專利名稱：一種大麗輪枝菌基因敲除的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種大麗輪枝菌基因敲除的方法。
背景技術：
我國是農(nóng)業(yè)大國，作為僅次于糧食的第二大農(nóng)作物的棉花是關系國計民生的戰(zhàn)略物資，也是涉及農(nóng)業(yè)和紡織エ業(yè)兩大產(chǎn)業(yè)的商品，是全國I億多棉農(nóng)收入的主要來源，是紡織エ業(yè)的主要原料，也是廣大人民的生活必需品，棉紗及棉布還是出口創(chuàng)匯的重要商品。因此，棉花的生產(chǎn)、流通、加工和消費，與人民群眾的生活和廣大棉農(nóng)的利益息息相關，對國民 經(jīng)濟的發(fā)展也有著重要影響。由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)引起的黃萎病是棉花的主要病害,嚴重影響棉花的生產(chǎn)，因此黃萎病的防治對于棉花生產(chǎn)的重要性不言而喻，其中，研究大麗輪枝菌中各個基因的功能，尤其是尋找致病相關基因是重要研究課題，而基因敲除技術是研究基因功能最有效的手段。現(xiàn)有技術中大麗輪枝菌基因敲除的方法主要包括載體構(gòu)建，農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子篩選三個關鍵步驟，其中轉(zhuǎn)化子篩選是ー個難點，人們往往要篩選大量的轉(zhuǎn)化子，以期得到需要的基因敲除的陽性轉(zhuǎn)化子。這是因為將同源重組DNA片段克隆進T-DNA(transfer DNA)后，借助農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法雖然極大地提高了同源重組片段的轉(zhuǎn)化效率，但是由于T-DNA自身的性質(zhì)，它會隨機整合到該菌基因組的某一區(qū)段，造成了T-DNA的隨機插入轉(zhuǎn)化子和同源雙交換產(chǎn)生的基因敲除的陽性轉(zhuǎn)化子都帶有同樣的抗生素選擇標簽而難于區(qū)分，而同源重組的效率相對隨機插入的效率要低很多，因此，基因敲除的轉(zhuǎn)化子數(shù)量要遠遠少于隨機插入的轉(zhuǎn)化子，從而使得陽性轉(zhuǎn)化子的篩選方法繁瑣、費時，同時浪費大量的人力、物カ和財力。因此，是ー種效率低下的基因敲除體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有技術中的缺陷，提供ー種簡便、高效的篩選陽性轉(zhuǎn)化子的大麗輪枝菌基因敲除的方法。本發(fā)明提供了一種大麗輪枝菌基因敲除的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟構(gòu)建用于同源重組的重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒由載體和同源重組DNA片段組成，所述同源重組DNA片段含有用于替代待敲除基因的外源抗性基因和位于該外源抗性基因兩側(cè)的滿足同源重組要求的側(cè)翼序列，所述載體含有外源條件致死基因；通過農(nóng)桿菌介導的方法，將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大麗輪枝菌中進行同源重組，得到轉(zhuǎn)化子，并篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。通過上述方法分別對大麗輪枝菌的ADE4基因和ChsV基因進行敲除，在隨機挑選的15個ADE4基因敲除的候選轉(zhuǎn)化子中有13個是陽性轉(zhuǎn)化子，基因敲除轉(zhuǎn)化子在總的轉(zhuǎn)化子中所占比例高達87% ;在隨機挑選的16個ChsV基因敲除的候選轉(zhuǎn)化子中有7個是陽性轉(zhuǎn)化子，基因敲除轉(zhuǎn)化子在總的轉(zhuǎn)化子中所占比例為44% ;而林春花(林春花、鄭服叢，2008)使用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化子篩選方法構(gòu)建了稻瘟病MgORPl基因敲除突變株，基因敲除轉(zhuǎn)化子在總的轉(zhuǎn)化子中所占比例僅為I. 8%。由此可見，本發(fā)明的方法相對現(xiàn)有技術的大麗輪枝菌的基因敲除方法的效率大大提聞了。


