專利名稱：應用畢赤酵母的pGAP調(diào)控表達轉(zhuǎn)酮醇酶的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，涉及一種應用畢赤酵母的pGAP啟動子調(diào)控生產(chǎn)生物 蛋白的方法，具體是一種應用畢赤酵母的PGAP調(diào)控表達轉(zhuǎn)酮醇酶的方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)酮醇酶(transketolase EC 2. 2. 1. 1)，亦稱轉(zhuǎn)羥乙醛酶或酮基移換酶。轉(zhuǎn)酮醇 酶廣泛存在于微生物界，現(xiàn)已知產(chǎn)轉(zhuǎn)酮醇酶的微生物有某些細菌、真菌和弧菌等。木糖是半 纖維素的主要組成成分，在植物纖維材料水解液中占30%左右，是僅次于葡萄糖的自然界 最豐富的糖分。利用微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化木糖生產(chǎn)乙醇是當前的研究熱點之一。能夠高效釀酒 的微生物(例如釀酒酵母和運動發(fā)酵單孢菌)都不具備直接利用木糖生成酒精的能力，必 須經(jīng)過系列酶的作用才能將木糖轉(zhuǎn)化成為能被釀酒微生物能夠利用生成酒精的物質(zhì)，而轉(zhuǎn) 酮醇酶是這一系列的轉(zhuǎn)換木糖作用途徑中的關鍵酶。因此，轉(zhuǎn)酮醇酶在利用植物半纖維素 生成乙醇方面有意義。目前所應用的轉(zhuǎn)酮醇酶主要是以天然的含轉(zhuǎn)酮醇菌株進行發(fā)酵生產(chǎn) 的。但是，由于天然的轉(zhuǎn)酮醇酶菌株的生長緩慢，生產(chǎn)周期長，調(diào)控基因的啟動子的強度低 致使產(chǎn)物量少，使生產(chǎn)成本較高，不利于轉(zhuǎn)酮醇酶的規(guī)?；a(chǎn)和利用。
畢赤酵母(Pichia pastoris)是最近迅速發(fā)展的一種真核表達宿主，營養(yǎng)要求不 高，適合于高密度發(fā)酵的大規(guī)模生產(chǎn)方式，由于Pichi即astoris分泌自身的蛋白很少，有 利于表達產(chǎn)物的純化。pGAP(三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子)是Pichia pastoris的組成型 強啟動子，與Pichia pastoris的pA0Xl (醇氧化酶1啟動子)相比其優(yōu)越性主要是不需要 有毒性的甲醇作為碳源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為解決應用天然的轉(zhuǎn)酮醇酶菌株的生長緩慢，營養(yǎng)要求較高，使 轉(zhuǎn)酮醇酶生產(chǎn)成本較高的問題，而提供一種應用畢赤酵母的PGAP(三磷酸甘油醛脫氫酶啟 動子)調(diào)控表達轉(zhuǎn)酮醇酶的方法。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是 —種應用畢赤酵母的pGAP調(diào)控表達轉(zhuǎn)酮醇酶的方法，其步驟是
1、首先從畢赤酵母中擴增pGAP啟動子； 2、在轉(zhuǎn)酮醇酶序列的3'末端融合His6標簽，構(gòu)建由pGAP調(diào)控轉(zhuǎn)酮醇酶基因的畢
赤酵母表達載體，并將這一載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母基因組； 3、根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選高拷貝重組子作為工程菌株； 4、將工程菌株接種于含碳源的液體培養(yǎng)基中，于28 3(TC在生物反應器中發(fā)酵
工程菌1 2d分泌表達轉(zhuǎn)酮醇酶。所述液體培養(yǎng)基是由以下組分組成85%磷酸25
28ml/L，CaS04 *2H20 0. 8 1. 2g/L，K2S04 17 19g/L，MgS04 *7H20 13 16g/L，K0H 3. 5
4. 5g/L，碳源15 45g/L，蛋白胨18 22g/L，Yeast extract 8 12g/L，PTM43 5ml/L。
所述PTM4是由以下組分組成:CuS04 5H20 2. 0g/L， Nal 2H200. lg/L， MnS04 H20 3. 0g/L，Na2Mo04 2H20 0. 2g/L， H3B03 0. 02g/L， CoCl2 6H20 1. 05g/L， ZnCl2 7. 0g/L， Fe2 (S04) 3 7H20 22g/L，生物素0. 2g/L，硫酸lml/L。 所述碳源是甘油、油酸、山梨醇、葡萄糖、乳酸、甘氨酸、丙氨酸、海藻糖或甘露醇。 本發(fā)明采用了畢赤酵母的pGAP調(diào)控表達的轉(zhuǎn)酮醇酶，具有下列優(yōu)點 1、生產(chǎn)成本低，只需使用普通的無機鹽、碳源和氮源作為發(fā)酵培養(yǎng)基。 2、可在生物反應器中發(fā)酵畢赤酵母，其細胞能生長至細胞密度達200A以上，能以
