專利名稱：阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的固定化以及使用所述阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶制備d-阿洛酮糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過使用來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)且以食品安全形式表達(dá)的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶(psicose-epimerase)而連續(xù)地由D-果糖或D-葡萄糖制備D-阿洛酮糖的方法。
背景技術(shù)：
D-阿洛酮糖已廣泛用作功能性甜味劑，其具有類似于糖的甜味，但卻是超低能量(ultralow-energy)單糖。具體來(lái)說(shuō)，D-阿洛酮糖被稱為“稀有糖”，因?yàn)槠湓谧匀唤缰泻苌倌苷业?，并且即使找到，也只有少量。D-阿洛酮糖是D-果糖的差向異構(gòu)體Gpimer)，并且其甜味強(qiáng)度和種類完全類似于D-果糖。然而，與D-果糖相反，因?yàn)槲盏襟w內(nèi)時(shí)，D-阿洛酮糖很少被代謝，因此其具有 幾乎零卡路里。此外，由于其通過抑制關(guān)于脂質(zhì)合成的酶活性而減輕腹部肥胖(abdominalobesity)的作用，因此D-阿洛酮糖可用作減肥食品(diet food)的有效成分。另外，廣泛用作糖替代品的糖醇在過量服用時(shí)具有引起諸如腹瀉等副作用的問題，但D-阿洛酮糖幾乎沒有副作用(T.松尾(Matsue7T.), Y.巴巴(Y. Baba), M.橋口 (M. Hashiguchi), K.竹下(K. Takeshita), K.伊珠莫里(K. Izumori),以及 H.鈴木(H. Suzuki). 2001.膳食 D-阿洛酮糖，即D-果糖的C-3差向異構(gòu)體,抑制小鼠體內(nèi)肝脂肪生成酶的活性(Dietary D-psicose,a C-3 epimer of D-fructose,suppresses the activity of hepatic lipogenic enzymesin rats).亞太臨床營(yíng)養(yǎng)學(xué)雜志(Asia Pac. J. Clin. Nutr.) 10 :233-237. ；T.松尾，以及K.伊珠莫里.2004. D-阿洛酮糖，一種不提供能量而提供用于臨床營(yíng)養(yǎng)學(xué)的其它有益作用的稀有糖(D-psicose, a rare sugar that provides no energy and additionallybeneficial effects for clinical nutrition).亞太臨床營(yíng)養(yǎng)學(xué)雜志 13 :S127)。由于這些原因，D-阿洛酮糖作為膳食甜味劑而逐漸在食品工業(yè)領(lǐng)域中引起注意，并且因此，越來(lái)越需要開發(fā)一種有效制備D-阿洛酮糖的方法。通過使用阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶制備D-阿洛酮糖的常規(guī)方法，著重于開發(fā)一種通過使用在重組大腸桿菌(E.coli)中大規(guī)模表達(dá)的重組酶或包括所述重組酶的宿主細(xì)胞而使D-果糖差向異構(gòu)化為D-阿洛酮糖的方法。然而，就食品安全性來(lái)說(shuō)，使用所述重組大腸桿菌進(jìn)行D-阿洛酮糖的生物技術(shù)制備并不適合用于制備作為食品材料的D-阿洛酮糖。為了制備適合用作食品材料的D-阿洛酮糖，需要開發(fā)一種使用在宿主細(xì)胞中表達(dá)的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶或使用包括其的宿主的大規(guī)模生產(chǎn)方法，所述宿主細(xì)胞為公認(rèn)安全(Generally RecognizedAs Safe ；GRAS)菌株以及能夠在工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)的菌株。當(dāng)物質(zhì)在經(jīng)通過科學(xué)訓(xùn)練及經(jīng)驗(yàn)而具有資格的專家通過科學(xué)程序在其預(yù)期用途的條件下評(píng)估其安全性時(shí)一般被確認(rèn)為安全，則授予GRAS。雖然GRAS是僅在美國(guó)實(shí)施的獨(dú)特系統(tǒng)，但其重要性以及必要性已在國(guó)際上以及在美國(guó)得到認(rèn)可。因此，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注GRAS的發(fā)展。
同時(shí)，對(duì)于D-阿洛酮糖的工業(yè)生產(chǎn)，需要開發(fā)一種由更廉價(jià)的底物(substrate)制備D-阿洛酮糖的方法。目前，由于阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的高底物特異性，因此制備D-阿洛酮糖只能使用昂貴的D-果糖作為底物。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明已對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)可用作食品材料的D-阿洛酮糖進(jìn)行了積極研究，并且發(fā)現(xiàn)由D-果糖或D-葡萄糖連續(xù)制備D-阿洛酮糖可通過使用固定化(immobilization)來(lái)對(duì)用于工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)D-阿洛酮糖的酶促活化(enzymatic activation)提供穩(wěn)定的環(huán)境，并使用D-葡萄糖異構(gòu)酶以及阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶來(lái)達(dá)成。本發(fā)明的一目的在于提供一種呈食品安全形式的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶，用于制備可用作食品材料的D-阿洛酮糖。本發(fā)明的另一目的在于提供一種通過使用呈固定的食品安全形式的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶以及D-葡萄糖異構(gòu)酶而由D-葡萄糖或D-果糖連續(xù)制備D-阿洛酮糖的方法。技術(shù)解決方案本發(fā)明提供一種通過使用來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌且在GRAS菌株中表達(dá)的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶而由D-果糖制備D-阿洛酮糖的方法。本發(fā)明的方法包括以下步驟在GRAS菌株中表達(dá)來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶；以及通過使用所表達(dá)的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶而由D-果糖制備D-阿洛酮糖。