一種具有殺線蟲功能的刀孢輪枝霉基因工程菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及一種具有殺線蟲功能的刀孢輪枝霉基因工程菌株(Lecanicilliumpsall1tae AaIT)及其應(yīng)用，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】:
[0002]植物寄生線蟲是世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的植物病害。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年因植物寄生線蟲造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)1570億美元，其中尤以根結(jié)線蟲、胞囊線蟲最為嚴(yán)重。在我國，植物寄生線蟲危害蔬菜、糧食、煙草、油料、水果等幾乎所有的農(nóng)作物，對(duì)許多重要農(nóng)作物的危害已經(jīng)超過其它植物病害，且呈逐年增加的趨勢(shì)。目前，我國對(duì)植物寄生線蟲的防治主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥。但化學(xué)農(nóng)藥在毒殺線蟲的同時(shí)，對(duì)其他生物的高毒性，在農(nóng)作物和土壤環(huán)境中的殘留等，都嚴(yán)重影響食品安全與環(huán)境生態(tài)安全。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，我國社會(huì)正由溫飽型向全面小康型轉(zhuǎn)變，人民生活也由吃飽向吃好轉(zhuǎn)變，健康綠色食品是現(xiàn)代生活的基本需求。因此，研究開發(fā)生物殺線蟲劑已經(jīng)成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中必須解決的關(guān)鍵問題。而利用線蟲天敵對(duì)有害線蟲進(jìn)行生物防治逐漸受到人們的關(guān)注。盡管食線蟲真菌作為重要的線蟲生防資源已經(jīng)得到廣泛的研究和應(yīng)用，但現(xiàn)有微生物殺線蟲劑毒力有限、防效不穩(wěn)成為建立作物病原線蟲有效防控體系面臨的主要難題。因此，通過增強(qiáng)殺線蟲真菌的毒性，提高殺線蟲真菌和細(xì)菌的殺線蟲能力，構(gòu)建高效線蟲生防工程菌，成為有效控制病原線蟲的新途徑。
[0003]蝎子毒是一種神經(jīng)毒素，能作為研究蛋白質(zhì)的理想材料；由于蝎子毒素具有高度選擇性和特異性，而且編碼的基因較小，便于分子操作，因此是研究蛋神經(jīng)生物學(xué)、免疫學(xué)、白質(zhì)工程和離子通道的理想材料。近年來，已經(jīng)有不少學(xué)者利用蝎子毒來開發(fā)新型生物殺蟲劑。例如，Wang等曾將一種來自黃肥尾蝎(Androctonus australis)的昆蟲特異性神經(jīng)毒素(neurotoxin)AaIT轉(zhuǎn)入金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)中，促進(jìn)這種真菌殺蟲劑的毒性。Lu等人2008年將蝎子毒基因AaIT成功轉(zhuǎn)入昆蟲病原真菌球孢白僵菌Beauveria bassiana中，同樣大大提高了該菌對(duì)昆蟲的毒殺作用。雖然將蝎子毒基因轉(zhuǎn)入昆蟲病原菌中提高昆蟲病原菌對(duì)昆蟲的毒性已經(jīng)報(bào)道，而目前為止，尚無利用蝎子毒基因構(gòu)建線蟲生物防治工程菌株的報(bào)道。
[0004]在眾多食線蟲真菌中，輪枝霉(Lecanicillium)是一類非常重要的生物防治真菌資源，它們能寄生于游離線蟲(內(nèi)寄生)和固著線蟲的卵、雌蟲及胞囊。刀孢輪枝霉(Lecanicillium psall1tae)作為輪枝霉屬中最為重要的食線蟲真菌,具有極強(qiáng)的殺線蟲效果。本發(fā)明以具有較好生防效果的刀孢輪枝霉作為出發(fā)菌株，運(yùn)用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)將自于黃肥尾蝎的蝎毒素基因AaIT導(dǎo)入，得到具有更高殺線蟲活性的工程菌株。
[0005]經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見與本發(fā)明相同的公開文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種具有殺線蟲功能的刀孢輪枝霉基因工程菌株(Lecanicillium psall1tae AaIT)及其應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明通過對(duì)一株刀孢輪枝霉菌株進(jìn)行基因改造，提高殺線蟲活性，開發(fā)高效生物殺線蟲制劑。本發(fā)明通過對(duì)刀孢輪枝霉菌株(中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)菌株號(hào):CGMCC1312)進(jìn)行基因工程改造，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)將來自于黃肥尾蝎的蝎子毒基因AaIT轉(zhuǎn)入到刀孢輪枝霉菌株中，獲得一株具有較高殺線蟲活性的刀孢輪枝霉基因工程菌株(Lecanicillium psall1tae-AalT)。該工程菌株已于2014年12月5日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏單位地址:中國武漢市武漢大學(xué)；保藏號(hào)為CCTCCM 2014629。
[0008]插入的AaIT的基因序列如下:
[0009]CGGGATCCTGTTCATGGAACATCACACTCGCTGACTCTGGACACCAACTG TATTCACTCGCTAATTCGTTCCTGGCTCAAATTCTTTTCCGTTCCCTAGACCAT CATGCGTGAACTTTCTTCGGTTCTCGCCCTTTCGGGCTTGCTGGCCCTGGCGTC GGCAAAGAAGAACGGCTACGCCGTCGATAGCAGCGGCAAGGCCCCCGAGTGC CTGCTGAGCAACTACTGCAACAACCAGTGCACCAAGGTCCACTACGCCGATA AGGGCTACTGCTGCCTGCTGAGCTGCTACTGCTTCGGCCTGAACGATGATAAG AAGGTCCTGGAGATCAGCGATACCCGTAAGAGCTACTGCGATACCACCATCATCAACTAAGGATCCCG.