圖I為構(gòu)建用于同源重組的重組質(zhì)粒的過程圖；圖2為構(gòu)建用于同源重組的重組質(zhì)粒的各步驟反應的產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖3顯示了 ADE4基因敲除的候選轉(zhuǎn)化子的篩選結(jié)果；圖4顯示了 ChsV基因敲除的候選轉(zhuǎn)化子的篩選結(jié)果。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種大麗輪枝菌基因敲除的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟構(gòu)建用于同源重組的重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒由載體和同源重組DNA片段組成，所述同源重組DNA片段含有用于替代待敲除基因的外源抗性基因和位于該外源抗性基因兩側(cè)的滿足同源重組要求的側(cè)翼序列，所述載體含有外源條件致死基因；通過農(nóng)桿菌介導的方法，將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大麗輪枝菌中進行同源重組，得到轉(zhuǎn)化子，并篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。術語“基因敲除”為將細胞基因組中某基因去除或使基因失去活性的技木。包括去除原核生物細胞、真核生物的生殖細胞、體細胞或干細胞基因組中的基因等。廣義的基因敲除包括某個或某些基因的完全敲除、部分敲除、基因調(diào)控序列的敲除以及成段基因組序列的敲除。本發(fā)明中所述基因敲除指廣義的基因敲除。所述外源條件致死基因指非大麗輪枝菌內(nèi)源性的條件致死基因，術語“條件致死基因”指在特定條件下導致個體或細胞死亡的基因。根據(jù)本發(fā)明，所述外源條件致死基因優(yōu)選為HSVtk基因，即單純皰疹病毒胸苷激酶基因，其作用原理，是因為酶蛋白基因HSV-TK編碼的酶蛋白，可以使ー些無毒或低毒的前藥轉(zhuǎn)化為強細胞毒性物質(zhì)，所述外源條件致死基因優(yōu)選為含有SEQ ID NO : I所示序列的DNA片段，進ー步優(yōu)選為具有SEQ ID NO : I所示序列的DNA片段，并且與其相對應的，所述篩選出陽性轉(zhuǎn)化子的方法包括，向體系中加入與外源抗性基因相對應的抗生素和條件致死基因所對應的5’ -氟脫氧尿苷(F2dU)，一般地，所述體系通常指篩選陽性轉(zhuǎn)化子的固體和/或液體培養(yǎng)基，且發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，5’-氟脫氧尿苷對表達了 HSV-TK編碼的酶蛋白的大麗輪枝菌的最佳致死濃度為40-60 PM，優(yōu)選為45-55 u M，最優(yōu)選為50 y M，此時，基因敲除轉(zhuǎn)化子在總的轉(zhuǎn)化子中所占比例(即基因敲除效率)非常高。所述與外源抗性基因相對應的抗生素也可以為多種，當所述外源抗性基因為潮霉素抗性基因時，所述抗生素為潮霉素，所述潮霉素加入的濃度可以為常規(guī)的濃度值，如 20-40 u g/mL,優(yōu)選為 30 u g/mL。根據(jù)本發(fā)明的宗_，所述外源條件致死基因的作用是用于去除至少部分假陽性的轉(zhuǎn)化子，因此，在利用農(nóng)桿菌進行同源重組的基因敲除體系中，優(yōu)選地，所述外源條件致死基因位于用于轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒的T-DNA內(nèi)，所述T-DNA，即轉(zhuǎn)移DNA (transferred DNA)，為農(nóng)桿菌Ti(tumor inducing)或Ri (root inducing)質(zhì)粒中的一段DNA序列,可以從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定整合到植物核基因組中。根據(jù)本發(fā)明，所述載體為各種能夠用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的載體，優(yōu)選地，所述載體 的T-DNA序列中含有條件致死基因，并且適用于Gateway連接反應，所述載體可以通過商購得到，也可以通過基因工程制備得到；所述載體可含有如SEQ ID NO :2所示序列的DNA片段，進ー步優(yōu)選為具有SEQ ID NO :2所示序列的DNA片段，本文中，該載體命名為pGK02_Gateway 載體。根據(jù)本發(fā)明，所述外源抗性基因指非大麗輪枝菌內(nèi)源性的抗性基因，術語“抗性基因”指ー類能阻止抗生素或除草劑等藥物作用的基因或營養(yǎng)補償性基因，如某些氨基酸合成酶的基因等。