專利名稱：輪枝菌纖溶酶及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從絡(luò)石內(nèi)生真菌輪枝菌發(fā)酵液中制備能降解纖維蛋白的可用于治療血栓栓塞性疾病的溶血栓纖溶酶————輪枝菌纖溶酶。
背景技術(shù)：
血栓栓塞性疾病是當前危害人類健康，致殘率與致死率最高的疾病之一。目前臨床上治療多采用尿激酶、鏈激酶等溶栓藥物來進行治療。但鏈激酶的抗原性強，尿激酶雖然抗原性較小，但在體內(nèi)的半衰期短，長期大量用藥則有全身性出血的傾向。我國臨床應用的還有蝮蛇抗栓酶、口服蚓激酶和水蛭素等，但應用效果都不是很好，伴有發(fā)熱、頭痛和過敏性休克等不良免疫反應。國際上，日本開發(fā)出的重組組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(γt-PA)以及美國生物遺傳科學公司開發(fā)出的單克隆抗體MH-1具有良好血栓溶解作用，但是其給藥方式均為靜脈注射，對制劑的要求特別高，價格昂貴。因此尋找各種新來源的溶栓藥物是非常必要的。此外，一般而言蛋白質(zhì)藥物分子量越大越容易引起免疫反應，所以應篩選分子量小的。
目前，從微生物中分離纖溶酶已有一些報道，其中包括枯草桿菌(Bacillussp.)、鏈霉菌(Streptomyces)、豆豉桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)以及側(cè)耳(Plerotus ostreatus)和冬菇(Flammulina velutipes)等，然而，利用輪枝菌特別是植物內(nèi)生菌來分離纖溶酶，至今沒有任何報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種原材料豐富、操作簡便易行，便于工業(yè)化生產(chǎn)的價格低廉、安全無毒的溶栓藥物，以彌補尿激酶等藥物在生產(chǎn)和治療方面的不足。
植物內(nèi)生菌是指在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織和器官內(nèi)部的真菌或細菌，被感染的宿主植物一般不表現(xiàn)出外在病癥。我們首次從絡(luò)石內(nèi)生真菌輪枝菌(Verticillium sp.)中獲得纖溶酶，命名為輪枝菌纖溶酶。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種輪枝菌纖溶酶，它是從絡(luò)石(Trachelospermum jasminoides)內(nèi)生真菌輪枝菌(Verticillium sp.)發(fā)酵所得的發(fā)酵液經(jīng)鹽析得沉淀，沉淀經(jīng)透析脫鹽后，以DEAE-纖維素層析，收集活性峰，透析后冷凍干燥，得粗酶，粗酶進行制備電泳，洗脫后得到的分子量約為33kD，等電點約為8.5的純輪枝菌纖溶酶。
一種上述的輪枝菌纖溶酶的制法，它包括下列步驟步驟一、將從絡(luò)石(Trachelospermum jasminoides)內(nèi)生真菌輪枝菌(Verticillium sp.)菌株在馬鈴薯-葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基上25-29℃培養(yǎng)3-5天，之后接種于查氏培養(yǎng)基(蔗糖1-3％，NaNO30.1-0.3％，KCl 0.01-0.05％，MgSO40.01-0.05％，F(xiàn)eSO40.0005-0.001％，K2HPO40.01-0.03％，酵母膏0.1-0.5％)培養(yǎng)3-5天，再轉(zhuǎn)種于同一培養(yǎng)基，25-29℃培養(yǎng)6-9天，將培養(yǎng)物離心或過濾得發(fā)酵液，步驟二、在步驟一所得的發(fā)酵液中，加入(NH4)2SO4至90％飽和度，靜置后離心收獲沉淀，步驟三、將步驟二所得的沉淀溶解后以Sephadex G-25柱層析或透析法脫鹽，步驟四、以DEAE-纖維素層析，用Tris-HCl緩沖液洗脫，280nm紫外檢測，收集活性峰的洗脫液，洗脫液經(jīng)透析后冷凍干燥，得到輪枝菌纖溶酶的粗酶，步驟五、將步驟四所得的輪枝菌纖溶酶的粗酶以8-10％聚丙烯酰胺凝膠進行制備電泳，洗脫后即得純的輪枝菌纖溶酶。
