D-阿洛糖的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及由來自屬于鏈霉菌屬（Streptomyces)的微生物的序列號1或序列號2 所記載的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的新型用途，即將D-阿洛酮糖異構(gòu)化為D-阿洛糖的酶 的用途。
[0002] 本發(fā)明明確了屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)的微生物生產(chǎn)的上述酶所具有的催 化糖異構(gòu)化反應(yīng)的催化劑功能，涉及利用該新型催化劑功能生產(chǎn)D-阿洛糖的技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0003]單糖類根據(jù)還原基（羰基）的狀態(tài)可以大致分為醛糖（具有醛基作為羰基的糖）、 酮糖（具有酮基作為羰基的糖）、糖醇（別名：多元醇，不具有羰基的糖）。單糖類中具有被 稱為"稀少糖"的糖。稀少糖根據(jù)國際稀少糖學(xué)會(huì)的定義被定為自然界只稀少地存在的糖， 根據(jù)其種類，多數(shù)有機(jī)化學(xué)合成方法中的收率也少。因此，現(xiàn)狀是尋求包括阿洛糖的己醛糖 (醛糖）稀少糖的有效的制造方法的開發(fā)和其特異的性質(zhì)。
[0004] 已知稀少糖具有生理活性。例如，公開了以D-阿洛糖的衍生物為有效成分的抗腫 瘤劑（專利文獻(xiàn)1)，利用糖類對活性氧的性質(zhì)的情況，例如，已知有含有具有抑制活性氧的 性質(zhì)的多糖類的活性氧產(chǎn)生抑制劑（專利文獻(xiàn)2)。
[0005] 阿洛酮糖是具有酮基作為還原基的六碳糖，近年來，由于表異構(gòu)酶的出現(xiàn)而成為 比較容易得到的糖。暗示了D-阿洛酮糖能夠有效地利用為甜味料、發(fā)酵用碳源、試劑、化妝 品?醫(yī)藥品的原料?中間體等。阿洛酮糖的作為試劑?醫(yī)藥品等的中間原料的應(yīng)用例，例 如，報(bào)告有以D-阿洛酮糖作為原料的乙內(nèi)酰脲衍生物的合成例（非專利文獻(xiàn)1)。
[0006]D-阿洛糖可以由D-阿洛酮糖制造。例如，與利用了作為能夠由D-阿洛酮糖生產(chǎn) D-阿洛糖的酶的異構(gòu)酶的D-阿洛糖的制造相關(guān)的專利文獻(xiàn)中，例如有一種精制稀少糖的 大量生產(chǎn)方法，其特征在于，通過對異構(gòu)化進(jìn)行催化的酶的作用由基質(zhì)稀少糖轉(zhuǎn)換為目標(biāo) 稀少糖，通過模擬移動(dòng)床將得到的原液連續(xù)地色譜分離為目標(biāo)稀少糖組分（專利文獻(xiàn)3)。 或者，提出了使來自施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)(IPODFERMBP-08593)的具有 L_鼠李糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)作用異構(gòu)化為D-阿洛糖的D-阿洛糖的生產(chǎn)方法（專利文獻(xiàn) 4)〇
[0007] 另外，提出了使D-木糖?異構(gòu)酶作用于含有D-阿洛酮糖和/或L-阿洛酮糖的溶 液，由D-阿洛酮糖生成D-阿洛糖和D-阿卓糖，由L-阿洛酮糖生成L-阿卓糖，采集選自這 些D-阿洛糖、D-阿卓糖以及L-阿卓糖中的1種或2種以上的己醛糖的己醛糖的制造方法 (專利文獻(xiàn)5)。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0009] 專利文獻(xiàn)
[0010] 專利文獻(xiàn)1:日本特公昭59-40400號
[0011] 專利文獻(xiàn)2:日本特開平07-285871號公報(bào)
[0012] 專利文獻(xiàn)3 :日本特開2006-153591號公報(bào)
[0013] 專利文獻(xiàn)4:日本特開2008-109933號公報(bào)
[0014] 專利文獻(xiàn)5:日本特開2002-17392號公報(bào)
[0015] 專利文獻(xiàn)6 :國際公開W02007-058086號
[0016] 專利文獻(xiàn)7:美國專利5, 620, 960(1999)
[0017] 專利文獻(xiàn)8:日本特開2009-153516號公報(bào)
[0018] 非專利文獻(xiàn)
[0019]非專利文獻(xiàn) 1 :Tetrahedron，47，No. 12/13，p2113(1991)
[0020] 非專利文獻(xiàn) 2 :J.Bacteriol.，73:410-414 (1956)
[0021] 非專利文獻(xiàn) 3 :J.BiosciBioeng.，96:89-91 (2003)
[0022] 非專利文獻(xiàn) 4:Davisetal.，BASICMETHODSINMOLECULARBIOLOGY, 1986
[0023]非專利文獻(xiàn) 5:MethodsCarbohydr.Chem.，1:102-104 (1962)
[0024]非專利文獻(xiàn) 6 :Carbohydr.Res.，24:192-197 (1972)
[0025]非專利文獻(xiàn) 7 :J.FermentBioeng.，8:539_541 (l"8)