足夠多的細胞數(shù)量表達轉(zhuǎn)酮醇酶，有利于轉(zhuǎn)酮醇酶的大規(guī)模生產(chǎn)。 3、發(fā)酵周期短，整個發(fā)酵周期只需1 2d。 4、使用無毒性的碳源，不需要使用有毒性的甲醇作為碳源，無毒副作用。 5、由于pGAP是畢赤酵母的強啟動子，由pGAP調(diào)控表達的轉(zhuǎn)酮醇酶約占總分泌蛋
白的比例較高，并且由于在轉(zhuǎn)酮醇酶的C端融合了His標簽，有利于產(chǎn)物的純化。
具體實施例方式
下面采用非限定性實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例一 1、首先從Pichia pastoris中擴增pGAP啟動子； 2、在轉(zhuǎn)酮醇酶序列的3'末端融合His6標簽，構(gòu)建由pGAP調(diào)控轉(zhuǎn)酮醇酶基因的 Pichia pastoris表達載體，并將這一載體轉(zhuǎn)化Pichiapastoris基因組；
3、根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選高拷貝重組子作為工程菌株；
4、將工程菌株菌液接種于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基的配方(每升)85%磷酸 26. Oml， CaS04 2H20 0. 85g， K2S04 17. 5g， MgS04 7H20 13. 9g， KOH 3. 83g，甘油40g，蛋白 胨19g， Yeast extract 9g， PTM4微量元素3mlPTM4配方(每升)CuS04 5H20 2. Og， Nal 2H20 0. lg， MnS04 H20 3. Og， Na2Mo04 2H20 0. 2g， H萬O. 02g， CoCl2 6H20 1. 05g， ZnCl2 7. Og， Fe2 (S04) 3 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml，在生物反應器中進行發(fā)酵表達轉(zhuǎn) 酮醇酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度28t:，pH5.0，攪拌轉(zhuǎn)速300r/min。發(fā)酵2d后離心收獲上清進 行純化轉(zhuǎn)酮醇酶。通過蛋白電泳和酶活性測定對表達的轉(zhuǎn)酮醇酶進行鑒定(蛋白電泳證明 發(fā)酵表達的目標蛋白符合轉(zhuǎn)酮醇酶蛋白分子量，并且轉(zhuǎn)酮醇酶活性> ly/yg目標蛋白) 而證明本實施所獲得的產(chǎn)品是轉(zhuǎn)酮醇酶。
實施例二 1、首先從Pichia pastoris中擴增pGAP啟動子； 2、在轉(zhuǎn)酮醇酶基因序列的3'末端融合His6標簽，構(gòu)建由pGAP調(diào)控轉(zhuǎn)酮醇酶基因 的Pichia pastoris表達載體，并將這一載體轉(zhuǎn)化Pichia pastoris基因組；
3、根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選高拷貝重組子作為工程菌株；
4、將工程菌株菌液接種于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基的配方(每升)85%磷酸 26. 7ml， CaS04 2H20 0. 93g， K2S04 18. 2g， MgS04 7H20 14. 9g， KOH 4. 13g，油酸20g，蛋白 胨20g， Yeast extract 10g， PTM4微量元素4ml(PTM4配方(每升):CuS04 5H20 2. Og， Nal 2H20 0. lg， MnS04 H20 3. Og， Na2Mo04 2H20 0. 2g， H萬O. 02g， CoCl2 6H20 1. 05g， ZnCl2 7. Og， Fe2 (S04) 3 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反應器中進行發(fā)酵表達轉(zhuǎn) 酮醇酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度3(TC，pH5.0，攪拌轉(zhuǎn)速500r/min。發(fā)酵ld后離心收獲上清進行純化轉(zhuǎn)酮醇酶。通過蛋白電泳和酶活性測定對表達的轉(zhuǎn)酮醇酶進行鑒定(蛋白電泳證明 發(fā)酵表達的目標蛋白符合轉(zhuǎn)酮醇酶蛋白分子量，并且轉(zhuǎn)酮醇酶活性> lp/yg目標蛋白) 而證明本實施所獲得的產(chǎn)品是轉(zhuǎn)酮醇酶。