上述的輪枝菌纖溶酶的制法，步驟一中所述的，查氏培養(yǎng)基為含蔗糖1-3％、NaNO30.1-0.3％、KCl 0.01-0.05％、MgSO40.01-0.05％、FeSO40.0005-0.001％、K2HPO40.01-0.03％和酵母膏0.1-0.5％的水溶液。
上述的輪枝菌纖溶酶的制法，步驟四中，洗脫液冷凍干燥可以用超濾脫鹽濃縮替代。
上述的輪枝菌纖溶酶的制法，步驟五中，粗酶也可以經(jīng)疏水層析和FPLC凝膠過濾色譜純化，得到純的輪枝菌纖溶酶，或者粗酶經(jīng)CM-纖維素離子交換層析和FPLC凝膠過濾色譜純化，得到純的輪枝菌纖溶酶。
本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，輪枝菌纖溶酶有直接降解纖維蛋白的纖溶活性，有良好的血栓溶解作用，因此輪枝菌纖溶酶可以用于制備抗血栓的藥物。
本發(fā)明的輪枝菌纖溶酶具有直接降解纖維蛋白的作用，纖溶活性好。輪枝菌纖溶酶的分子量約33KD，等電點約為8.5，具有廣泛的pH穩(wěn)定性。其纖溶活性可被PMSF抑制，而不受EDTA影響。通過液體發(fā)酵，使得原材料豐富、操作簡便易行，便于工業(yè)化生產(chǎn)，因此有可能開發(fā)成為臨床較理想的新型抗血栓藥物。
四

圖1輪枝菌纖溶酶的SDS-PAGE，1蛋白質(zhì)標準，2輪枝菌纖溶酶樣品。
圖2溫度對輪枝菌纖溶酶活性的影響。
圖3pH對輪枝菌纖溶酶活性的影響。
圖4不同PH對輪枝菌纖溶酶穩(wěn)定性的影響。
五具體實施例方式
實施例1.輪枝菌纖溶酶的制備(1)發(fā)酵將從絡(luò)石(Trachelospermum jasminoides)內(nèi)生真菌輪枝菌(Verticillium sp.)菌株在馬鈴薯-葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基上25-29℃培養(yǎng)3天左右，之后接種于查氏培養(yǎng)基(蔗糖1-3％，NaNO30.1-0.3％，KCl 0.01-0.05％，MgSO40.01-0.05％，F(xiàn)eSO40.0005-0.001％，K2HPO40.01-0.03％，酵母膏0.1-0.5％)培養(yǎng)4天，再轉(zhuǎn)種于同一培養(yǎng)基，25-29℃培養(yǎng)7天，將培養(yǎng)物離心或過濾得發(fā)酵液。
(2)鹽析在1000mL發(fā)酵液中加入600g(NH4)2SO4攪拌溶解至90％飽和度。4℃冰箱中過夜，然后7500rpm，4℃離心15min，收集沉淀。
(3)脫鹽將步驟(2)所得沉淀溶解后，10000rpm，4℃離心15min，取上清，用Tris-HCl緩沖液透析過夜。
(4)離子交換柱層析取10mL上述樣品，以DEAE-纖維素層析，用Tris-HCl緩沖液洗脫，280nm紫外檢測，收集活性峰。將層析所得含活性部分的洗脫液超濾脫鹽、濃縮(濃縮至原體積的1/10)，得輪枝菌纖溶酶粗酶。
(5)疏水層析柱分離將上述粗酶溶液10mL用含1M(NH4)2SO4的Tris-HCl緩沖液透析，然后用疏水層析柱(Octyl Sepharose 4FF，1.6×10cm)進行分離，以含1---0M(NH4)2SO4的Tris-HCl緩沖液進行梯度洗脫，280nm紫外檢測，收集活性峰。
(6)將步驟(5)所得含活性部分的洗脫液超濾濃縮后，以FPLC(Superdex75)凝膠過濾色譜純化，得輪枝菌纖溶酶純品。
實施例2.輪枝菌纖溶酶的制備除步驟(5)不同于實施例1外，其它步驟同實施例1。步驟(5)改用如下方法將粗酶溶液10mL用磷酸緩沖液透析，然后以CM-纖維素離子交換層析，以含0-0.6M NaCl的磷酸緩沖液進行梯度洗脫，280nm紫外檢測，收集活性峰。
實施例3.輪枝菌纖溶酶的制備步驟(1)和(2)同實施例1。
(3)將步驟(2)所得沉淀用Tris-HCl緩沖液溶解后，10000rpm，4℃離心15min，取上清，以SephadexG-100柱(2.6×100cm)層析進行初步分離，用紫外分光光度計測280nm吸光值，收集活性峰，超濾濃縮。
(4)將步驟(3)所得含活性部分的洗脫液，以DEAE-纖維素層析，用Tris-HCl緩沖液洗脫，280nm紫外檢測，收集活性峰。