[0026]非專利文獻(xiàn) 8 :J.Mol.Biol. ,300:917-933 (2000)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0027] 發(fā)明所要解決的技術(shù)問題
[0028] -直以來雖然開發(fā)了由各種微生物制造D-阿洛糖的技術(shù)，但是由于該微生物的 安全性方面有問題，所以難以在D-阿洛糖的生產(chǎn)中實(shí)用化。因此，一直以來尋求使用來自 安全性沒有問題的微生物的酶生產(chǎn)稀少糖。
[0029] 關(guān)于稀少糖的制造，例如，已知有通過利用來自菊苣假單胞菌(Pseudomonas cichorii)的D-己酮糖3-表異構(gòu)酶可以由D-果糖制造D-阿洛酮糖。然而，由于菊苣假單 胞菌是植物病原性微生物，因此，不能說其適合利用于食品用途。也提出了通過屬于根瘤菌 屬的微生物來制造D-阿洛酮糖（專利文獻(xiàn)6)，但是屬于根瘤菌屬的微生物也是植物病原性 微生物，作為用于食品用途的菌不優(yōu)選。另外，這些技術(shù)都是生產(chǎn)D-阿洛酮糖的技術(shù)，不是 生產(chǎn)D-阿洛糖的而技術(shù)。
[0030] 為了解決與這樣的現(xiàn)有技術(shù)的安全性相關(guān)的問題，本發(fā)明的目的在于從能夠推測 出確認(rèn)能用于制造食品時(shí)的現(xiàn)有的添加物名單收載品種目錄中所收載的菌種且?guī)缀鯖]有 毒性的菌種中，取得以高收率對由D-阿洛酮糖異構(gòu)化為D-阿洛糖進(jìn)行催化的異構(gòu)酶，并提 供使用了該酶的D-阿洛糖的制造方法。
[0031] 另外，本發(fā)明提供一種通過由可以作為現(xiàn)有的添加物對食品的制造沒有問題地使 用的可能性高的放線菌得到的新型的酶來制造D-阿洛糖的方法。
[0032] 解決技術(shù)問題的技術(shù)手段
[0033] 本發(fā)明者們尋求沒有作為這樣的現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)問題的安全性相關(guān)的擔(dān)憂的生 產(chǎn)D-阿洛糖的微生物、即微生物生產(chǎn)的該酶，進(jìn)行了重復(fù)研宄，由此，完成了本發(fā)明。即，本 發(fā)明是基于從土壤中分離放線菌制作庫，從其中發(fā)現(xiàn)了具有從D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)換為D-阿洛 糖的作用的酶而成的。由于放線菌可以作為現(xiàn)有的添加物酶的起源微生物食品制造上沒有 問題地使用的可能性高，因此，由放線菌得到的異構(gòu)酶能夠作為非常有用的D-阿洛糖的大 量生產(chǎn)的手段。
[0034] 即，本發(fā)明以以下的（1)~（3)中記載的具有活性的蛋白質(zhì)為要點(diǎn)。
[0035] (1) -種蛋白質(zhì)，其中，具有如下的活性：識別醛糖C1的CH0基團(tuán)和C2的0H基團(tuán) 并進(jìn)行反應(yīng)，將C1的CH0基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)?H基團(tuán)，將C2的0H基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)镃0基團(tuán)；或者識別酮 糖C1的0H基團(tuán)和C2的C0基團(tuán)并進(jìn)行反應(yīng)，將C1的0H基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)镃H0基團(tuán)，將C2的C0 基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)?H基團(tuán)；
[0036] 并且，所述蛋白質(zhì)是下述（a)至（c)中任一記載的蛋白質(zhì)：
[0037] (a)由序列號1或序列號2所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)；
[0038] (b)由序列號1或序列號2所示的氨基酸序列中，1個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被置換、 添加、插入或缺失而成的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)；
[0039] (c)由與序列號1或序列號2所示的氨基酸序列具有60%以上的同源性的氨基酸 序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)。
[0040] (2)如上述⑴所述的蛋白質(zhì)，其中，將酮糖的D-阿洛酮糖異構(gòu)化為醛糖的D-阿 洛糖。
[0041] (3)如上述⑴或⑵所述的蛋白質(zhì)，其中，所述蛋白質(zhì)是由以下⑷~（f)的物 理化學(xué)性質(zhì)特定的，
[0042] (d)作用pH和最適pH，
[0043] 作用pH為 6.0 ~11.0,最適pH為 9.0 ;
[0044] (e)作用溫度和最適溫度，
[0045] 作用溫度為10~80°C，最適溫度為60°C;
[0046] (f)對于L-鼠李糖、D-木糖、D-核糖、D-阿洛糖、D-葡萄糖以及L-阿拉伯糖有反 應(yīng)性。
[0047] 另外，本發(fā)明的要點(diǎn)還在于⑷所記載的DNA、（5)所記載的重組載體、（6)所記載 的宿主細(xì)胞、以及（7)所記載的重組蛋白質(zhì)的制造方法。