這些基因的表達能賦予生物抵抗藥物等毒害或營養(yǎng)缺陷的環(huán)境，常用做選擇性遺傳標志。根據(jù)本發(fā)明，所述外源抗性基因可以為任何適用于大麗輪枝菌的抗性基因，但是考慮到基因操作的優(yōu)勢，本發(fā)明中所述抗性基因優(yōu)選為潮霉素抗性基因(Hyg)，實際應用中，引入所述潮霉素抗性基因具體指引入包含上游啟動子和終止子的Hyg抗性基因盒，本發(fā)明中所述潮霉素抗性基因也指包括上游啟動子和終止子的Hyg抗性基因盒，其基因序列為SEQ ID NO :25中的429-2537位所示的序列。根據(jù)同源重組的原理，所述位于該外源抗性基因兩側(cè)的滿足同源重組要求的側(cè)翼序列指的是與待敲除基因兩側(cè)的側(cè)翼序列相同的基因序列，所述側(cè)翼序列的選擇為本領域的常規(guī)方法，為了達到較高的同源重組的效率，所述側(cè)翼序列的長度優(yōu)選為1000-1500個 核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的原理，所述方法可以用于任何大麗輪枝菌，如中國常見的導致棉花黃萎病的大麗輪枝菌VD991，以及美國Broad研究所的大麗輪枝菌VDLs. 17，也包括其他類型的大麗輪枝菌，如從ATCC商購的大麗輪枝菌，大麗輪枝菌的菌株類型并不影響本發(fā)明的實施。根據(jù)本發(fā)明的原理，所述大麗輪枝菌中的任何基因及其它們的組合都可以成為待敲除基因，示例地，所述待敲除基因為大麗輪枝菌的ADE4基因和/或ChsV基因。根據(jù)本發(fā)明，構(gòu)建所述同源重組DNA片段的方法可以為本領域各種方法，本發(fā)明中優(yōu)選為融合PCR法，構(gòu)建所述重組質(zhì)粒的方法可以為各種常規(guī)的外源片段與載體連接的克隆方法，如酶切-連接的克隆方法，本發(fā)明中構(gòu)建所述重組質(zhì)粒的方法優(yōu)選為Gateway克隆法。所述融合PCR法為本領域公知的采用具有互補末端的引物，形成具有重疊鏈的PCR產(chǎn)物，通過PCR產(chǎn)物重疊鏈的延伸，從而將不同來源的任意DNA片段連接起來的方法，此技術在不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理的條件下實現(xiàn)DNA片段的體外連接，為同源重組片段的構(gòu)建提供了快速簡捷的途徑。根據(jù)本發(fā)明，用于融合PCR的DNA片段有三段，包括待敲除基因上游側(cè)翼序列的DNA片段，待敲除基因下游側(cè)翼序列的DNA片段和外源抗性基因盒的DNA片段，三者之間的摩爾比例可以為I : 0. 8-1.2 2-4，最優(yōu)選地，三者之間的摩爾比例為I : I : 3，其中待敲除基因上游側(cè)翼序列的DNA片段的3’端部分序列與外源抗性基因盒的DNA片段的5’端部分序列互補，外源抗性基因盒的DNA片段的3’端部分序列與待敲除基因下游側(cè)翼序列的DNA片段的5’端部分序列互補，如圖I所示，互補部分的序列來自于PCR的引物，本文中，稱其為融合PCR的接頭序列。所述Gateway克隆法是本領域公知的克隆技術，它是利用\噬菌體與大腸桿菌的染色體之間發(fā)生的位點特異性的重組整合(integrative recombination reaction)與切出(excisive recombination reaction)反應。整合反應是由整合酶 Int (integrase)和整合宿主因子IHF(Integration Host Factor)催化的。attB和attP之間的重組整合的噬菌體基因組DNA的5’和3’端含有attL和attR位點。切出的重組反應需要IHF、Int和Xis蛋白的參與。在插入E. coli基因組DNA的噬菌體基因組DNA的5’和3’端的attL和attR位點發(fā)生位點特異性的重組，重新在形成入DNA的attP位點和E. coli基因組DNA的attB位點。通過BP和LR反應就可實現(xiàn)把PCR產(chǎn)物定向轉(zhuǎn)入克隆質(zhì)粒和表達質(zhì)粒，實現(xiàn)PCR產(chǎn)物在各種質(zhì)粒間的轉(zhuǎn)移。Gateway克隆法相對酶切構(gòu)建載體來說，具有需時短、操作簡單的特點，因此縮短了載體構(gòu)建的時間。