(5)將步驟(4)所得含活性部分的洗脫液超濾、濃縮(濃縮至原體積的1/10)，得輪枝菌纖溶酶粗酶。
(6)將粗酶溶液10mL用磷酸緩沖液透析，然后以CM-纖維素離子交換層析，以含0-0.6M NaCl的磷酸緩沖液進行梯度洗脫，280nm紫外檢測，收集活性峰，即得輪枝菌纖溶酶純品。
實施例4.輪枝菌纖溶酶的制備除步驟(3)外，其它步驟同實施例1。步驟(3)改用如下方法(3)將步驟(2)所得沉淀溶解后，10000rpm，4℃離心15min，取上清，以Sephadex G-25柱(2.6×75cm)層析脫鹽，加樣量為20mL，洗脫液為0.02MTris-HCl緩沖液。
實施例5.輪枝菌纖溶酶的制備除步驟(6)外，其它步驟同實施例1。步驟(6)改用如下方法(6)將粗酶用10％聚丙烯酰胺凝膠進行制備電泳，得輪枝菌纖溶酶純品。
實施例6.輪枝菌纖溶酶的性質(zhì)研究(1)輪枝菌纖溶酶的分子量和等電點根據(jù)輪枝菌纖溶酶在SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳中的遷移率，其分子量約為33kD(見附圖1輪枝菌纖溶酶的SDS-PAGE)；在等電聚焦電泳中顯示其等電點約為8.5。所以該酶屬于堿性蛋白，而且分子量較小(小于尿激酶54kD)。
(2)輪枝菌纖溶酶活性的測定采用酶標儀法及平板法，具體做法如下方法一、酶標儀法在96孔細胞培養(yǎng)板上每孔先后加入含1.2mg/mL纖維蛋白原的50mM Tris緩沖液(pH8.0)238.5μL和105U/mL凝血酶溶液1.5μL制成小血栓，待血栓形成后在每個孔中分別加15μL樣品液，用酶標儀同時測定多個樣品在630nm的光吸收值的變化。在反應初期，血栓吸光度的降低同時間呈線性關(guān)系，其回歸方程的斜率k的相反數(shù)與酶活性成正比。該法耗時短，且可同時作多個樣品，在纖溶酶純化過程中洗脫峰的纖溶酶活性檢測主要用此法。
方法二、纖維蛋白平板法試劑纖維蛋白原(牛血)溶液用含10mM pH8.0磷酸緩沖液的生理鹽水配成3.2mg/mL凝血酶(牛血)溶液用含10mM pH8.0磷酸緩沖液的生理鹽水配成105U/mL0.6％瓊脂糖溶液用含10mM pH8.0磷酸緩沖液的生理鹽水配成輪枝菌纖溶酶樣品，用磷酸鹽緩沖液配成一定濃度。
操作在直徑為9cm平皿里，先加入3mL纖維蛋白原溶液，再加入含100μL凝血酶溶液的0.6％瓊脂糖溶液12mL，快速搖勻，靜置1小時。用微量進樣器點樣5μL，蓋上玻蓋，于37℃恒溫箱中保溫16h后取出，用卡尺測出溶圈垂直兩直徑，相乘得一積。以溶圈直徑乘積作縱坐標，尿激酶標準品的濃度為橫坐標作圖，即可在圖上查出樣品的活力單位。在輪枝菌纖溶酶活性特征研究中主要采用此法。
(3)直接降解纖維蛋白活性特征的測定采用平板法，分別以兩種平板一種加有纖溶酶原和一種不加纖溶酶原且80℃加熱滅活市售纖維蛋白原可能混有的纖溶酶原，測定輪枝菌纖溶酶的纖溶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種平板上的溶圈面積無明顯差異，由此說明輪枝菌纖溶酶的纖溶活性是直接降解纖維蛋白。
(4)溫度對酶活性的影響分別在不同溫度下測定輪枝菌纖溶酶的活性，結(jié)果表明其最適反應溫度在50-60℃之間。(見附圖2溫度對輪枝菌纖溶酶活性的影響)。
(5)pH對酶活性的影響將輪枝菌纖溶酶分別用不同pH的緩沖液溶解，然后在不同pH下用平板法測定酶的活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其最適pH在10左右。(見附圖3pH對輪枝菌纖溶酶活性的影響)。
又將酶溶于不同pH的緩沖液中，室溫放置6小時后調(diào)pH至8.0，測定剩余活力，結(jié)果表明輪枝菌纖溶酶在pH4.0-10.0穩(wěn)定性都較好。(見附圖4不同pH對輪枝菌纖溶酶穩(wěn)定性的影響)。
(6)不同抑制劑對酶活性的影響將輪枝菌纖溶酶分別溶于不同抑制劑0.5mM PMSF，5mM EDTA，5mMDTT和0.1％SDS，37℃下放置10min，測定剩余活力，結(jié)果表明輪枝菌纖溶酶活性可被PMSF抑制，而不受EDTA影響(見表1不同抑制劑對輪枝菌纖溶酶活性的影響)，由此說明輪枝菌纖溶酶是一種絲氨酸蛋白酶，而不是金屬蛋白酶。