[0048] (4) 一種來自鏈霉菌(Streptomycessp. ) 710 (保藏號：NITEBP-01423)或鏈霉菌 (Streptomvcessp.) 720 (保藏號：NITEBP-01424)的DNA，其中，編碼由序列號3或序列號 4所示的堿基序列或其互補(bǔ)序列、或者包含這些序列的一部分或全部的序列構(gòu)成的權(quán)利要 求1或2所述的蛋白質(zhì)。
[0049] (5) -種重組載體，其中，包含上述⑷所述的DNA。
[0050] (6) -種宿主細(xì)胞，其中，包含能夠表達(dá)上述（1)、⑵或⑶所述的蛋白質(zhì)的表達(dá) 體系。
[0051] (7) -種重組蛋白質(zhì)的制造方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述（6)所述的包 含表達(dá)體系的宿主細(xì)胞，從得到的培養(yǎng)物中采取上述（1)、（2)或（3)所述的重組蛋白質(zhì)。
[0052] 另外，本發(fā)明的要點(diǎn)還在于以下（8)至（12)的D-阿洛糖的生產(chǎn)方法。
[0053] (8) -種D-阿洛糖的生產(chǎn)方法，其特征在于，使上述（1)、⑵或⑶所述的蛋白 質(zhì)作用于D-阿洛酮糖，將D-阿洛酮糖異構(gòu)化為D-阿洛糖。
[0054] (9)如上述⑶所述的D-阿洛糖的生產(chǎn)方法，其中，D-阿洛酮糖是將D-果糖表異 構(gòu)化來生產(chǎn)的。
[0055] (10)如上述⑶所述的D-阿洛糖的生產(chǎn)方法，其中，D-阿洛酮糖是將D-葡萄糖 異構(gòu)化轉(zhuǎn)變?yōu)镈-果糖，將該D-果糖表異構(gòu)化來生產(chǎn)的。
[0056] (11)如上述⑶所述的D-阿洛糖的生產(chǎn)方法，其中，D-阿洛酮糖是由未利用資源 得到D-葡萄糖，將該D-葡萄糖異構(gòu)化轉(zhuǎn)變?yōu)镈-果糖，將該D-果糖表異構(gòu)化來生產(chǎn)的。
[0057] (12)如上述⑶~（11)中任一項(xiàng)所述的D-阿洛糖的生產(chǎn)方法，其中，作為目標(biāo)的 D-阿洛糖為D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的混合物。
[0058] 發(fā)明的效果
[0059] 根據(jù)本發(fā)明，即通過使用來自屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)的微生物的酶蛋白 質(zhì)，從而能夠識別醛糖C1的CH0基團(tuán)和C2的0H基團(tuán)并進(jìn)行反應(yīng)，將C1的CH0基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)?0H基團(tuán)，將C2的0H基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)镃0基團(tuán)；或者識別酮糖的C1的0H基團(tuán)和C2的C0基團(tuán)并 進(jìn)行反應(yīng)，將C1的0H基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)镃H0基團(tuán)，將C2的C0基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)?H基團(tuán)，優(yōu)選能夠由 D-阿洛酮糖生產(chǎn)D-阿洛糖。本發(fā)明可以提供由來自屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)的微生 物的序列號1或序列號2所記載的氨基酸序列構(gòu)成的酶，所述酶識別醛糖C1的CH0基團(tuán)和 C2的0H基團(tuán)并進(jìn)行反應(yīng)，將C1的CH0基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)?H基團(tuán)，將C2的0H基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)镃0基 團(tuán)；或者識別酮糖的C1的0H基團(tuán)和C2的C0基團(tuán)并進(jìn)行反應(yīng)，將C1的0H基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)镃H0 基團(tuán)，將C2的C0基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)?H基團(tuán)，優(yōu)選將D-阿洛酮糖異構(gòu)化為D-阿洛糖，另外，通過 使用所述酶可以生產(chǎn)D-阿洛糖。
[0060] 根據(jù)本發(fā)明，能夠使用菌體培養(yǎng)物的安全性非常高的菌是很大的技術(shù)進(jìn)步，將 D-阿洛酮糖異構(gòu)化生產(chǎn)D-阿洛糖的酶及其制造方法的確立不僅在制糖產(chǎn)業(yè)，在與其相關(guān) 的食品、化妝品、醫(yī)藥品產(chǎn)業(yè)中的工業(yè)意義也極大。另外，本發(fā)明能夠以最廉價(jià)可以大量取 得的D-葡萄糖、或者果糖為原料經(jīng)由D-阿洛酮糖制造D-阿洛糖。
【附圖說明】
[0061] 圖1是表示實(shí)施例1的重組型異構(gòu)酶的