本發(fā)明的方法還可包括以下步驟自能夠表達(dá)來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的GRAS菌株的培養(yǎng)物(culture)分離阿洛酮糖_差向異構(gòu)酶；以及通過使用所分離的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶而由D-果糖制備D-阿洛酮糖。表達(dá)來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的GRAS菌株可為經(jīng)過包含編碼上述酶的基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化(transform)的菌株。根據(jù)本發(fā)明的用于制備D-阿洛酮糖的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶可呈包含于GRAS菌株的培養(yǎng)物中或從所述培養(yǎng)物分離的形式，上述GRAS菌株表達(dá)來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶。GRAS菌株可為經(jīng)過包含編碼阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的菌株。GRAS菌株可為棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.),優(yōu)選為谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum) KCCM 11046P。本發(fā)明的方法中使用的來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶優(yōu)選具有SEQID NO 1的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的制備D-阿洛酮糖的方法可還包括將阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶固定于載體上的步驟。適合于本發(fā)明的載體可包含海藻酸鹽(alginate)，優(yōu)選為海藻酸鈉，但不限于此。根據(jù)本發(fā)明的制備D-阿洛酮糖的方法可還包括用其上固定有阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的載體填充管柱，并向填充床管柱(packed-bed column)供應(yīng)D-果糖溶液的步驟。本發(fā)明還更提供一種由D-葡萄糖制備D-阿洛酮糖的方法，其包括將阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶以及D-葡萄糖異構(gòu)酶(isomerase)固定于載體上的步驟。適合于本發(fā)明的載體可包含海藻酸鹽，優(yōu)選為海藻酸鈉，但不限于此。在如上文所述的方法中，阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶可包含于能夠表達(dá)來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的GRAS菌株的培養(yǎng)物中或從所述培養(yǎng)物分離。GRAS菌株可為經(jīng)過包含編碼阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的菌株。此外，GRAS菌株可為棒狀桿菌屬，優(yōu)選為谷氨酸棒狀桿菌KCCM 11046P。本發(fā)明的方法中所用的來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶優(yōu)選具有SEQID NO 1的氨基酸序列。另外，本發(fā)明更提供一種由D-葡萄糖制備D-阿洛酮糖的方法，其包括以下步驟將阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶以及D-葡萄糖異構(gòu)酶固定于載體上；用其上固定有阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶以及D-葡萄糖異構(gòu)酶的所述載體填充管柱；以及向填充床管柱供應(yīng)D-葡萄糖溶液。其上固定有阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶以及D-葡萄糖異構(gòu)酶的載體可填充于同一管柱中，或分別填充于兩個(gè)各別管柱中。然而，優(yōu)選將載體填充于各別管柱中，且在這種情況下，兩 個(gè)各別管柱互相連接。本發(fā)明提供一種適用于由D-果糖或D-葡萄糖制備D-阿洛酮糖的谷氨酸棒狀桿菌 KCCM 11046P 菌株。如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“食品安全形式”的意思是其安全性足以用作食品材料。因此，如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“以食品安全形式表達(dá)”的意思是目標(biāo)基因在被認(rèn)為安全且盡管用作食品材料卻不會(huì)引起有害作用的菌株(例如GRAS菌株)中表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，用重組載體轉(zhuǎn)化GRAS菌株的方法可包含電穿孔，但不限于此，并且可使用本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何轉(zhuǎn)化方法來(lái)進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，包含編碼來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的基因的重組載體可包含阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶編碼基因，其為可操作地連接于在棒狀桿菌屬細(xì)菌中具有活性的啟動(dòng)子(promoter)。所述啟動(dòng)子可具有序列SEQ ID NO :2到SEQ IDNO 8中的一個(gè)，已證實(shí)上述序列表達(dá)目標(biāo)基因的有效性聞?dòng)诎魻顥U菌屬細(xì)菌中的tac啟動(dòng)子(韓國(guó)專利公開案第2006-0068505號(hào))。如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶”的意思是具有使D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化活性的D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶可具有SEQ ID NO : I的氨基酸序列或其功能性片段(functional fragment)。功能性片段的意思是在氨基酸序列SEQ ID NO :I中包含由一些氨基酸的取代、插入或缺失或其類似情況所產(chǎn)生的突變，但具有使D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化活性的片段。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，GRAS菌株可為棒狀桿菌屬菌株。棒狀桿菌屬菌株是一種制備在動(dòng)物飼料、藥物以及食品領(lǐng)域等中具有各種用途的化學(xué)物質(zhì)的工業(yè)用微生物，所述化學(xué)物質(zhì)包含L-賴氨酸、L-蘇氨酸以及各種核酸。