水稻OsACBP5基因及其在提高水稻抗病性中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物抗病技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及水稻0sACBP5基因及其在提高水稻抗病性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是我國的重要糧食作物，全世界一半以上的人口以水稻為主食，病蟲害浸染直接影響水稻的生長和產(chǎn)量。例如，由水稻黃單胞菌(Xan thomonas oryzae p v.0ryzae,ibo)引起的白葉枯病是水稻生產(chǎn)中的最嚴(yán)重的細(xì)菌性病害，在我國南北各稻區(qū)包括廣東地區(qū)普遍存在，造成的損失巨大。據(jù)估計(jì)白葉枯病發(fā)生時(shí)，會導(dǎo)致水稻產(chǎn)量減產(chǎn)20~30%，嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致絕收。因此，改善和提高水稻對病原菌脅迫的抗性、培育具有高抗病性的新種質(zhì)，在促進(jìn)水稻生產(chǎn)穩(wěn)步發(fā)展、保障我國的糧食安全上具有重要的作用。
[0003]開發(fā)水稻抗病基因是提高水稻對病原菌脅迫的抗性、培育具有高抗病性的新種質(zhì)的有效途徑。目前，水稻中已定位至少30個稻瘟病抗性位點(diǎn)和25個白葉枯病抗性位點(diǎn)。其中，抗稻瘟病的Pib和P1-ta和抗白葉枯病的Xa21和Xal基因已經(jīng)被克隆鑒定。但是，目前水稻的抗病基因資源還不夠豐富，而且已報(bào)道的這些抗病基因大多都是針對某一特定病害起作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種水稻抗病基因0sACBP5。
[0005]本發(fā)明的另一個目的是提供一種抗病基因0sACBP5在提高水稻抗病性中的應(yīng)用，尤其是提尚水稻抗黃單胞菌引起的白葉枯病。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下方案予以實(shí)現(xiàn)的: 一種水稻抗病基因08么08?5，該基因的全長5，579 bp (如SEQ ID N0:1所示)，CDS長
I,710 bp (如 SEQ ID NO:2 所示)，編碼 570 aa 的蛋白(如 SEQ ID NO:3 所示)。
[0007]發(fā)明人通過研宄發(fā)現(xiàn)，該基因能夠提高水稻抗黃單胞菌引起的白葉枯病。
[0008]經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明水稻抗病基因0sACBP5編碼的蛋白與擬南芥AtACBP3蛋白是同源蛋白，同AtACBP3 —樣，0sACBP5是唯——個其ACB結(jié)構(gòu)域存在于C末端的ACBP蛋白，其N末端也同樣檢測到了與AtACBP3相似的信號肽/轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域；氨基酸序列比對分析結(jié)果顯示，AtACBP3和0sACBP5蛋白中氨基酸序列的相同率為56%。
[0009]水稻0sACBP5基因在提高水稻抗病中的應(yīng)用，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1或2所示ο
[0010]本發(fā)明通過比較野生型和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因(0sACBP5基因)植物對細(xì)菌性病菌的耐受性，結(jié)果表明基因可以提高植物的抗病能力，尤其是抗稻瘟病和白葉枯病，可以廣泛應(yīng)用于基因工程領(lǐng)域有著巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用前景。實(shí)施例中雖然中做了對日本晴品種的抗病情況，但是，本發(fā)明在保護(hù)基因的用途時(shí)，對于水稻的品種并不局限于日本晴這種品種。[0011 ] 水稻0sACBP5基因在提高水稻抗黃單胞菌引起的白葉枯病中的應(yīng)用，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。
[0012]一種抗黃單胞菌引起的白葉枯病的水稻的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
51.將SEQID NO:1或2所述的0sACBP5基因克隆到PCXSN-MYC載體；
52.用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法侵染水稻，得到穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
本發(fā)明在水稻中首次發(fā)現(xiàn)了《^^3/^基因，該基因的全長5，579 bp，⑶S長1，710 bp,編碼570 aa的蛋白。用⑶D、PFAM、SMART、Interproscan程序分析預(yù)測，該蛋白有跨膜域和ACBP結(jié)構(gòu)域。通過比較突變體、野生型和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的對細(xì)菌性病菌的耐受性，發(fā)現(xiàn)基因可以提高水稻的抗病能力，可以廣泛應(yīng)用于基因工程領(lǐng)域有著巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0014]圖1為SMART程序預(yù)測0sACBP5蛋白的結(jié)構(gòu)域，含有跨膜結(jié)構(gòu)域和ACBP結(jié)構(gòu)域。
[0015]圖2為黃單胞菌(Xoo)處理16天后野生型、過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株的生長情況，CK為野生型水稻。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。
[0017]實(shí)施例1水稻0sACBP5基因的克隆
根據(jù)擬南芥中的AtACBP3的同源蛋白的同源性，在水稻基因組數(shù)據(jù)中利用Blastp程序進(jìn)行搜索，得到水稻0sACBP5蛋白，其是唯一一個其ACB結(jié)構(gòu)域存在于C末端的水稻ACBP蛋白，其N末端也同樣檢測到了與AtACBP3相似的信號肽/轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域。設(shè)計(jì)正反向引物XS258:CATGGAGCTGTTCTACGAGCTGCTCCTC ；
