一種利用醛縮酶全細胞合成d-阿洛酮糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是涉及利用醛縮酶全細胞合成D-阿洛酮糖的方法。即利用基因工程技術(shù)和微生物學方法獲得谷氨酸棒桿菌重組菌株，并利用該重組菌株高效合成D-阿洛酮糖。
【背景技術(shù)】
[0002]稀少糖(Rare Sugar)是自然界中存在但含量極少的一類單糖及其衍生物(2002年國際稀少糖學會ISRS定義)。其具有熱量低、穩(wěn)定性高、無致齲齒性、耐受性高等優(yōu)點，在膳食、保健、醫(yī)藥等領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注，它們可以作為添加劑改善食品的理化性質(zhì)，提高食品的生理功能和保健功能。近年來，科學家致力于研究的稀少糖主要有D-阿洛糖(D-Allose)、D-阿洛酮糖(D-psicose)、D-塔格糖(D-Tagatose)等。其中D-阿洛酮糖(果糖C-3差向異構(gòu)體)是一種重要的稀少糖。研究人員分別證實了 D-阿洛酮糖是零或低熱量、食用安全的填充型甜味劑，它們對胰島素沒有依賴性，可改善糖尿病患者的飲食，適合于糖尿病患者食用，是低熱量功能性的理想鹿糖替代品(Matsuo T, Suzuki H, Hashiguchi Μ,et al.D-psicose is a rare sugar that provides no energy to growing rats.J.Nutr Sci Vitaminol (Tokyo).2002.48(1): 77-80.)。美國食品與藥品管理局(FDA)在2012年就將D-阿洛酮糖列為安全食品(GRAS)添加劑。
[0003]國際市場對D-阿洛酮糖的應(yīng)用越來越關(guān)注，市場需求量不斷增大。然而，D-阿洛酮糖在自然界中含量低、且難以化學合成，傳統(tǒng)的化學合成法已不能滿足大規(guī)模的生產(chǎn)需要。因此，從來源于自然界中的豐富原料通過生物轉(zhuǎn)化的方法合成稀少糖，實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)是D-阿洛酮糖廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)。日本的研究學者Izumori于2002年建立了稀少糖的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)策略，即Izumoring方法,該方法中利用酮糖差向異構(gòu)酶(Ketose epimerase)、醒糖異構(gòu)酶(Aldose isomerases)和多兀醇脫氧酶(Poly dehydrogenase)進行所有單糖及糖醇之間的相互轉(zhuǎn)化(Izumori K.B1product1n strategies for rare hexoses.Naturwissenschaften, 2002, 89:120-124.)。目前，生物轉(zhuǎn)化法合成D-阿洛酮糖主要是通過酮糖3位差向異構(gòu)酶完成，將D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖。該酮糖3位差向異構(gòu)酶酶系根據(jù)其作用最適底物分為:D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶(D-tagatose 3-epimerase,DTEase)和D-阿洛麗糖3_差向異構(gòu)酶(D-psicose 3-epimerase, DPEase),它們的催化效率為20-32%。此外，來源于根癌農(nóng)桿菌(A ?ω^/acieas)的DPE (D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶)和菊苣假單胞菌(A cichorii)的DTE (D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶)也可以將 D-果糖轉(zhuǎn)化為 D-阿洛酮糖(Kim HJ, Hyun EK, Kim YS, Lee YJ, Oh DK (2006a)Characterizat1n of an Agrobacterium tumefaciens D-psicose 3-epimerase thatconverts D-fructose to D-psicose.Appl Environ Microb1l 72:981 - 985)。 近年來研究發(fā)現(xiàn)醒縮酶同樣可用于稀少糖的生物合成(Brovetto M, Gamenara D, SaenzMendez P, Seoane GA.C-C bond-forming lyases in organic synthesis.ChemicalReviews 2011.111:4346-4403)。例如L-鼠李樹膠糖-1-磷酸醛縮酶可以以磷酸二羥丙酮和D-甘油醛為底物合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖(Li Z, Cai L，Qi Q，Wang P.Enzymatic synthesis of D -sorbose and D -psicose with aldolase FucA: Effectof acceptor configurat1n on enzyme stereoselectivity.B10rg.Med.Chem.Lett.2011).21.7081 - 7084)。上述D-阿洛酮糖的生物合成方法中存在一個共性問題，即反應(yīng)終止時，反應(yīng)液含有兩種及兩種以上的單糖，導致分離成本提高。所以開發(fā)一種能夠合成單一產(chǎn)物D-阿洛酮糖的生物合成方法很有意義。