所述棒狀桿菌屬菌株是GRAS (公認(rèn)安全)菌株，并且具有容易進(jìn)行基因操作以及大規(guī)模培養(yǎng)的性質(zhì)。此外，棒狀桿菌屬菌株在各種處理?xiàng)l件下具有高穩(wěn)定性，與其它細(xì)菌相比具有相對(duì)硬質(zhì)的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，從而具有甚至在由高糖濃度引起的高滲透壓等下也存在呈穩(wěn)定狀態(tài)的細(xì)胞團(tuán)(cell mass)的生物性質(zhì)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，棒狀桿菌屬菌株可為谷氨酸棒狀桿菌。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，表達(dá)來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的GRAS菌株可為重組菌株谷氨酸棒狀桿菌KCCM 11046P。阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶可容易地通過所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常已知的突變誘發(fā)(mutagenesis)(諸如定向進(jìn)化(directed evolution)以及點(diǎn)突變(site-directedmutagenesis)等)來(lái)進(jìn)行修飾。因此,應(yīng)解釋為，與由SEQ ID NO :I表示的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的氨基酸序列具有一定程度的序列同源性(sequence homology)(諸如70%或高于70 %、優(yōu)選80 %或高于80 %、更優(yōu)選90 %或高于90 %的序列同源性)并且在GRAS菌株中以活性形式(active form)表達(dá)的重組酶，以及包括所述重組酶的宿主細(xì)胞都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。表達(dá)來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的GRAS菌株的培養(yǎng)物可通過在 培養(yǎng)基中且在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細(xì)菌來(lái)獲得，所述培養(yǎng)條件容易由本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)菌株性質(zhì)加以選擇。培養(yǎng)方法可包含所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何培養(yǎng)方法，諸如分批培養(yǎng)(batch culture)、連續(xù)培養(yǎng)(continuous culture)以及分批補(bǔ)料式培養(yǎng)(fed-batch culture),但不限于此。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例制備D-阿洛酮糖的方法可包括從表達(dá)來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的GRAS菌株的培養(yǎng)物分離阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的步驟。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，通過離心、過濾等從表達(dá)來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的菌株的培養(yǎng)物分離的細(xì)胞；或通過使分離的細(xì)胞均質(zhì)化(homogenize)并離心所獲得的上清液；或通過分級(jí)分離(fractionation)、層析(chromatography)等從所述上清液分離并純化的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶可用作用于使D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的酶。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶可呈在培養(yǎng)物中的細(xì)胞團(tuán)的形式或從所述細(xì)胞團(tuán)分離的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的形式。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，制備D-阿洛酮糖的步驟可還包括將阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶或表達(dá)阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的細(xì)胞團(tuán)固定于載體上的步驟。因?yàn)樵趯⒚富蚣?xì)胞團(tuán)固定于載體上的情況下，可提供用于長(zhǎng)時(shí)間維持活性的環(huán)境，所以所述固定化已用于使用酶或微生物的工業(yè)生產(chǎn)方法中?？捎糜诠潭ɑ妮d體可包含海藻酸鹽，諸如海藻酸鈉，但不限于此。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，固定化可通過使用海藻酸鈉作為載體來(lái)進(jìn)行。海藻酸鈉是一種天然膠態(tài)多糖，其在藻類的細(xì)胞壁中大量存在，由-D-甘露糖醛酸(-D-mannuronic acid)以及-L-古洛糖醒酸(_L-guluronic acid)組成,并且通過一定含量的隨機(jī)_1，4連接而形成，因此，對(duì)于將細(xì)胞團(tuán)或酶穩(wěn)定地固定于其上是有利的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，固定化可通過使用I. 5%到4. 0%海藻酸鈉作為載體來(lái)進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，固定化可通過使用2%海藻酸鈉作為載體來(lái)進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，通過使用海藻酸鈉作為用于固定化的載體，所述固定化可通過將I到2倍體積的海藻酸鈉水溶液添加到含有酶或細(xì)胞團(tuán)的樣品中，使用注射泵以及真空泵將所得混合物滴入0. I摩爾濃度鈣離子溶液中，以在珠粒中形成酶或細(xì)胞團(tuán)-海藻酸鹽復(fù)合物來(lái)進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，將阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶固定于載體上的步驟可還包括用固定的酶填充管柱，并向所述填充管柱供應(yīng)D-果糖溶液的步驟。