專利名稱：菊屬異色菊耐寒基因DdICE1及其植物表達載體和構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及菊屬異色菊耐寒基因DdICEl及其植物表達載體和構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
低溫是影響植物地理分布、產(chǎn)量和品質(zhì)的主要限制因子。因此，有關(guān)植物抗寒性的研究一直是植物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點之一。菊花原產(chǎn)我國，是我國十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一，觀賞和經(jīng)濟價值極高，在花卉生產(chǎn)中占有重要地位。低溫是限制菊花周年供應(yīng)的主要限制因子，為滿足市場需求，冬季需借助加溫進行生產(chǎn)。然而，昂貴的加溫成本和巨大的能源消耗已成為當(dāng)前菊花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。菊花抗寒育種一直是國內(nèi)外園藝工作者致力的重要課題之一，鑒于抗寒性是一個多基因控制的數(shù)量性狀，雜交育種等常規(guī)育種方法效率低。已有研究表明，轉(zhuǎn)高效抗寒調(diào)控基因的分子育種對提高植物抗寒性有積極作用。目前，很多抗寒相關(guān)基因被克隆，結(jié)果顯示單獨改變某一個或幾個功能基因?qū)χ仓昕购缘奶岣卟⒉伙@著。ICEl基因是已知的低溫誘導(dǎo)表達基因分子級聯(lián)路徑最上游的轉(zhuǎn)錄激活因子，也是已知的最高效抗寒調(diào)控基因(Badawi et al. 2008 ；Chinnusamy et al. 2003)。受ICEl基因調(diào)控表達的冷調(diào)節(jié)基因多達數(shù)百個，涉及抗寒的各種生理生化代謝途徑(Lee et al. 2005)。在植物的遺傳轉(zhuǎn)化途徑中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是應(yīng)用最為廣泛的方法之一，其中有效的植物表達載體至關(guān)重要。將抗寒基因構(gòu)建植物表達載體，用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化，可獲得具有耐寒特性的新種質(zhì)。對于優(yōu)良作物新品種的培育及在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，具有重要意義。參考文獻Badawi Μ, Reddy YV, Agharbaoui Ζ, Tominaga Y, Danyluk J, Sarhan F, Houde M(2008)Structure and functional analysis of wheat ICE(inducer of CBF expression)genes. Plant Cell Physiol 49:1237-1249Chinnusamy V, Ohta M, Kanrar S, Lee BH, Hong X，Agarwal M, Zhu JK (2003) ICEl :a regulator of cold-induced transcriptome and freezing tolerance in Arabidopsis. Genes Dev 17:1043—1054Earley Kff, Haag JR,Pontes 0，Opper K, Juehne T, Song K, Pikaard C S (2006) Gateway—compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant J 45 :616-629Lee BH, Henderson DA, Zhu JK(2005) The Arabidopsis cold-responsive transcriptome and its regulation by ICE1.Plant Cell 17 :3155-317
發(fā)明內(nèi)容
針對背景技術(shù)提出的解決提高菊花耐寒性的問題，本發(fā)明的目的在于提供一個新的菊屬異色菊耐寒基因DdICEl，該基因的序列為SEQ ID NO. 1。本發(fā)明的另一目的在于該耐寒基因DdICEl的植物表達載體。本發(fā)明的又一目的在于提供該耐寒基因DdICEl的植物表達載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明所構(gòu)建的植物表達載體可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)制耐寒新種質(zhì)，可用于植物品種改良。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)菊屬異色菊耐寒基因DdICEl，該基因的序列為SEQ ID NO. 1。菊屬異色菊耐寒基因DdICEl的克隆以提取的異色菊幼嫩葉片為材料，提取總 RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計引物擴增DdICEl基因，上游引物DdICEl-F :SEQ ID NO. 2下游引物DdICEl-R :SEQ ID NO. 3以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進行聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)，產(chǎn)物連接到pMD19_T Simple 載體，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，測定的序列為SEQ ID NO. 1。