[0004]目前，與D-阿洛酮糖合成相關(guān)的國外專利主要通過3-差向異構(gòu)酶及其固定化體外催化果糖來合成(Deok-Kun Oh, Hye-Jung Kim, Yong-Joo Lee, Sang-HoonSong, Seung-Won Park, Jung-Hoon Kim, Seong-Bo Kim.D-psicose product1n method byD-psicose epimerase.US 8030035 B2,2011.10.04; Yang Hee Kim, Jin Ha Kim, YoungMi Lee, Young Ho Hong, Min Hae Kim, Seong Bo Kim, Seung Won Park, Seung Hyun Oh,Deok Kun Oh, Jin Geun Cho1.D-psicose 3-epimerase mutant with improved thermalstability, and continuous product1n of D-psicose using same.US 2014/0199732Al,2014.07.17; Young Plo Hong, Jin Ha Kim, Sung Bo Kim, Jung Hoon Kim, YoungMi Lee, Seung Won Park.1mmobilizat1n of psicose—epimerase and a method ofproducing D-psicose using the same.US 8735106 B2.2014.05.27)。由于 3-差向異構(gòu)酶催化果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率僅有20-32%，故反應(yīng)終止時，體系中同時含有果糖和D-阿洛酮糖，導致分離操作較復雜，成本較高。來源于大腸桿菌的L-墨角藻糖-1-磷酸醛縮酶可以催化磷酸二羥丙酮和D-甘油醛體外合成單一產(chǎn)物D-阿洛酮糖，但是由于磷酸二羥丙酮價格較貴，且不穩(wěn)定，所以很難進行大規(guī)模體外合成。然而磷酸二氫丙酮還可以以葡萄糖，果糖，蔗糖為底物，通過胞內(nèi)的糖酵解途徑實現(xiàn)體內(nèi)合成，所以通過構(gòu)建重組菌株以葡萄糖和D-甘油醛為底物全細胞轉(zhuǎn)化合成D-阿洛酮糖具有很大的應(yīng)用潛力。目前國內(nèi)外相關(guān)專利尚未報道。因此，通過基因工程和代謝工程的方法和思路構(gòu)建微生物重組菌株，再以葡萄糖和D-甘油醛為底物發(fā)酵生產(chǎn)D-阿洛酮糖是本發(fā)明的一個中心思路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一株用于發(fā)酵生產(chǎn)D-阿洛酮糖的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)的重組菌株。
[0006]本發(fā)明所提供的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)重組菌株的名稱為SY12，該菌株已于2014年10月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.9838。
[0007]本發(fā)明另一目的在于提供一種構(gòu)建谷氨酸棒桿菌(Xbryrwbacteriumglutamicum)重組菌株SY12的方法。
[0008]構(gòu)建權(quán)利要求1所述谷氨酸棒桿菌iQjryiwlmcterium glutamicum)重組菌株SY12 CGMCC N0.9838的方法，包括以下步驟:
向野生型谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中引入來源于大腸桿菌的L-墨角藻糖-1-磷酸醛縮酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因，得到攜帶L-墨角藻糖-1-磷酸醛縮酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因(即具有醛縮途徑)的重組谷氨酸棒桿菌，命名為SY12。具體的包括以下兩個步驟: 1.1構(gòu)建L-墨角藻糖-1-磷酸醛縮酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的載體pXRTY，其物理圖譜如圖2所示，具體方法為:PCR擴增來源于大腸桿菌MG1655的L-墨角藻糖-1-磷酸醛縮酶(FucA)基因(648bp，序列表中序列I)和果糖_1_磷酸化酶(YqaB)基因(567bp，序列表中序列2)、來源于pXMJ19的tac啟動子(307bp，序列表中序列3，作用是在基因YqaB前再添加一個啟動子)，再以這三個基因為模板PCR擴增得到由這三個基因組成的融合基因FucA-tac-YqaB (1548bp，序列表中序列4)，然后將融合基因FucA-tac-YqaB連接入載體PXMJ19中，得到攜帶有L-墨角藻糖-1-磷酸醛縮酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的載體，命名為PXFTY，其核苷酸序列如序列表中序列6所示；
1.2向野生型谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中導入攜帶L-墨角藻糖-1-磷酸