待用其上固定有酶或細(xì)胞團(tuán)的載體填充的管柱、以及用所述載體填充所述管柱的方法可適當(dāng)?shù)厍胰菀子杀景l(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)所用的酶或細(xì)胞團(tuán)、或用于固定化的載體進(jìn)行選擇。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，有可能通過用固定酶填充管柱來(lái)制備填充床管柱。酶促反應(yīng)(即，D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖)可通過向填充床管柱供應(yīng)作為其底物的D-果糖溶液來(lái)進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，當(dāng)向填充有包含阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的細(xì)胞團(tuán)的填充床管柱供應(yīng)恒定濃度的D-果糖溶液時(shí)，差向異構(gòu)化反應(yīng)通過固定的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行，從而導(dǎo)致D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖。通過使用分離管柱進(jìn)行分離并純化，然后可以純D-阿洛酮 糖的形式獲得轉(zhuǎn)化的D-阿洛酮糖。如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“固定化反應(yīng)器”的意思是其中通過固定于載體上的細(xì)胞團(tuán)或酶進(jìn)行制備D-阿洛酮糖的反應(yīng)的反應(yīng)器，或填充有固定于載體上的細(xì)胞團(tuán)或酶的管柱。即，固定化的意思是將提供生物活性的物質(zhì)，在這種情況下是將阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶或D-葡萄糖差向異構(gòu)酶或包含其的細(xì)胞團(tuán)固定于載體上。如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“操作穩(wěn)定性”的意思是可操作用于連續(xù)制備目標(biāo)產(chǎn)物(諸如D-阿洛酮糖)的生物反應(yīng)器，同時(shí)與其初始活性相比維持合適的生產(chǎn)力水平，且一般由操作期(operation period)表不。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，在50°C下向填充有其上固定有表達(dá)阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的細(xì)胞的載體的管柱以O(shè). I分鐘/毫升的流入速率供應(yīng)300克/升D-果糖，這使得有可能確保25天或25天以上的操作穩(wěn)定性。本發(fā)明更提供一種由D-葡萄糖制備D-阿洛酮糖的方法，其包括將阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶以及D-葡萄糖異構(gòu)酶固定于載體上的步驟。如上文所述，因?yàn)橛米靼⒙逋?差向異構(gòu)酶的底物的D-果糖較昂貴，所以需要由廉價(jià)的底物(諸如D-葡萄糖)制備D-阿洛酮糖以用于D-阿洛酮糖的工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。D-葡萄糖異構(gòu)酶是使D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-果糖的酶，且因此，可通過使D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-果糖來(lái)提供阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的底物。因此，有可能通過使用這兩種酶由D-葡萄糖制備D-阿洛酮糖。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶可為表達(dá)來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的GRAS菌株的培養(yǎng)物，或從所述培養(yǎng)物分離的細(xì)胞團(tuán)或阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，D-葡萄糖異構(gòu)酶可為表達(dá)D-葡萄糖異構(gòu)酶的GRAS菌株的培養(yǎng)物，或從所述培養(yǎng)物分離的細(xì)胞團(tuán)或D-葡萄糖異構(gòu)酶。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶可具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，D-葡萄糖異構(gòu)酶可購(gòu)得。舉例來(lái)說(shuō)，可使用購(gòu)自諾維信公司(Novozymes A/S)(丹麥鮑斯韋(Bagsvaerd, Denmark))的D-葡萄糖異構(gòu)酶或固定D-葡萄糖異構(gòu)酶。D-葡萄糖異構(gòu)酶是一種使D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-果糖的代表性酶，并且當(dāng)前用于制備果寡糖(fructo-oligosaccharides)。在當(dāng)前用于工業(yè)生產(chǎn)的酶中，D-葡萄糖異構(gòu)酶是活性以及機(jī)制已得到清楚鑒別的酶之一。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，GRAS菌株可為經(jīng)過包含編碼阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的基因以及編碼D-葡萄糖異構(gòu)酶的基因的重組載體轉(zhuǎn)化的菌株，或經(jīng)過包含上述基因每一個(gè)的重組載體共轉(zhuǎn)化(co-transform)的菌株。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，GRAS菌株可為棒狀桿菌屬細(xì)菌。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，表達(dá)來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的GRAS菌株可為重組菌株谷氨酸棒狀桿菌KCCM 11046P。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，用于固定化的載體可為海藻酸鈉。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，固定化可通過使用I. 5%到4. 