菊屬異色菊耐寒基因DdICEl的植物表達載體，由本發(fā)明所述的菊屬異色菊耐寒基因DdICEl與載體質(zhì)粒pEarleyGatel03構(gòu)成。上述的菊屬異色菊耐寒基因DdICEl的植物表達載體，所述的植物表達載體為 DdICEl基因插入到gateway入門載體pENTRIA的Ml I和Not I酶切微點之間，重組載體再與pEarleyGate103表達載體質(zhì)粒進行重組反應(yīng)得到。菊屬異色菊耐寒基因DdICEl植物表達載體PEarleyGatel03-DdICEl的構(gòu)建方法如下以提取的異色菊幼嫩葉片為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計引物以菊屬異色菊cDNA為模板，用高保真酶進行PCR反應(yīng)，在DdICEl基因的上游和下游分別引入MlI 和Not I酶切位點，上游引物DdICEl-gateway-F :SEQ ID NO. 4下游引物DdICEl-gateway-R :SEQ ID NO. 5PCR產(chǎn)物連接到pMD19_T Mmple載體，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒，由&il I和Not I雙酶切得到的DdICEl片段與&il I和Not I雙酶切的pENTRIA連接，轉(zhuǎn)化，提取陽性質(zhì)粒經(jīng)Nsi I單酶切線性化后與pEarleyGate103載體質(zhì)粒進行LR重組反應(yīng)，轉(zhuǎn)化，提取陽性質(zhì)粒，電泳檢測并測序驗證，植物表達載體pEarleyGate103-DdICEl構(gòu)建成功。DdICEl的植物表達載體用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化，提高植物抗寒性，方法如下(1)農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)制備及凍融法轉(zhuǎn)化；(2)擬南芥花序浸染及種子篩選；(3) PCR鑒定及抗寒評價。本發(fā)明的有益效果1.本發(fā)明提供的菊屬異色菊DdICEl是一個新的耐寒基因，該基因可提高植物耐寒性。2.本發(fā)明構(gòu)建的菊屬異色菊基因DdICEl植物表達載體為首次報道，可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)造耐寒新種質(zhì)，提高植物的耐寒性，可進行植物品種改良。


圖1為DdICEl瓊脂糖凝膠電泳分析。M :DNA Marker1 :DdICEl ；2 :pMD 19-T Simple-DdICEl 質(zhì)粒 I 和 Not I 雙酶切；3 :pEarleyGatel03-DdICEl 表達載體電泳檢測2為植物表達載體pEarleyGatel03_DdICEl圖譜。圖3為植物表達載體PEarleyGatel03-DdICEl構(gòu)建過程示意圖。圖4野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR鑒定。圖5野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥抗寒性評價。
具體實施例方式實施例IDdICEl的克隆選用菊屬異色菊(Dendranthema dichrum)作為材料，選取健康的插條，扦插成活的幼苗OO天)于低溫連續(xù)脅迫處理7天，取0.05g幼嫩葉片，參照Trizol RNA提取試劑盒(TaKaRa)說明書方法，提取葉片總RNA，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)取1 μ g 總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RNase消化cDNA產(chǎn)物，參照擬南芥ICEl序列信息(NCBI登錄號 AT3G26744)，經(jīng)01igo6. 0軟件分析設(shè)計引物擴增DdICEl ；上游引物DdICEl-F :5' -ATGCTACCGGAAAACGACA-3 ‘ (SEQ ID NO. 2)下游引物DdICEl-R :5' -AATGGCACCATGATAACCT-3 ‘ (SEQ ID NO. 3)以提取的葉片cDNA為模板，進行PCR反應(yīng)，50yL 反應(yīng)體系10XRCR Buffer 5· 0 μ L，DdlCEl-F、DdICEl-R 弓 | 物各 1. 0 μ L(20 μ mol · L-1)，dNTP mix 4. 0 μ L(2. 5mmol · L-1)，Taq DNA Polymerase 0. 2 μ L, cDNA 模板 1 μ L，ddH20 37. 8 μ L ；反應(yīng)程序95°C 預(yù)變性 ％iin，然后 94°C 解鏈 30sec，55°C 退火30sec，72°C延伸Imin 30sec，反應(yīng)33個循環(huán)，72°C延伸IOmin ；PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收純化，用 T4DNA 連接酶(TaKaRa)連接到 pMD19_T Simple 載體(TaKaRa)， 轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，序列測定為SEQ ID NO. 1 ；實施例2植物表達載體PEarleyGatel03-DdICEl的構(gòu)建設(shè)計引物進行PCR反應(yīng)，在目的基因DdICEl的上游和下游分別引入酶切位點 Sal I和Not I，PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple載體，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒，Sal I和Not I雙酶切的DdICEl片段與Ml I和Not I雙酶切的pENTRIA連接，轉(zhuǎn)化，提取的陽性質(zhì)粒經(jīng)Nsi I單酶切線性化后與pEarleyGate103載體質(zhì)粒進行LR重組反應(yīng)(Invitrogen, USA)，轉(zhuǎn)化，提取陽性質(zhì)粒，電泳檢測并測序驗證為SEQ ID N0. 