專利名稱：檢測胚胎染色體拷貝數(shù)的試劑盒、裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測胚胎染色體拷貝數(shù)的試劑盒、裝置以及方法。
背景技術(shù)：
染色體拷貝數(shù)異常和人類的疾病有著密切的關(guān)系。平均每1000個(gè)新生兒中，有9 個(gè)會攜帶因染色體拷貝數(shù)異常而導(dǎo)致的疾?、?。因此在胎兒尚未出生之前能夠檢測出染色 體拷貝數(shù)是很重要的。然而，目前所用的診斷方法，包括羊膜穿刺和羊絨毛膜取樣，都屬于 有創(chuàng)傷的方法，會給孕婦和胎兒帶來一定的風(fēng)險(xiǎn)。用血清蛋白標(biāo)記物和超聲波來檢測胎兒 是否有染色體拷貝數(shù)異常的疾病雖無創(chuàng)傷，但不是直接檢測致病因素，因而準(zhǔn)確性和靈敏 度都不太好(2)，也存在不能盡早地發(fā)現(xiàn)染色體拷貝數(shù)異常疾病的問題。這樣的現(xiàn)狀促使研 究人員去開發(fā)一種精確而且靈敏度高的無創(chuàng)診斷和檢測方法。自從母體血液中的胚胎DNA被發(fā)現(xiàn)之后(3)，無創(chuàng)傷地直接診斷和檢測胚胎染色體 異常性成了一個(gè)重大的研究課題。2007年，盧煜明教授和他的同事們證明可以用母體血漿 mRNA中胎盤特異基因4的突變位點(diǎn)比例來斷定胚胎是否有21號染色體3倍體⑷。突變位 點(diǎn)比例同時(shí)也被用來判斷18號染色體是否為3倍體⑸。它的局限性在于突變位點(diǎn)在人群 中并不普遍，所以這些方法只適用于一部分人群。在同一時(shí)期，數(shù)碼PCR(digital PCR，或 dPCR)被用來檢測胚胎的染色體3倍體(6)’ (7)。數(shù)碼PCR的優(yōu)勢是不依賴任何突變位點(diǎn)，但 它的精確度不夠高，而且需要大量血樣，加大了采樣的困難。近年來迅猛發(fā)展的高通量測序技術(shù)解決了以上的問題。這些技術(shù)包括Illumina 公司的 Genome Analyzer , Life Technologies 公司的 S0LiD(9)，以及 Helicos 公司的 HeliSCOpea°)，能一次性地檢測出幾億乃至幾十億個(gè)序列。用這些技術(shù)來檢測母體血漿DNA 時(shí)，血漿中微量的胚胎DNA的染色體數(shù)目的變化能被檢測出來(11)’(12)’㈦)。但因?yàn)闇y序的成 本太高，目前這些技術(shù)尚未被普遍使用。同時(shí)，從母體血液中檢測胚胎染色體的局部拷貝數(shù) 的變化還屬于未解決的難題。用高通量測序來檢測母體血漿中胚胎染色體的拷貝數(shù)變化有 一些優(yōu)勢，但目前價(jià)錢昂貴，不能普及。而且測序的偏差(CV)比較高，檢測的精確度和穩(wěn)定 性也都有待改進(jìn)。測序的偏差也決定了這種方法只適合少數(shù)幾個(gè)染色體，如21號染色體， 18號染色體，而且目前還不適合于染色體局部拷貝數(shù)變化的檢測。用高通量測序來檢測染色體數(shù)目的變化的高成本和難度主要因?yàn)槟阁w血漿中胚 胎DNA的含量比較低，低時(shí)只占5%，尤其在胚胎發(fā)育的早期。母體血漿中的大部分DNA還 是母體DNA。胚胎染色體數(shù)目或局部拷貝數(shù)的變化很容易被母體DNA的背景所覆蓋。因此 分離母體和胚胎DNA的方法也就成為多年來研究的課題，但成效不大。比較成功的方法應(yīng) 屬Baylor醫(yī)學(xué)院發(fā)明的針對組蛋白的分離方法(14)。不過分離出來的DNA量太少，只適合 于突變位點(diǎn)的檢測，不宜用來檢測染色體拷貝數(shù)的變化。

發(fā)明內(nèi)容
針對上面檢測胚胎染色體拷貝數(shù)的方法中的種種問題，發(fā)明人根據(jù)母體血漿中胚胎DNA和母體DNA的長度設(shè)計(jì)出一種能有效地低成本檢測出胚胎染色體全部或局部拷貝數(shù) 的試劑盒、裝置及方法。本發(fā)明是基于以下的事實(shí)如在文獻(xiàn)中報(bào)道的(15)，母體血漿中的胚胎DNA大部分 為IOObp到250bp的片段，且150bp到170bp的DNA尤其占多數(shù)，雖然母體的DNA也有很小 部分分布在這個(gè)片段區(qū)域，但片段大于250bp的DNA基本上屬于母體的DNA。本發(fā)明的發(fā)明 人首次發(fā)現(xiàn)，雖然理由未知，各個(gè)染色體占總DNA的比例在IOObp到250bp之間的任意一點(diǎn) 或任意一個(gè)區(qū)間處的DNA是均勻分布的，即各個(gè)染色體在IOObp到250bp之間的任何一點(diǎn)， 比如IlObp或167bp (此位點(diǎn)的DNA量最多)，與總DNA的比例代表了其他點(diǎn)的比例，因此， 也就代表了各個(gè)染色體占IOObp到250bp之間的所有DNA的比例?