0%海藻酸鈉作為載體來(lái)進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，固定化可通過使用2%海藻酸鈉作為載體來(lái)進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，通過使用海藻酸鈉作為用于固定化的載體，所述固定化可通過將I到2倍體積的海藻酸鈉水溶液添加到含有酶或細(xì)胞團(tuán)的樣品中，使用注射泵以及真空泵將所得混合物滴入0. I摩爾濃度的鈣離子溶液中而以在珠粒中形成酶或細(xì)胞團(tuán)-海藻酸鹽復(fù)合物來(lái)進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，編碼阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的基因以及編碼D-葡萄糖異構(gòu)酶的基因可在相同的GRAS菌株中表達(dá)或分別在不同的兩種GRAS菌株中表達(dá)，并且固定化步驟可通過將所培養(yǎng)GRAS菌株的細(xì)胞或從所述細(xì)胞分離的兩種酶的混合物固定于載體上來(lái)進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，可分別將表達(dá)阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的GRAS菌株的培養(yǎng)物或從培養(yǎng)物分離的細(xì)胞團(tuán)塊或阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶，以及D-葡萄糖異構(gòu)酶固定于載體上。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法可還包括用其上固定有細(xì)胞或酶的載體填充管柱的步驟。根據(jù)本發(fā)明由D-葡萄糖制備D-阿洛酮糖的方法可還包括用固定的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶以及D-葡萄糖異構(gòu)酶填充管柱，并向所述填充的管柱供應(yīng)D-葡萄糖溶液的步驟。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，填充床管柱可通過用固定酶填充管柱來(lái)制備。酶促反應(yīng)(即D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖)可通過向填充床管柱供應(yīng)作為其底物的D-葡萄糖溶液來(lái)進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，固定的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶以及D-葡萄糖異構(gòu)酶可分別填充于各別管柱中。待用其上固定有酶或細(xì)胞的載體填充的管柱以及用所述載體填充所述管柱的方法可適當(dāng)?shù)厍胰菀椎赜杀景l(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)所用的酶或細(xì)胞團(tuán)或用于固定化的載體進(jìn)行選擇。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，有可能分別用固定阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的載體以及固定D-葡萄糖異構(gòu)酶的載體填充兩個(gè)各別管柱，彼此連通而連接這兩個(gè)管柱，以將D-果糖作為異構(gòu)化產(chǎn)物而從填充有D-葡萄糖異構(gòu)酶的管柱轉(zhuǎn)移到填充有阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的管柱，并誘導(dǎo)D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。當(dāng)向由所述兩個(gè)連通的管柱組成的固定化反應(yīng)器供應(yīng)作為底物的D-葡萄糖溶液時(shí)，D-葡萄糖在填充有D-葡萄糖異構(gòu)酶的管柱中轉(zhuǎn)化為D-果糖，并且轉(zhuǎn)移到填充有阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的管柱的D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖。因此，有可能由D-葡萄糖獲得D-阿洛酮糖而作為最終產(chǎn)物。有利作用根據(jù)本發(fā)明制備D-阿洛酮糖的方法可由D-葡萄糖或D-果糖大規(guī)模且連續(xù)地制備可用作食品材料的呈食品安全形式的D-阿洛酮糖。



圖I示意性說(shuō)明構(gòu)筑包含編碼來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的基因的重組表達(dá)載體pCJ-1-ATPE的方法。圖2說(shuō)明對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的方法，通過HPLC測(cè)量來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的活性的結(jié)果，其中圖2a顯示各糖的參考標(biāo)準(zhǔn)(referencestandard),且圖2b顯示通過反應(yīng)進(jìn)行的轉(zhuǎn)化。圖3說(shuō)明對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的方法，通過使用重組菌株在100克/升(3a)、300克/升(3b)或500克/升(3c)的D-果糖與40°C、45°C或50°C反應(yīng)溫度的組合條件下得到的D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化％。圖4說(shuō)明對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的方法，取決于作為底物的D-果糖的流入速率的D-阿洛酮糖的生產(chǎn)力。圖5說(shuō)明對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的方法，在50°C的反應(yīng)溫度下固定化反應(yīng)器的操作穩(wěn)定性。相對(duì)活性)的意思是相對(duì)于操作起始時(shí)的活性的活性。圖6說(shuō)明對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的方法，通過使用表達(dá)阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的固定重組菌株以及固定D-葡萄糖異構(gòu)酶在100克/升(6a)、300克/升(6b)或500克/升(6c) D-葡萄糖與40°C、45°C或50°C反應(yīng)溫度的組合條件下得到的D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化％。圖7說(shuō)明對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的方法，取決于D-葡萄糖的流入速率的D-阿洛酮糖的生產(chǎn)力。