XS259:TCATTCAGCAGGGATGTCAGAACTCTGT ；
提取水稻葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序。水稻基因的全長5579 bp (如SEQ ID NO:1所示)，CDS長1710 bp(如 SEQ ID NO:2 所示)，編碼 570 aa 的蛋白(如 SEQ ID NO:3 所示)。用 CDD、PFAM、SMART、Interproscan程序分析預(yù)測，水稻0sACBP5蛋白有跨膜域和ACBP結(jié)構(gòu)域，見圖1。
[0018]實(shí)施例2水稻0sACBP5基因的功能研宄
將實(shí)施例1所述的基因連接到pCXSN-MYC載體上，具體步驟如下:將通過XS258和XS259引物克隆后的序列(即SEQ ID NO:2所示)序列)，通過TaKaRa的加“A”試劑盒，與用Xcm I進(jìn)行酶切的pCXSN-MYC載體相連接，在含卡那平板上進(jìn)行篩選后，通過PCR鑒定并送測序，正確后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。
[0019]將陽性載體利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到日本晴水稻中，得到穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株0sACBP5-0E，具體步驟如下: 將成熟水稻種子消毒后，經(jīng)盾片誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷，用含有鑒定正確的農(nóng)桿菌侵染，侵染20 min后將愈傷組織轉(zhuǎn)至加有一張濾紙的共培養(yǎng)基上，然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)。生長旺盛的水稻愈傷在預(yù)分化光照培養(yǎng)2-3周，轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)至分化出苗，再轉(zhuǎn)至壯苗生根培養(yǎng)基中，最后移栽到人工氣候室種植。
[0020]黃單胞菌處理野生型和轉(zhuǎn)基因水稻:分別將野生型(日本晴水稻，Oryzasativa japonica.cv.后續(xù)簡稱為CK)和轉(zhuǎn)基因水稻0sACBP5_0E的成熟種子，去穎殼，用75%酒精浸泡30~45秒，無菌水洗3次，再用20%的次氯酸鈉浸泡30分鐘，不時(shí)搖晃，水洗5次以上；消毒完成后，將三種類型的種子分別置于含有1/2 MS液體培養(yǎng)液的無菌燒杯內(nèi)培養(yǎng)。然后再種植在1/2 MS固體培養(yǎng)基上，并移入28°C (16-h光照/8_h黑暗)的人工氣候室。
[0021]待以上三種水稻生長到20天大小的植株，分別接種黃單胞菌，具體步驟如下:采用剪葉法進(jìn)行接種，利用剪出2 - 3cm的缺口，將菌齡為3 d，菌液濃度3X108 cfu，，接種后于濕度大于85%的環(huán)境中培育。
[0022]選取己完全展開的水稻野生型和轉(zhuǎn)基因植株葉片，用手術(shù)剪蘸取菌液，剪切葉片2-3 cm的缺口，接種后90%的環(huán)境中培育。
[0023]接種X00 (Pxo99)處理后16天，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻0sACBP5_0E的葉片比對照野生型水稻的葉片病斑長度與葉片總長比值低(見圖2)，這說明基因可以提高植物對黃單胞菌的抗性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種水稻抗病基因0SACBP5，其特征在于，基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或2所不O2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于，該基因能夠提高水稻抗黃單胞菌引起的白葉枯病。3.水稻OsACBP5基因在提高水稻抗病中的應(yīng)用，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO:1或2所示。4.水稻OsACBP5基因在提高水稻抗黃單胞菌引起的白葉枯病中的應(yīng)用，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。5.一種抗黃單胞菌引起的白葉枯病的水稻的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟: 51.將權(quán)利要求1所述的0SACBP5基因克隆到PCXSN-MYC載體； 52.用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法侵染水稻，得到穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的水稻品種為日本晴。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水稻OsACBP5基因及其在提高水稻抗病性中的應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)同源性分析，在水稻中克隆擬南芥AtACBP3的同源基因OsACBP5。該基因的全長5579bp，CDS長1710bp，編碼570aa的蛋白。用CDD、PFAM、SMART、Interproscan程序分析預(yù)測，該蛋白有跨膜域和ACBP結(jié)構(gòu)域。通過比較野生型和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物對細(xì)菌性病菌的耐受性，結(jié)果表明OsACBP5基因可以提高植物的抗病能力，可以廣泛應(yīng)用于基因工程領(lǐng)域有著巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12N15/82, C12N15/29, A01H5/00
【公開號】CN104946666
【申請?zhí)枴緾N201510370321
【發(fā)明人】俞陸軍, 王鳳珠, 戴陽朔, 陳琴芳, 肖仕
【申請人】中山大學(xué)
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年6月30日