[0010]其中:
[0011 ] GGATCC部分為BamHI內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)；
[0012]TGTTCATGGAACATCACACTCGCTGACTCTGGACACCAACTGTATTCACT CGCTAATTCGTTCCTGGCTCAAATTCTTTTCCGTTCCCTAGACCATC 部分為啟動(dòng)子；
[0013]ATGCGTGAACTTTCTTCGGTTCTCGCCCTTTCGGGCTTGCTGGCCCTGGCG TCGGCA 部分編碼AaIT的信號(hào)肽；
[0014]AaIT的氨基酸序列如下:
[0015]MRELSSVLALSGLLALASAKKNGYAVDSSGKAPECLLSNYCNNQCTKVHYA DKGYCCLLSCYCFGLNDDKKVLEISDTRKSYCDTTIIN.
[0016]其中:MRELSSVLALSGLLALASA部分為 AaIT 的信號(hào)肽。
[0017]本發(fā)明的具有殺線蟲功能的食線蟲真菌刀孢輪枝霉基因工程菌株(Lecanicillium psall1tae AaIT)在制備用于防治秀麗隱桿線蟲制劑中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明的有益效果在于:
[0019]刀孢輪枝霉基因工程菌株(Lecanicillium psall1tae AaIT)較野生型出發(fā)菌株具有更高的殺線蟲活性。當(dāng)菌株培養(yǎng)在固體CMA培養(yǎng)基上時(shí)，基因工程菌對(duì)線蟲的致死率在36小時(shí)達(dá)95%以上，而菌株的發(fā)酵液在36小時(shí)對(duì)線蟲的致死率達(dá)到94%，能夠在制備殺線蟲制劑中應(yīng)用。
【附圖說明】:
[0020]圖1顯示刀孢輪枝霉出發(fā)菌株和工程菌菌株以及它們的發(fā)酵液在12小時(shí)，24小時(shí)和36小時(shí)對(duì)秀麗隱桿線蟲的致死率的比較。其中:
[0021]圖1(a)顯示CMA平板上，刀孢輪枝霉基因工程菌株與野生型菌株在12小時(shí)，24小時(shí)和36小時(shí)對(duì)秀麗隱桿線蟲的致死率；
[0022]圖1 (b)顯示刀孢輪枝霉基因工程菌株與野生型菌株發(fā)酵液在12小時(shí)，24小時(shí)和36小時(shí)對(duì)秀麗隱桿的致死率。【具體實(shí)施方式】:
[0023]以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
[0024]一、刀孢輪枝霉基因工程菌株(Lecanicillium psall1tae AaIT)構(gòu)建方法
[0025]1.構(gòu)建基因轉(zhuǎn)化載體；
[0026]載體的構(gòu)建方法如下:用引物AaIT-f和AaIT-r擴(kuò)增得到蝎子毒基因AalT，同時(shí)在5’端和3’端引入BamHI酶切位點(diǎn)。用限制性內(nèi)切酶BamHI將載體ρΑΝ52_1Ν切開，用連接酶將擴(kuò)增得到的AaIT片段與線性化的ρΑΝ52-1Ν進(jìn)行連接，構(gòu)建得到pAN52_AaIT轉(zhuǎn)化載體。
[0027]用來擴(kuò)增AaIT基因383bp片段的相關(guān)引物如下:
[0028]AaIT-f:5’ -CGGGATCCTGTTCATGGAACATC-3，;下劃線表示在該基因片段 5’ 端引入BamHI酶切位點(diǎn)
[0029]AaIT-r:5’ ~CGGGATCCGCGGCCGCTTAGTTGA~3，;下劃線表示在該基因片段 3’ 端引入BamHI酶切位點(diǎn)
[0030]2.轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體
[0031]2.1原生質(zhì)體的制備方法
[0032]I)將出發(fā)菌株刀孢輪枝霉接種到PDA或OA平板上，放置于28°C恒溫箱中培養(yǎng)8d后，取直徑0.5cm的菌絲圓片(最好取菌落邊緣的菌絲塊)，接種于100ml TG液體培養(yǎng)基中，28°C，145rpm 搖瓶培養(yǎng) 24_36h ；
[0033]2)用滅過菌的墊有6層擦鏡紙的漏斗過濾收集養(yǎng)好的菌絲，并用滅菌水洗滌2次菌絲體，再用麗buffer洗滌菌絲2次。
[0034]3)將收集的0.5g菌絲體懸浮于1ml細(xì)胞壁降解酶液中(MN溶液中含有過濾除菌的 10mg/ml snailase 和 10mg/ml cellulase,)中，30°C，160rpm 酶解 3.5-4.5h,在此期間用顯微鏡鏡檢，觀察裂解出來的原生質(zhì)體的濃度；
[0035]4)用滅過菌的墊有4層擦鏡紙的漏斗過濾去除未酶解掉的菌絲，然后將收集的含原生質(zhì)體的溶液轉(zhuǎn)移到1.5m