具體實(shí)施例方式下文通過以下特定實(shí)例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。然而，這些實(shí)例是用于說(shuō)明并且本發(fā)明的范圍不限于所述實(shí)例。阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶以及D-葡萄糖異構(gòu)酶活性的測(cè)量阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶以及D-葡萄糖異構(gòu)酶的活性是通過分別使用D-果糖以及D-葡萄糖作為底物進(jìn)行測(cè)量。將酶或含有所述酶的樣品添加到含有100克/升底物的50毫摩爾濃度的PIPES(哌嗪-N，N'-雙(2-乙烷磺酸))緩沖液(pH 8.0)中，隨后在50°C下反應(yīng)I小時(shí)，并接著通過在100°C下加熱反應(yīng)5分鐘來(lái)終止反應(yīng)。通過裝備有折射率(Refractive Index ；RI)檢測(cè)器的HPLC測(cè)量D-果糖、D-葡萄糖以及D-阿洛酮糖的濃度。通過將樣品注射到設(shè)定為80°C的Supelcogel Pb (商品名)管柱中，并接著使蒸懼水作為移動(dòng)相以O(shè). 5毫升/分鐘的速率通過所述管柱來(lái)進(jìn)行HPLC分析。在約32分鐘的滯留時(shí)間分離出D-阿洛酮糖，且基于D-阿洛酮糖參考標(biāo)準(zhǔn)定量的量來(lái)計(jì)算其轉(zhuǎn)化％以及生產(chǎn)力。對(duì)于酶活性的比較分析，將酶的一個(gè)單位定義為在PH 8.0以及50°C下每分鐘產(chǎn)生I摩爾的D-阿洛酮糖的酶的量。實(shí)例I :表達(dá)阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的重組菌株(I)重組菌株的制備通過使用根癌農(nóng)桿菌ATCC 33970的基因組DNA作為模板并分別引入了 PstI以及XbaI限制酶識(shí)別位點(diǎn)的SEQ ID NO 9以及SEQ ID NO 10的寡核苷酸作為引物來(lái)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction ;PCR),以擴(kuò)增編碼阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的基因。PCR條件如下在95°C下變性30秒后，26個(gè)循環(huán)由在95°C下30秒、在55°C下30秒以及在68°C下I分鐘組成，接著在68°C下延伸10分鐘。對(duì)于由擴(kuò)增基因編碼的阿洛酮糖-差向異 構(gòu)酶的大規(guī)模表達(dá)，用限制酶PstI以及XbaI消化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，并插入來(lái)源于棒狀桿菌屬細(xì)菌(在2004年11月6日以保藏編號(hào)KCCM-10611保藏于韓國(guó)菌種保藏中心(KoreanCulture Center of Microorganisms ;KCCM),其為國(guó)際保藏機(jī)構(gòu))的穿梭載體(shuttlevector) pCJ-1中，以構(gòu)筑重組表達(dá)載體pCJ_l_ATPE。圖I示意性顯示制備包含編碼來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的基因的重組表達(dá)載體pCJ-1-ATPE的方法。通過使用電穿孔進(jìn)行轉(zhuǎn)化將重組表達(dá)載體pCJ-1-ATPE引入谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032中，以制備表達(dá)編碼來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的基因的重組菌株。所述重組菌株被定名為谷氨酸棒狀桿菌ATPE,且根據(jù)布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)而在2009年10月26日以保藏編號(hào)KCCM11046P保藏于韓國(guó)菌種保藏中心(KCCM，韓國(guó)首爾西大門區(qū)弘濟(jì) I 洞(Hongje-l-dong, Seodaemum-gu, Seoul, Korea))。(2)阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的表達(dá)在0D600 = 0. I的初始濃度下分別對(duì)包含10微克/毫升卡那霉素(kanamycin)的MB培養(yǎng)基(巴克托-胰蛋白胨(Bacto-tryptonUO克/升、巴克托-酵母提取物(Bacto-yeast extract) 5克/升、NaCl 5克/升、大豆胨(Soytone) 5克/升)接種由上述(I)中所獲得的重組菌株，隨后在30°C下培育24小時(shí)，以誘導(dǎo)重組阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的表達(dá)。在0D600 = 0.6下對(duì)含有3升改良培養(yǎng)基(D-葡萄糖80克/升、大豆胨20克/升、(NH4)2SO4 10克/升、KH2PO4 I. 2克/升、MgSO4 I. 4克/升)并包含10微克/毫升卡那霉素的5升搖瓶發(fā)酵罐接種以由上述獲得的培養(yǎng)物，隨后在30°C下培育20小時(shí)。為了測(cè)量所表達(dá)的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的活性，在8000 X g下對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行離心10分鐘以收集細(xì)胞。接著將所收集的細(xì)胞再懸浮于50毫摩爾濃度EPPS的緩沖液(pH 8.0)中(西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich))并且對(duì)所得懸浮液進(jìn)行超聲波處理，導(dǎo)致細(xì)胞裂解(lysis)。對(duì)細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn)行離心以獲得含有阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的上清液，并且通過使用所述上清液作為酶進(jìn)行D-果糖的差向異構(gòu)化反應(yīng)。在差向異構(gòu)化反應(yīng)中使用如上文所述測(cè)量阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的活性。圖2b示出差向異構(gòu)化反應(yīng)的HPLC分析結(jié)果。實(shí)例2 :重組菌株的固定化以及D-阿洛酮糖的制備(I)重組菌株的固定化對(duì)于D-阿洛酮糖的大規(guī)模生產(chǎn)，在這一實(shí)例中將表達(dá)來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶且在以上實(shí)例I中制備的谷氨酸棒狀桿菌ATPE(KCCM 11046P)固定于載體上。對(duì)于重組菌株的固定化，首先在0D600 = 0.6的初始濃度下對(duì)實(shí)例I中所用的用于棒狀桿菌屬的改良培養(yǎng)基接種重組菌株，隨后在30°C下培育20小時(shí)。培育完成后，對(duì)所得培養(yǎng)物進(jìn)行離心以回收細(xì)胞，將其于50毫摩爾濃度的EPPS緩沖液(pH 8.0)中再懸浮至20%。將再懸浮的重組菌株細(xì)胞添加到2% (v/v)海藻酸鈉水溶液中。通過使用注射泵以及真空泵將所得混合物滴入100毫摩爾濃度的CaCl2溶液中，以形成細(xì)胞-海藻酸鹽復(fù)合物，其中細(xì)胞被截留于海藻酸鈉珠粒中。