1。上游引物 DdICEl-gateway-F 5' -GCGTCGACATGCTACCGGAAAACGACA-3 ‘ (SEQ IDN0. 4)，下游引物 DdICEl-gateway-R 5' -TTGCGGCCGCGAAATGGCACCATGATAACCT-3‘ (SEQ ID N0. 5) (1)以菊屬異色菊葉片cDNA作為模板，用高保真酶(I^rimeSTAR HS 0嫩卩0171^儀86，1&1^1^1)進行？0 反應(yīng)，5(^1^反應(yīng)體系10\把 RCR Buffer 5. 0 μ L, DdICE卜gateway-F、DdICE卜gateway-R 弓I 物各 1. 0 μ L (20 μ mol ·廠”，dNTP mix 4. 0 μ L(2. 5mmol ‘ Γ1), PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0. 4μ L, cDNA If 板 1 μ L,ddH20 37. 6 μ L ；反應(yīng)程序95 V 預(yù)變性 ％iin，然后 94 V 解鏈 30sec，55 °C 退火 30sec， 72°C延伸lmin 30sec，反應(yīng)30個循環(huán)，72 °C延伸IOmin ;PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒 (AXYGEN, USA)回收，連接到pMD19_T Simple載體，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒 pMD19-TSimple-DdICEl ；(2)取 gateway 入門載體 pENTRlA(Invitrogen，USA)和 pMD 19-T Simple-DdICEl 用 I 禾口 Not I 雙酶切，雙酶切體系(50μ L) :10XH Buffer 5 μ L, BSA 5yL，質(zhì)粒 pENTRIA 或 pMD19-T Simple-DdICEl 15 μ L, Sal I 2 μ L, Not I 2 μ L, ddH20 21 μ L ；37°C 反應(yīng)池；雙酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收質(zhì)粒 pENTRIA大片段和pMD19-T Simple-DdICEl小片段。用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接兩個回收的產(chǎn)物，連接反應(yīng)體系(10yL):10XT4 ligase Buffer 1 μ L，pENTRIA大片段2 μ L， pMD19-TSimple-DdICEl小片段6 μ L，T4DNA連接酶1 μ L ;16 °C過夜連接反應(yīng)，取5 μ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Τ0Ρ10感受態(tài)細(xì)胞。37°C過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒 pENTRlA-DdlCEl。(3)取質(zhì)粒 pENTRlA-DdlCEl 用 Nsi I 單酶切，酶切體系 QO μ L) =10XRE Buffer 2 μ L，Acetylated BSA 2 μ L，質(zhì)粒 pENTRlA-DdlCEl 10 μ L，Nsi I 1 μ L, ddH20 5 μ L ；37°C 反應(yīng)池，用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收質(zhì)粒pENTRlA-DdlCEl大片段。將回收的片段與pEarleyGatel03載體質(zhì)粒進行LR重組反應(yīng)，反應(yīng)體系(5 μ L) :pENTRlA_DdICEl大片段 3μ L，pEarley(iatel03 質(zhì)粒 1 μ L，LR Clonase II enzyme mix 1 μ L ;25°C反應(yīng) lh，加入 IuL Proteinase K，37°C反應(yīng)IOmin ；取2 μ L重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，37°C過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pEarleyGate103-DdICEl，電泳和測序驗證。植物表達載體pEarleyGatel03-DdICEl的構(gòu)建成功。實施例3植物表達載體pEarleyGate103-DdICEl遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥及其抗寒性鑒定(1)農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)制備及凍融法轉(zhuǎn)化從YEB (50 μ g/mL利福平)平板上挑取EHA105單菌落，接種于50mL含50 μ g/mL 利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，200rpm，培養(yǎng)至OD值0. 5，而后冰浴菌液30min，離心收集菌體，懸浮于2mL預(yù)冷的的100mM CaCl2 (20%甘油)溶液中，200 μ L/管分裝，待用。