根據(jù)本發(fā)明，構(gòu)建所述重組質(zhì)粒的方法包括在融合PCR步驟之前，通過常規(guī)PCR的方法分別獲得用于融合PCR的各段DNA片段，即，待敲除基因上游側(cè)翼序列的DNA片段、夕卜源抗性基因序列的DNA片段和待敲除基因下游側(cè)翼序列的DNA片段，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，得到所述外源抗性基因的DNA片段的方法可以包括，以帶有外源抗性基因的質(zhì)粒(pUCHyg)為模板，以Hyg-F和Hyg-R為上下游引物的PCR(其中，引物中的F表示上游引物，R表示下游引物，本說明書中均如此表示)；得到所述待敲除基因上游側(cè)翼序列的DNA片段的方法可以包括，以大麗輪枝菌的基因組DNA或cDNA為模板，以5F和5R為引物進行的PCR ;得到所述待敲除基因下游側(cè)翼序列的DNA片段的方法可以包括，以大麗輪枝菌的基因組DNA或cDNA為模板，以3F和3R為引物進行的PCR，其中，5R的5’端與Hyg-F完全互補配對，3F的5’端與Hyg-R完全互補配對，以滿足融合PCR的要求。根據(jù)本發(fā)明，對所述用于擴增三段DNA片段的引物序列沒有特別的限定，優(yōu)選地，用于獲得待敲除基因上游側(cè)翼序列的DNA片段的下游引物的核酸序列如SEQ ID NO :3所示，用于獲得待敲除基因下游側(cè)翼序列的DNA片段的上游引物的核酸序列如SEQ ID NO :4所示，或者如SEQ ID N0:14和SEQ ID NO 15所示序列的引物。本發(fā)明的發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，與其他引物序列相比，使用上述序列的引物能夠大大提高融合PCR的成功率。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，構(gòu)建所述重組質(zhì)粒的方法包括在融合PCR步驟之后，以融合PCR得到的產(chǎn)物為模板，以5’端分別帶有Gateway BP反應的接頭的引物為引物，進行PCR(巢式PCR)，得到帶有接頭的同源重組DNA片段，用于下ー步與載體的連接，所述Gateway BP反應的接頭可以根據(jù)不同的載體進行選擇，如本發(fā)明中所用載體為商購的pGK02-Gateway載體時,所述接頭也相應的采用與上述載體相匹配的DNA序列，如SEQ IDNO 7 和 SEQ ID NO 8 所示。根據(jù)本發(fā)明，所述農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法可以為本領域公知的方法，包括將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，并將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞與大麗輪枝菌共培養(yǎng)，本發(fā)明的發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，所述共培養(yǎng)在微孔濾膜上進行時，重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率較高，且成本較低，并且，當所述大麗輪枝菌的孢子濃度為4X 106-6X IO6個/毫升，最優(yōu)選為5 X IO6個/毫升吋，能夠進ー步的提高重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率。根據(jù)本發(fā)明，所述方法還包括對篩選得到的陽性轉(zhuǎn)化子的驗證，一般地，對于篩選得到的轉(zhuǎn)化子首先通過PCR的方法進行驗證，所述PCR的引物根據(jù)待敲除基因進行設計，如果不能擴增出目的條帶，則可能為陽性轉(zhuǎn)化子，如果能夠擴增出目的條帶，則為陰性轉(zhuǎn)化子，但是即使不能擴增出目的條帶，也不保證一定為陽性轉(zhuǎn)化子，因此這樣的PCR驗證方法會得到一些假陽性的結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，如果將引物設計在與側(cè)翼序列相對應的位置，則可以更精確的判斷轉(zhuǎn)化子是否為陽性轉(zhuǎn)化子，能夠進一歩提高篩選的效 率。例如，用于驗證的引物為test-1和test-2，二者分別于待敲除基因上下游側(cè)翼序列完全相同或完全互補配對。當然，為了精確的驗證，仍需要進行測序。下面，通過以下實施例對本發(fā)明做更詳細的說明。DNA序列委托上海生エ公司合成，測序委托中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所公司進行；帶有外源抗性基因的質(zhì)粒PUCHyg是將Hyg基因通過Sall/Xbal酶切位點連入pUC19質(zhì)粒中得到的重組質(zhì)粒，其序列如SEQ IDNO 25所示；5’ -氟脫氧尿苷購自sigma公司；遺傳轉(zhuǎn)化所用農(nóng)桿菌菌株為AGL-I (購自Biovector中國質(zhì)粒載體菌株基因庫)；落葉型棉花黃萎病菌株大麗輪枝菌購自ATCC(商品號為26289 ) ;PCR儀型號為Biometra PCR ;測定孢子濃度使用血球計數(shù)板計數(shù)；Gateway連接中使用的試劑(如酶等)均購自Invitrogen公司，Gateway連接步驟按照Invitrogen公司試劑手冊的方法進行，所用微孔濾膜為上海新亞凈化材料廠生產(chǎn)，孔徑為0. 