)行第一次接種，接種后覆蓋塑料膜保濕36小時(shí)，以保證發(fā)病條件，10日后進(jìn)行第二次接種。絲黑穗病病菌于在種植前進(jìn)行病菌拌土接種。莖腐病菌株(禾谷鐮刀菌)采用土壤埋入法接種，在玉米抽雄一周后進(jìn)行莖腐菌根埋，并適當(dāng)澆水，保證足夠的土壤含水量和病菌量，以滿(mǎn)足該病菌發(fā)病條件。(2)玉米進(jìn)入乳熟期開(kāi)始進(jìn)行調(diào)查，按照王曉鳴等人編著的《玉米病蟲(chóng)害手冊(cè)》專(zhuān)業(yè)性鑒定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)三大病害進(jìn)行田間調(diào)查，根據(jù)癥狀劃分單株病級(jí)數(shù)，根據(jù)單株病級(jí)數(shù)計(jì)算病株率和病情指數(shù)?？剐栽u(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)采用國(guó)家玉米品種抗病鑒定標(biāo)準(zhǔn)。(3)收集整理前人圍繞這三大病害開(kāi)展的基因定位研究結(jié)果，收集SSR引物用于玉米三大病害抗性鑒定的有效標(biāo)記篩選。(4)基于擴(kuò)增帶型清晰、穩(wěn)定、易讀性強(qiáng)且等位基因數(shù)< 3的原則，篩選有效標(biāo)記。(5)采用NTSYS軟件對(duì)篩選出抗病鑒定有效標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PC0， Principle coordinate ￡1115115^818),^:1^1^+21^1.^1^0實(shí)例一種玉米綜合抗病性鑒定有效SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)方法，包括如下步驟(1)2010年5月上旬，在吉林省農(nóng)科院公主嶺試驗(yàn)基地種植我國(guó)常用玉米自交系， 共69份，其多為育種中常用的雜交種親本，包括常用雜種優(yōu)勢(shì)群和具代表性的自交系類(lèi)群。采用單粒點(diǎn)播，兩行區(qū)，行長(zhǎng)5.0m，行距0.6m，每行15株。采用人工接種方法，大斑病菌株(未區(qū)分生理小種)由吉林省農(nóng)科院植保所提供， 于2010年5月自己繁殖，于7月中旬(12葉期)采用噴霧法進(jìn)行第一次接種，接種后覆蓋塑料膜保濕36小時(shí)，以保證發(fā)病條件，10日后進(jìn)行第二次接種。絲黑穗病病菌于2009年收集，在種植前進(jìn)行病菌拌土接種。莖腐病菌株(禾谷鐮刀菌)由吉林省農(nóng)科院植保所提供， 并于2010年5月自己繁殖，接種方法采用土壤埋入法，在玉米抽雄一周后進(jìn)行莖腐菌根埋， 并適當(dāng)澆水，保證足夠的土壤含水量和病菌量，以滿(mǎn)足該病菌發(fā)病條件。(2)玉米進(jìn)入乳熟期開(kāi)始進(jìn)行調(diào)查，按照王曉鳴等人編著的《玉米病蟲(chóng)害手冊(cè)》專(zhuān)業(yè)性鑒定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)三大病害進(jìn)行田間調(diào)查，根據(jù)癥狀劃分單株病級(jí)數(shù)，根據(jù)單株病級(jí)數(shù)計(jì)算病株率和病情指數(shù)?？剐栽u(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)采用國(guó)家玉米品種抗病鑒定標(biāo)準(zhǔn)(王曉鳴等，200 。病級(jí)分級(jí)采用5級(jí)制1級(jí)高抗(HR) ；3級(jí)抗(R) ；5級(jí)中抗(MR) ；7級(jí)感(S) ；9級(jí)高感(HS)。病株率(Disease incidence)計(jì)算公式病株率=(病株/調(diào)查總株數(shù))X 100% ；病情指數(shù)(Disease Index)計(jì)算公式病情指數(shù)=(各級(jí)病株數(shù)X相應(yīng)級(jí)數(shù)之和/調(diào)查株數(shù)X 9) X 100%。