實施例三 1、首先從Pichia pastoris中擴增pGAP啟動子； 2、在轉(zhuǎn)酮醇酶基因序列的3'末端融合His6標簽，構(gòu)建由pGAP調(diào)控轉(zhuǎn)酮醇酶基因 的Pichia pastoris表達載體，并將這一載體轉(zhuǎn)化Pichia pastoris基因組；
3、根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選高拷貝重組子作為工程菌株；
4、將工程菌株菌液接種于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基的配方(每升)85%磷酸 27. 7ml， CaS04 2H20 1. 05g， K2S04 18. 2g， MgS04 7H20 15. 3g， K0H 4. 33g，山梨醇35g，蛋白 胨21g， Yeast extract 12g， PTM4微量元素4mlPTM4配方(每升)CuS04 5H20 2. 0g， Nal 2H20 0. lg， MnS04 H20 3. 0g， Na2Mo04 2H20 0. 2g， H萬O. 02g， CoCl2 6H20 1. 05g， ZnCl2 7. 0g， Fe2 (S04) 3 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml，在生物反應器中進行發(fā)酵表達轉(zhuǎn) 酮醇酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度28t:，pH5.0，攪拌轉(zhuǎn)速600r/min。發(fā)酵2d后離心收獲上清進 行純化轉(zhuǎn)酮醇酶。通過蛋白電泳和酶活性測定對表達的轉(zhuǎn)酮醇酶進行鑒定(蛋白電泳證明 發(fā)酵表達的目標蛋白符合轉(zhuǎn)酮醇酶蛋白分子量，并且轉(zhuǎn)酮醇酶活性> ly/yg目標蛋白) 而證明本實施所獲得的產(chǎn)品是轉(zhuǎn)酮醇酶。
實施例四 1、首先從Pichia pastoris中擴增pGAP啟動子； 2、在轉(zhuǎn)酮醇酶基因序列的3'末端融合His6標簽，構(gòu)建由pGAP調(diào)控轉(zhuǎn)酮醇酶基因
的Pichia pastoris表達載體，并將這一載體轉(zhuǎn)化Pichia pastoris基因組； 3、根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選高拷貝重組子作為工程菌株； 4、將工程菌株菌液接種于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基的配方(每升)85%磷酸
26. 5ml ， CaS04 2H20 0. 93g， K2S04 18. 5g， MgS04 7H20 15. 5g， K0H 4. 13g，葡萄糖40g，蛋白 胨22g， Yeast extract 12g， PTM4微量元素5mlPTM4配方(每升)CuS04 5H20 2. Og， Nal 2H20 0. lg， MnS04 H20 3. Og， Na2Mo04 2H20 0. 2g， H萬O. 02g， CoCl2 6H20 1. 05g， ZnCl2 7. Og， Fe2 (S04) 3 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml，在生物反應器中進行發(fā)酵表達轉(zhuǎn) 酮醇酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度28t:，pH5.0，攪拌轉(zhuǎn)速700r/min。發(fā)酵ld后離心收獲上清進 行純化轉(zhuǎn)酮醇酶。通過蛋白電泳和酶活性測定對表達的轉(zhuǎn)酮醇酶進行鑒定(蛋白電泳證明 發(fā)酵表達的目標蛋白符合轉(zhuǎn)酮醇酶蛋白分子量，并且轉(zhuǎn)酮醇酶活性> ly/yg目標蛋白) 而證明本實施所獲得的產(chǎn)品是轉(zhuǎn)酮醇酶。 實施例五 1、首先從Pichia pastoris中擴增pGAP啟動子； 2、在轉(zhuǎn)酮醇酶基因序列的3'末端融合His6標簽，構(gòu)建由pGAP調(diào)控轉(zhuǎn)酮醇酶基因
的Pichia pastoris表達載體，并將這一載體轉(zhuǎn)化Pichia pastoris基因組； 3、根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選高拷貝重組子作為工程菌株； 4、將工程菌株菌液接種于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基的配方(每升)85%磷酸