(2)通過使用固定重組菌株制備D-阿洛酮糖用上述(I)中的固定于海藻酸鈉上的重組菌株來(lái)填充XK16填充床管柱(16毫米X 20毫米,安瑪西亞公司(Amersham pharmacia)),隨后測(cè)量D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化包％ (% conversion pack)。為了確定固定化反應(yīng)器的最佳反應(yīng)溫度以及D-果糖的底物濃度，在40°C、45°C以及50°C的反應(yīng)溫度與100克/升、300克/升以及500克/升D-果糖濃度的組合條件下進(jìn)行D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。根據(jù)圖3a到圖3c，發(fā)現(xiàn)在50°C的溫度以及100克/升D-果糖濃度下達(dá)成最佳轉(zhuǎn)化，并且300克/升以及500克/升D-果糖濃度也產(chǎn)生高轉(zhuǎn)化率。此外，不同于其它D-葡萄糖轉(zhuǎn)化反應(yīng)，D-阿洛酮 糖的差向異構(gòu)化反應(yīng)對(duì)溫度顯示出低依賴性(low dependency)。(2-1)取決于D-果糖的流入速率的生產(chǎn)力用如上文所述的固定重組菌株來(lái)填充XK16填充床管柱，隨后測(cè)量取決于D-果糖的流入速率的D-阿洛酮糖的生產(chǎn)力。此時(shí)，基于上述(2)的結(jié)果，分別將D-果糖的濃度以及反應(yīng)溫度設(shè)定為300克/升以及50°C。通過將D-果糖(底物)的流入速率調(diào)整為O. 4、1、2、4以及8小時(shí)―1的空間速度(I/小時(shí))來(lái)測(cè)量生產(chǎn)力。結(jié)果展示于下表I以及圖4中。表I[表 I][表]取決于D-果糖的流入速率的生產(chǎn)力以及轉(zhuǎn)化％
I 流入速率 ^D-果糖^ D-阿洛酮糖生產(chǎn)力 ^轉(zhuǎn)化率^I
(毫升/分鐘) (克/井) (克/升) (克/升/小時(shí)) (％)
3^281.388 — 3.693331.30
2289.215 — 3.309201.13
I^291.268 — 7.579 — 232.54
0.5............................................. 284.639—— 12.055184.06
0.25286.463 — 20.579 — 156.70
1..........................................................................................0.1260.096 38.041I!12.76 I(2-2)操作穩(wěn)定性在50°C下分別通過使用填充于XK16填充床管柱中的固定重組菌株進(jìn)行操作直到其比活性(specific activity)變成50%，以測(cè)量填充入管柱中的固定重組菌株的操作穩(wěn)定性。此時(shí)，D-果糖的底物濃度是300克/升且其流入速率是O. I分鐘/毫升(空間速度是O. 4小時(shí)―1)。發(fā)現(xiàn)在這些反應(yīng)條件下可維持25天或長(zhǎng)于25天的操作穩(wěn)定性。圖5顯示在50°C的反應(yīng)溫度下固定重組菌株的操作穩(wěn)定性。實(shí)例3 :通過使用固定的重組菌株/酶而由D-葡萄糖制備D-阿洛酮糖
(I)取決于反應(yīng)溫度以及D-葡萄糖濃度的生產(chǎn)力分別用以上實(shí)例2中固定于海藻酸鈉上的重組菌株以及10克固定的D-葡萄糖異構(gòu)酶(丹麥諾維信公司)來(lái)填充XK16填充床管柱(16毫米X 20毫米，安瑪西亞公司)，隨后測(cè)量D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化％。為了確定用于兩種混合酶的最佳反應(yīng)條件，在40°C、45°C或50°C的反應(yīng)溫度與100克/升、300克/升或500克/升的D-葡萄糖濃度的組合條件下進(jìn)行D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。圖6顯示D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化％，其取決于反應(yīng)溫度以及底物濃度的變化。根據(jù)圖6a到圖6c，不同于D-阿洛酮糖的差向異構(gòu)化反應(yīng)，D-葡萄糖的異構(gòu)化反應(yīng)是溫度依賴性反應(yīng)(temperature-dependent reaction)。S卩，反應(yīng)溫度越高,D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化速率越快。發(fā)現(xiàn)這最終對(duì)D-阿洛酮糖的生產(chǎn)力具有影響。在50°C的溫度下達(dá)成D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-果糖的最佳轉(zhuǎn)化率，并且當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥捷^高時(shí)，反應(yīng)速率不存在顯著差異。這些結(jié)果證明有可能在較高底物濃度條件下操作固定化反應(yīng)器，并且增加從D-葡萄糖到D-阿洛酮糖的生產(chǎn)力。

(2)取決于D-葡萄糖的流入速率的生產(chǎn)力分別用包含阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的固定重組菌株以及固定的D-葡萄糖異構(gòu)酶填充兩個(gè)填充床管柱，并且測(cè)量取決于D-葡萄糖的流入速率的D-阿洛酮糖的生產(chǎn)力?；谝陨蠈?shí)例的結(jié)果，分別將D-葡萄糖的濃度以及反應(yīng)溫度設(shè)定為300克/升以及50°C。通過將D-果糖(底物)的流入速率調(diào)整為0.4、1、2、4以及8小時(shí)―1空間速度(I/小時(shí))來(lái)測(cè)量生產(chǎn)力。結(jié)果展示于下表2以及圖7中。表2[表2][表]取決于D-葡萄糖的流入速率的生產(chǎn)力以及轉(zhuǎn)化％
I 流入速 D-葡萄糖^D-果糖^ 生產(chǎn)力 ^轉(zhuǎn)化率 II (毫升/分鐘) (克/升) (克/升) (克/升/小時(shí)) (％) II4281.465 31.1363749,96 I
3278.849 ~40.042360 — 12.56
2^67.061 50.196301 — 15.82
I138.615 78.854237 — 24.84
0.5........................................................................................^Τθ7.168 ^113.081 — 17035.31 |
1............................................0:1172.826 155.85047———47:42■■■■■■——■I

權(quán)利要求