(3)收集整理前人圍繞這三大病害開(kāi)展的基因定位研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)抗病位點(diǎn)主要集中在玉米第2、6、7、8、10條染色體上，選取其中引物用于玉米三大病害抗性鑒定的有效標(biāo)記蹄選。(4)本研究利用所選取的引物，針對(duì)玉米大斑病、絲黑穗病和莖腐病三大病害，進(jìn)行抗性鑒定有效標(biāo)記的篩選。前人研究結(jié)果表明，大斑病抗病基因Htl、Ht2、Ht3、HtN屬于單顯性抗病基因，絲黑穗病主要受主效QTLqHSRl控制，莖腐病主要受Rfgl和Rpi 1基因的控制。鑒于上述原因， 本研究基于擴(kuò)增帶型清晰、穩(wěn)定、易讀性強(qiáng)且等位基因數(shù)< 3的原則，從引物中篩選出可作為檢測(cè)玉米大斑病的有效標(biāo)記umc2212、umcl316、umcl327,絲黑穗病有效標(biāo)記SSR148152， 莖腐病有效標(biāo)記SSR58。(5)采用NTSYS軟件對(duì)篩選出的5個(gè)抗病鑒定有效標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果表明，抗病自交系和感病自交系分化較明顯，在PCO圖上雖有部分重疊，沒(méi)有形成兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的群，但大部分抗病自交系形成一個(gè)B群，部分感病自交系聚類(lèi)成A群，部分兼有抗病表現(xiàn)和感病表現(xiàn)的自交系重疊在一起。通過(guò)篩選獲得的5 對(duì)有效標(biāo)記(umc2212、umcl316、umcl327、SSR148152、SSR58) 進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果顯示可將這些自交系分為2大類(lèi)群，第一個(gè)類(lèi)群主要由綜合表現(xiàn)抗病的自交系組成，第二個(gè)類(lèi)群主要由綜合表現(xiàn)感病的自交系組成。類(lèi)群I由43份綜合抗病自交系和8份綜合感病自交系組成，其中43份綜合抗病自交系中表現(xiàn)高抗性的有13份；類(lèi)群 II包括7份綜合抗病和11份綜合感病自交系，其中7份表現(xiàn)綜合抗性的自交系為齊319、 !199、四觀7、武314、B73、綜31、丹598。利用5對(duì)抗病SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)對(duì)69份自交系綜合抗感情況進(jìn)行驗(yàn)證，大體上可以將抗病和感病自交系區(qū)分。因此，篩選出的5對(duì)分子標(biāo)記可作為抗病鑒定有效SSR標(biāo)記，進(jìn)而為已有抗病種質(zhì)的篩選提供技術(shù)支撐。
權(quán)利要求
1. 一種玉米綜合抗病性鑒定有效SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)方法，其特征是采用如下步驟完成(1)對(duì)大量玉米種質(zhì)進(jìn)行三大病害抗病性調(diào)查；(2)對(duì)供試材料進(jìn)行SSR標(biāo)記分析；(3)綜合抗病性鑒定有效SSR標(biāo)記的篩選。
全文摘要
一種玉米綜合抗病性鑒定有效SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，完成的步驟是對(duì)大量玉米種質(zhì)進(jìn)行三大病害抗病性調(diào)查；對(duì)供試材料進(jìn)行SSR標(biāo)記分析；綜合抗病性鑒定有效SSR標(biāo)記的篩選。本發(fā)明方法具有耗時(shí)短，成本低，得到的結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102409086SQ20111021718
公開(kāi)日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月1日
發(fā)明者張春宵, 李曉輝, 李海云, 李紅, 趙澤雙 申請(qǐng)人:吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院