27. 5ml ， CaS04 2H20 1. 17g， K2S04 18. 7g， MgS04 7H20 15. 5g， KOH 4. 33g，乳酸30g，蛋白 胨20g， Yeast extract 10g， PTM4微量元素4mlPTM4配方(每升)CuS04 5H20 2. Og，Nal 2H20 0. lg， MnS04 H20 3. 0g， Na2Mo04 2H20 0. 2g， H萬O. 02g， CoCl2 6H20 1. 05g， ZnCl2 7. 0g， Fe2 (S04) 3 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml，在生物反應器中進行發(fā)酵表達轉(zhuǎn) 酮醇酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度3(TC，pH5.0，攪拌轉(zhuǎn)速800r/min。發(fā)酵ld后離心收獲上清進 行純化轉(zhuǎn)酮醇酶。通過蛋白電泳和酶活性測定對表達的轉(zhuǎn)酮醇酶進行鑒定(蛋白電泳證明 發(fā)酵表達的目標蛋白符合轉(zhuǎn)酮醇酶蛋白分子量，并且轉(zhuǎn)酮醇酶活性> ly/yg目標蛋白) 而證明本實施所獲得的產(chǎn)品是轉(zhuǎn)酮醇酶。
權(quán)利要求
一種應用畢赤酵母的pGAP調(diào)控表達轉(zhuǎn)酮醇酶的方法，其特征在于，其步驟如下1)、首先從畢赤酵母中擴增pGAP啟動子；2)、在轉(zhuǎn)酮醇酶序列的3’末端融合His6標簽，構(gòu)建由pGAP調(diào)控轉(zhuǎn)酮醇酶基因的畢赤酵母表達載體，并將這一載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母基因組；3)、根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選高拷貝重組子作為工程菌株；4)、將工程菌株接種于含碳源的液體培養(yǎng)基中，于28～30℃在生物反應器中發(fā)酵工程菌1～2d分泌表達轉(zhuǎn)酮醇酶；所述液體培養(yǎng)基是由以下組分組成85％磷酸25～28ml/L，CaSO4·2H2O 0.8～1.2g/L，K2SO4 17～19g/L，MgSO4·7H2O 13～16g/L，KOH 3.5～4.5g/L，碳源15～45g/L，蛋白胨18～22g/L，Yeast extract 8～12g/L，PTM4 3～5ml/L；所述PTM4是由以下組分組成CuSO4·5H2O 2.0g/L，NaI·2H2O0.1g/L，MnSO4·H2O 3.0g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，H3BO3 0.02g/L，CoCl2·6H2O 1.05g/L，ZnCl2 7.0g/L，F(xiàn)e2(SO4)3·7H2O 22g/L，生物素0.2g/L，硫酸1ml/L。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用畢赤酵母的pGAP調(diào)控表達轉(zhuǎn)酮醇酶的方法，其特征在 于所述碳源是甘油、油酸、山梨醇、葡萄糖、乳酸、甘氨酸、丙氨酸、海藻糖或甘露醇。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領域，是一種應用畢赤酵母的pGAP調(diào)控表達轉(zhuǎn)酮醇酶的方法，首先從畢赤酵母中擴增pGAP啟動子；構(gòu)建由pGAP調(diào)控轉(zhuǎn)酮醇酶基因的畢赤酵母表達載體，并將這一載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母基因組；根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選高拷貝重組子作為工程菌株；將工程菌株接種于含碳源的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵工程菌分泌表達轉(zhuǎn)酮醇酶。本發(fā)明生產(chǎn)成本低，發(fā)酵周期短，利用畢赤酵母的pGAP調(diào)控表達的轉(zhuǎn)酮醇酶有利于產(chǎn)物的純化，解決應用天然產(chǎn)轉(zhuǎn)酮醇酶的菌株生產(chǎn)異淀粉酶的成本較高、產(chǎn)物難于純化等的問題，有利于轉(zhuǎn)酮醇酶的大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12N9/10GK101698835SQ20091020977
公開日2010年4月28日 申請日期2009年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月25日
發(fā)明者尹慧祥, 屈直, 張?zhí)碓? 張愛聯(lián), 羅進賢 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所