；谝陨系陌l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人發(fā)明了相對無創(chuàng)且經(jīng)濟(jì)方便地檢測胚胎染色體拷貝數(shù) 的試劑盒、裝置和方法。本發(fā)明的一種檢測胚胎染色體拷貝數(shù)的試劑盒包括從母體取血液的器械；適合 將所述血液中的血細(xì)胞和血漿分離的器械；抽提所述血漿中的DNA的試劑和器械；通過物 理方法根據(jù)所述DNA的片段大小對其進(jìn)行分離的試劑和器械；和取100bp-250bp之間的任 意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的所有DNA進(jìn)行測序的試劑和器械。優(yōu)選地，所述物理方法是瓊脂糖凝膠電泳的方法。優(yōu)選地，所述檢測胚胎染色體拷貝數(shù)的試劑盒還包括將所述DNA制成供雙端測 序的文庫的試劑和器械。優(yōu)選地，所述檢測胚胎染色體拷貝數(shù)的試劑盒還包括對所述從血漿中抽提的 DNA或所述供雙端測序的文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增的試劑和器械。優(yōu)選地，其中所述100_250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的DNA是 150bp-170bp 的 DNA。優(yōu)選地，其中所述100_250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的DNA是167bp的 DNA。優(yōu)選地，其中所述雙端測序?qū)λ鯠NA兩端各20_100bp的雙端短序列進(jìn)行測試。本發(fā)明的另一種檢測胚胎染色體拷貝數(shù)的試劑盒包括從母體取血液的器械；適 合將所述血液中的血細(xì)胞和血漿分離的器械；抽提所述血漿中的DNA的試劑和器械；將所 述DNA制成可供雙端測序的文庫的試劑和器械；和對所述DNA進(jìn)行雙端短序列測序的試劑 和器械。優(yōu)選地，所述雙端短序列是所述DNA兩端各小于50bp的核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的另一種檢測胚胎染色體拷貝數(shù)的試劑盒還包括對所述從血漿 中抽提的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的試劑和器械。本發(fā)明的一種檢測胚胎染色體拷貝數(shù)的裝置包括檢測模塊，用于對母體血漿樣 本中的DNA進(jìn)行測序；比對模塊，用于將所述DNA的測序結(jié)果與染色體組序列圖譜進(jìn)行比 對，以確定所述DNA中的每段DNA來自幾號染色體以及所述每段DNA的序列長度；計(jì)算模 塊，用于計(jì)算在同一樣本內(nèi)所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的所 有DNA中來自待測染色體與來自參考染色體的DNA片段數(shù)的比值，并計(jì)算各個(gè)樣本間所述 比值的變異，根據(jù)所述變異的數(shù)值確定待測染色體的拷貝數(shù)；以及輸出模塊，用于輸出所述 待測染色體的拷貝數(shù)。
優(yōu)選地，對所述母體血漿樣本中DNA進(jìn)行測序僅包括對所述DNA中100bp_250bp 之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的DNA進(jìn)行測序，通過物理方法可以分離出固定長度區(qū)間 的 DNA。優(yōu)選地，所述母體血漿樣本中DNA在檢測前被制作成可供雙端測序的文庫。優(yōu)選地，所述雙端測序?qū)λ鯠NA兩端各小于50bp的雙端短序列進(jìn)行測試。優(yōu)選地，對所述DNA的所述雙端短序列進(jìn)行測試后，通過與染色體組序列圖譜進(jìn) 行比對確定每段所述DNA的長度。優(yōu)選地，所述母體血漿樣本中DNA在檢測前進(jìn)行了 PCR的擴(kuò)增。優(yōu)選地，所述母體血漿樣本中DNA在被制作成可供雙端測序的文庫之前或之后進(jìn) 行了 PCR的擴(kuò)增。優(yōu)選地，所述100_250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的DNA是150bp_170bp 的 DNA。優(yōu)選地，所述100_250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間是DNA是167bp的DNA。優(yōu)選地，所述參考染色體是2號、7號、12號、14號染色體或它們的任意組合。優(yōu)選地，所述待測染色體是13號、18號、21號、X、Y染色體或它們的任意組合。