45 u m,所述三輪PCR反應中所用的DNA聚合酶、dNTP，提取基因組的試劑盒和PCR產(chǎn)物純化的試劑盒等分子生物學常規(guī)試劑均購自上海生エ公司，相應的分子生物學操作按照商品試劑說明書和《分子克隆》(第三版)進行。實施例I (I)構(gòu)建用于同源重組的重組質(zhì)粒，過程圖如圖I所示，包括三輪PCR過程第一輪PCR:以大麗輪枝菌的基因組DNA(完整的基因序列參見數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站http://www. broadinstitute. org/)為模板，以 5F-ADE4 和 5R-ADE4 為引物，通過 PCR 得到基因ADE4(基因序列編號為VDAG_00128，Broad研究所)上游側(cè)翼序列的DNA片段，約lOOObp，并以3F-ADE4和3R-ADE4為引物，通過PCR得到基因ADE4下游側(cè)翼序列的DNA片段，約IOOObp ；以pUCHyg為模板，以Hyg-F和Hyg-R為引物，進行PCR反應，擴增得到長度為I. Skb的潮霉素抗性基因盒的DNA片段；所述引物序列如表I所示，所述PCR的條件如表2所示；對得到的三個片段的PCR產(chǎn)物進行純化并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖2所示，其中，第一泳道為ADE4基因下游側(cè)翼序列的DNA片段，第二泳道為潮霉素抗性基因盒的DNA片段，第三泳道為ADE4基因上游側(cè)翼序列的DNA片段，最后ー個泳道M為Marker，其中，lkb, 2kb和4kb的位置已經(jīng)標識出來，圖I中ADE40RF表示ADE4基因的開放閱讀框；第二輪PCR :利用融合PCR方法，以純化后的潮霉素抗性基因盒的DNA片段，ADE4基因上、下游側(cè)翼序列的DNA片段為模板進行擴增，融合PCR的條件如表2所示；從而將上述三片段首尾相接，得到潮霉素抗性基因盒兩側(cè)各與ADE4基因上下游Ikb片段相連接的
3.Skb的同源重組DNA片段；對融合PCR的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖2第四泳道所示；由圖2可以看出，融合PCR的產(chǎn)物中同源重組DNA片段的比例很低；第三輪PCR 以第二輪PCR的產(chǎn)物為模板，以Nest-F_ADE4和Nest-R_ADE4為“巢式”引物，通過PCR獲得3. 8kb融合片段的特異性擴增產(chǎn)物，即兩側(cè)帶有Gateway BP反應接頭的同源重組DNA片段，如圖I所示，Nest-F-ADE4和Nest-R_ADE4中黑色并標識為attB的部分，引物序列如表I所示，各PCR反應的條件如表2所示，對第三輪PCR的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖2第五泳道所示，可以看出，第三輪PCR的產(chǎn)物絕大多數(shù)為同源重組DNA片段。表I
權(quán)利要求
1.一種大麗輪枝菌基因敲除的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟構(gòu)建用于同源重組的重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒由載體和同源重組DNA片段組成，所述同源重組DNA片段含有用于替代待敲除基因的外源抗性基因和位于該外源抗性基因兩側(cè)的滿足同源重組要求的側(cè)翼序列，所述載體含有外源條件致死基因；通過農(nóng)桿菌介導的方法，將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大麗輪枝菌中進行同源重組，得到轉(zhuǎn)化子，并篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述外源條件致死基因為HSVtk基因，其含有如SEQ ID NO :1所示序列的DNA片段，所述篩選出陽性轉(zhuǎn)化子的方法包括，向體系中加入與外源抗性基因相對應的抗生素和條件致死基因所對應的5’ -氟脫氧尿苷，且5’ -氟脫氧尿苷的濃度為40-60 u M0