表1不同抑制劑對輪枝菌纖溶酶活性的影響抑制劑 濃度 相對活性(％)None100PMSF 0.5mM1.23EDTA 5mM 97.5SDS0.1％62.6DTT5mM 69.4實施例7.輪枝菌纖溶酶的藥理作用(1)急性毒性小將輪枝菌纖溶酶小鼠靜脈注射8000U/kg無死亡。
(2)溶栓活性強體外自然血凝塊的溶解抽取一定量的大鼠血，倒入平皿中，凝血后，用pH7.5，10mM PBS洗滌(加入PBS后搖幾下8000rpm 5min，重復2次)后，分別稱取500mg，放入離心管中，然后分別加入不同樣品①4mL生理鹽水，②含75μg輪枝菌纖溶酶的4mL同樣溶液，③含100U/mL尿激酶的4mL同樣溶液，37℃保溫并不時振蕩，每隔一定時間稱重一次，記錄血塊重量。結(jié)果如表2。由此可見，輪枝菌纖溶酶急性毒性小，溶栓活性強，可用于生產(chǎn)治療腦血栓、心肌梗塞等引起的血栓性疾病的藥物。
表2輪枝菌纖溶酶體外溶解血塊的作用
權(quán)利要求
1.一種輪枝菌纖溶酶，其特征是它是從絡(luò)石內(nèi)生真菌輪枝菌發(fā)酵所得的發(fā)酵液經(jīng)鹽析得沉淀，沉淀經(jīng)透析脫鹽后，以DEAE-纖維素層析，收集活性峰，透析后冷凍干燥，得粗酶，粗酶進行制備電泳，洗脫后得到的分子量約為33kD，等電點約為8.5的純輪枝菌纖溶酶。
2.一種上述的輪枝菌纖溶酶的制法，其特征是它包括下列步驟步驟一、將從絡(luò)石內(nèi)生真菌輪枝菌菌株在馬鈴薯-葡萄糖培養(yǎng)基上25-29℃培養(yǎng)3-5天，之后接種于查氏培養(yǎng)基培養(yǎng)3-5天，再轉(zhuǎn)種于同一培養(yǎng)基，25-29℃培養(yǎng)6-9天，將培養(yǎng)物離心或過濾得發(fā)酵液，步驟二、在步驟一所得的發(fā)酵液中，加入(NH4)2SO4至90％飽和度，靜置后離心收集沉淀，步驟三、將步驟二所得的沉淀溶解后以Sephadex G-25柱層析或透析法脫鹽，步驟四、以DEAE-纖維素層析，用Tris-HCl緩沖液洗脫，280nm紫外檢測，收集活性峰的洗脫液，洗脫液經(jīng)透析后冷凍干燥，得到輪枝菌纖溶酶的粗酶，步驟五、將步驟四所得的輪枝菌纖溶酶的粗酶以7.5％聚丙烯酰胺凝膠進行制備電泳，洗脫后即得純的輪枝菌纖溶酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的輪枝菌纖溶酶的制法，其特征是步驟一中所述的查氏培養(yǎng)基為含蔗糖1-3％、NaNO30.1-0.3％、KCl 0.01-0.05％、MgSO40.01-0.05％、FeSO40.0005-0.001％、K2HPO40.01-0.03％和酵母膏0.1-0.5％的水溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的輪枝菌纖溶酶的制法，其特征是步驟四中，洗脫液冷凍干燥用超濾脫鹽、濃縮替代。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的輪枝菌纖溶酶的制法，其特征是步驟五中，粗酶經(jīng)疏水層析和FPLC凝膠過濾色譜純化，得到純的輪枝菌纖溶酶，
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的輪枝菌纖溶酶的制法，其特征是步驟五中，粗酶經(jīng)CM-纖維素離子交換層析和FPLC凝膠過濾色譜純化，得到純的輪枝菌纖溶酶。
7.輪枝菌纖溶酶在制備抗血栓藥物中的應用。
全文摘要
一種輪枝菌纖溶酶，它是從絡(luò)石內(nèi)生真菌輪枝菌發(fā)酵所得的發(fā)酵液經(jīng)鹽析得沉淀，沉淀經(jīng)透析脫鹽后，以DEAE－纖維素層析，收集活性峰，透析后冷凍干燥，得粗酶，粗酶進行制備電泳，洗脫后得到的分子量約為33kD，等電點約為8.5的純輪枝菌纖溶酶。輪枝菌纖溶酶有直接降解纖維蛋白的纖溶活性，有良好的血栓溶解作用，因此輪枝菌纖溶酶可以用于制備抗血栓的藥物。本發(fā)明公開了輪枝菌纖溶酶的制備方法。
文檔編號C12N9/68GK1563370SQ200410014430
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月25日
發(fā)明者譚仁祥, 李英, 雙驚雷, 黃午陽, 袁偉偉 申請人:南京大學