1.一種由D-果糖制備D-阿洛酮糖的方法，其通過使用來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌并且在GRAS (公認(rèn)安全)菌株中表達(dá)的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶，其包括下述步驟 在所述GRAS菌株中表達(dá)來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的所述阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶；以及 通過使用所表達(dá)的所述阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶而由D-果糖制備D-阿洛酮糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述由D-果糖制備D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，用于制備D-阿洛酮糖的所述阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶是包含于所述GRAS菌株的培養(yǎng)物中或是從所述培養(yǎng)物分離。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述由D-果糖制備D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述GRAS菌株是棒狀桿菌屬。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述由D-果糖制備D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述GRAS菌株是谷氨酸棒狀桿菌KCCM 11046P。
5.根據(jù)權(quán)利要求I到4中任一權(quán)利要求所述由D-果糖制備D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的所述阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求I到4中任一權(quán)利要求所述由D-果糖制備D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，制備D-阿洛酮糖的所述步驟包括將所述阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶固定于載體上的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述由D-果糖制備D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述載體是海藻酸鈉。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述由D-果糖制備D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述方法還包括用其上固定有所述阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的所述載體來(lái)填充管柱，并且向所填充的所述管柱供應(yīng)D-果糖溶液的步驟。
9.一種由D-葡萄糖制備D-阿洛酮糖的方法，其包括將阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶以及D-葡萄糖異構(gòu)酶固定于載體上的步驟。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述由D-葡萄糖制備D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶是包含于表達(dá)來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的GRAS菌株的培養(yǎng)物中或是從所述培養(yǎng)物分離。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述由D-葡萄糖制備D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述GRAS菌株是經(jīng)過包含編碼阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶的基因的重組載體轉(zhuǎn)化的菌株。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述由D-葡萄糖制備D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述GRAS菌株是棒狀桿菌屬。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述由D-葡萄糖制備D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述GRAS菌株是谷氨酸棒狀桿菌KCCM 11046P。
14.根據(jù)權(quán)利要求10到13中任一權(quán)利要求所述由D-葡萄糖制備D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的所述阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求9所述由D-葡萄糖制備D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述載體是海藻酸鈉。
16.根據(jù)權(quán)利要求9到13中任一權(quán)利要求所述由D-葡萄糖制備D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述方法還包括用其上固定有所述阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶以及所述D-葡萄糖異構(gòu)酶的所述載體來(lái)填充管柱，并且向經(jīng)過所述載體填充的所述管柱供應(yīng)D-果糖溶液的步驟。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述由D-葡萄糖制備D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，將其上固定有所述阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶以及所述D-葡萄糖異構(gòu)酶的所述載體各自分別填充于各別管柱中，并且使所述兩個(gè)管柱彼此連通連接。
18.一種谷氨酸棒狀桿菌KCCM 11046P菌株，其適用于由D-果糖或D-葡萄糖制備D-阿洛酮糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過使用來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌且以食品安全形式表達(dá)的阿洛酮糖-差向異構(gòu)酶而連續(xù)地由D-果糖或D-葡萄糖制備D-阿洛酮糖的方法。
文檔編號(hào)C12R1/15GK102869783SQ201080044027
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2010年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日
發(fā)明者洪暎鎬, 金鎮(zhèn)夏, 金成俌, 金政勛, 李英美, 樸承源 申請(qǐng)人:Cj第一制糖株式會(huì)社