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，所述載體的序列如SEQIDNO :2所示，所述外源條件致死基因位于載體的T-DNA中。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，所述外源抗性基因為潮霉素抗性基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，位于該外源抗性基因兩側(cè)的滿足同源重組要求的側(cè)翼序列與待敲除基因兩側(cè)的側(cè)翼序列相同，且所述側(cè)翼序列的長度為1000-1500個核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，所述待敲除基因為大麗輪枝菌的ADE4基因和/或ChsV基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，構(gòu)建所述同源重組DNA片段的方法為融合PCR法，構(gòu)建所述重組質(zhì)粒的方法為Gateway克隆法。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，構(gòu)建所述重組質(zhì)粒的方法包括在融合PCR步驟之前，通過常規(guī)PCR的方法分別獲得待敲除基因上游側(cè)翼序列的DNA片段、外源抗性基因序列的DNA片段和待敲除基因下游側(cè)翼序列的DNA片段，優(yōu)選地，用于獲得待敲除基因上游側(cè)翼序列的DNA片段的下游引物的核酸序列如SEQ ID NO 3所示，用于獲得待敲除基因下游側(cè)翼序列的DNA片段的上游引物的核酸序列如SEQ ID N0:4所示；在融合PCR步驟之后，以融合PCR得到的產(chǎn)物為模板，以5’端分別帶有GatewayBP反應的接頭的引物為引物，進行PCR，得到帶有接頭的同源重組DNA片段，用于下ー步與載體的連接。
9.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，所述農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法包括將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，并將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞與大麗輪枝菌共培養(yǎng)，其中，所述共培養(yǎng)在微孔濾膜上進行，且所述大麗輪枝菌的孢子濃度為4X 106-6X IO6個/毫升。
10.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，所述方法還包括對篩選得到的陽性轉(zhuǎn)化子的驗證，所述驗證通過PCR的方法進行，所述PCR的引物為與外源抗性基因兩側(cè)的側(cè)翼序列配對的引物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種大麗輪枝菌基因敲除的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟構(gòu)建用于同源重組的重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒由載體和同源重組DNA片段組成，所述同源重組DNA片段含有用于替代待敲除基因的外源抗性基因和位于該外源抗性基因兩側(cè)的滿足同源重組要求的側(cè)翼序列，所述載體含有外源條件致死基因；通過農(nóng)桿菌介導的方法，將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大麗輪枝菌中進行同源重組，得到轉(zhuǎn)化子，并篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。通過上述方法分別對大麗輪枝菌的ADE4和ChsV基因進行敲除，基因敲除轉(zhuǎn)化子在總的轉(zhuǎn)化子中所占比例分別為87％和44％，由此可見，本發(fā)明的方法相對現(xiàn)有技術的大麗輪枝菌的基因敲除方法的效率大大提高了。
文檔編號C12N15/63GK102653755SQ20111004930
公開日2012年9月5日 申請日期2011年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月1日
發(fā)明者戴小楓, 汪佳妮, 田李, 陳捷胤 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所