取10 μ L PEarleyGatel03-DdICEl載體質(zhì)粒，加入200μ L感受態(tài)細(xì)胞，冰浴 30min,液氮冷凍5min，37°C 5min,加入800 μ L YEB液體培養(yǎng)基，28°C 200rpm預(yù)培養(yǎng)4h,菌液涂板于YEB (50 μ g/mL利福平+50 μ g/mL卡那霉素)固體培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2天，挑取單克隆檢測，選取陽性克隆搖菌，用于擬南芥花序轉(zhuǎn)化。(2)擬南芥花序浸染及種子篩選將陽性單克隆接到50mL的YEB (50 μ g/mL利福平+50 μ g/mL卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)M小時，5000rpm離心20分鐘，然后用轉(zhuǎn)化液(1/2MS，添加50克/升的蔗糖，調(diào) PH為5. 8，然后加200 μ L/L的Silwet L-77混合)劇烈懸浮沉淀至完全懸起。將擬南芥地上部分直接浸泡于上述懸浮液中1分鐘，然后用保鮮膜完全包裹植株以保濕，放回培養(yǎng)室培養(yǎng)12小時，打開保鮮膜，待種子成熟時采收。種子消毒與播種將種子放入1. 5mL的離心管中，加入ImL 75%酒精，添加0. 1% 的Triton X-100搖晃15分鐘，然后在超凈臺中用95%的酒精洗兩次，而后直接把種子連同酒精倒在滅菌過的濾紙上，以吹干種子(放置30分鐘)，輕輕敲擊濾紙將干種子均勻撒播到篩選培養(yǎng)基上(l/2MS+20mg/L草胺磷+25mg/L氨芐青霉素)篩選培養(yǎng)10天，然后將抗性苗移栽到土中，用透明的蓋子覆蓋幼苗1周以保濕。(3) PCR鑒定及抗寒評價待抗性苗7 8片葉，提取擬南芥葉片DNA，進行PCR(引物DdICEl-F和DdICEl-R) 鑒定(圖4)。經(jīng)PCR鑒定的T1代轉(zhuǎn)基因苗繼續(xù)生長，采收T2代種子。對野生型和T2代抗性轉(zhuǎn)基因擬南芥進行低溫(_5°C、-IO0C )處理池，15天后比較抗寒性，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥 (DdICEl-13)成活率高于野生型擬南芥(圖5)。綜上所述，本發(fā)明構(gòu)建了含有耐寒基因的植物表達載體pEarleyGate103-DdICEl， 其中DdICEl首次報道。所構(gòu)建的載體可導(dǎo)入植物中，提高植物的抗寒特性。
權(quán)利要求
1.菊屬異色菊耐寒基因DdlCEl，該基因的序列為SEQID NO. 1。
2.菊屬異色菊耐寒基因DdICEl的植物表達載體，其特征在于由權(quán)利要求1所述的菊屬異色菊耐寒基因DdICEl與載體質(zhì)粒pEarleyGatel03構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的菊屬異色菊耐寒基因DdICEl的植物表達載體，其特征在于所述的植物表達載體為DdICEl基因插入到gateway入門載體pENTRIA的Ml I和Not I酶切位點之間后，重組載體再與pEarleyGate103表達載體質(zhì)粒進行重組反應(yīng)得到。
4.權(quán)利要求2或3所述的菊屬異色菊耐寒基因DdICEl植物表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟以異色菊幼嫩葉片為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計引物以菊屬異色菊cDNA為模板，用高保真酶進行PCR反應(yīng)，在DdICEl基因的上游和下游分別引入Ml I和NotI酶切位點，上游引物 DdICEl-gateway-F :SEQ ID NO. 4下游引物 DdlCEl-gateway-R :SEQ ID NO. 5PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple載體，轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒，由Sal I和Not I雙酶切得到的DdICEl片段與Ml I和Not I雙酶切的pENTRIA連接，轉(zhuǎn)化，提取陽性質(zhì)粒經(jīng)Nsi I單酶切線性化后與pEarleyGate103載體質(zhì)粒進行LR重組反應(yīng)，轉(zhuǎn)化，提取陽性質(zhì)粒，電泳檢測并測序驗證，植物表達載體pEarleyGate103-DdICEl構(gòu)建成功。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及菊屬異色菊耐寒基因DdICE1及其表達載體和構(gòu)建方法。DdICE1基因的序列為SEQ ID NO.1，所述的表達載體是將DdICE1基因插入到gateway入門載體pENTR1A的Sal I和Not I酶切位點之間，重組的pENTR1A-DdICE1質(zhì)粒Nsi I單酶切線性化后與pEarleyGate103載體質(zhì)粒進行LR重組反應(yīng)得到的。直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)造耐寒新種質(zhì)，提高植物的耐寒性，可進行植物品種改良。
文檔編號C12N15/66GK102161995SQ20111004915
公開日2011年8月24日 申請日期2011年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月1日
發(fā)明者劉兆磊, 房偉民, 滕年軍, 管志勇, 蔣甲福, 陳發(fā)棣, 陳煜 , 陳素梅 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)