本發(fā)明的一種檢測胚胎染色體拷貝數(shù)的方法包括以下步驟取母體血液；將所述 血液中的血漿和血細(xì)胞分離；通過物理方法將所述血漿中的DNA根據(jù)所述DNA的片段大小 對其進(jìn)行分離；對所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的DNA進(jìn)行 測序；將所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的所有DNA的測序結(jié) 果與染色體組序列圖譜進(jìn)行比對，以確定所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意 一個(gè)區(qū)間的所有DNA中的每段DNA來自幾號染色體；以及計(jì)算在同一樣本內(nèi)所述DNA中 100bp-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的所有DNA中來自待測染色體與來自參考染 色體的DNA片段數(shù)的比值，并計(jì)算各個(gè)樣本間所述比值的變異，根據(jù)所述變異的數(shù)值確定 待測染色體的拷貝數(shù)。優(yōu)選地，所述物理方法是是瓊脂糖凝膠電泳的方法。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述檢測胚胎染色體拷貝數(shù)的方法還包括在通過物理方 法分離所述DNA大小之前或之后將DNA制成可供雙端測序的文庫，其中對所述DNA中 100bp-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的DNA進(jìn)行測序采用的是雙端測序的方法。優(yōu)選地，所述100_250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的DNA是150bp_170bp 的 DNA。優(yōu)選地，所述100_250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的DNA是167bp的DNA。優(yōu)選地，所述雙端測序?qū)λ鯠NA兩端各小于50bp的雙端短序列進(jìn)行測試。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述檢測胚胎染色體拷貝數(shù)的方法還包括將所述DNA的所述 雙端短序列的測試結(jié)果與染色體組序列圖譜進(jìn)行比對以確定每段所述DNA的長度的步驟。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述檢測胚胎染色體拷貝數(shù)的方法還包括在通過所述物理方 法分離所述DNA之前或所述測序之前對所述DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟。本發(fā)明的另一種檢測胚胎染色體拷貝數(shù)的方法，包括以下步驟取母體血液；將 所述血液中的血漿和血細(xì)胞分離；對所述血漿中的DNA制作成可供雙端測序的文庫；對所 述DNA雙端測序文庫的雙端短序列進(jìn)行測序；將所述測序的結(jié)果與染色體組序列圖譜進(jìn)行比對，確定每段所述DNA序列來自幾號染色體以及每段所述DNA序列的長度；以及取所述 DNA的序列長度在100bp-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的所有DNA的測序和比對 結(jié)果，計(jì)算在同一樣本內(nèi)所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的所有 DNA中來自待測染色體與來自參考染色體的DNA片段數(shù)的比值，并計(jì)算各個(gè)樣本間所述比 值的變異，根據(jù)所述變異的數(shù)值確定待測染色體的拷貝數(shù)。優(yōu)選地，所述100_250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的DNA是150bp_170bp 的 DNA。優(yōu)選地，所述100-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的DNA是167bp的DNA。優(yōu)選地，所述雙端測序?qū)λ鯠NA兩端各小于50bp的雙端短序列進(jìn)行測試?？商鎿Q地，上述的檢測胚胎染色體拷貝數(shù)的方法也可以通過測試所述血漿中的 DNA的單端長序列以代替雙端測序，此時(shí)可以包括也可以不包括對所述血漿中的DNA制作 成可供雙端測序的文庫的步驟，因?yàn)闇y試單端長序列的文庫可以與供雙端測序的文庫是同 一文庫。當(dāng)用本發(fā)明的試劑盒、裝置及方法來計(jì)算胚胎DNA的染色體數(shù)或染色體局部拷貝 數(shù)的變化，發(fā)現(xiàn)計(jì)算出來的胚胎DNA的染色體數(shù)或染色體局部拷貝數(shù)不但精確，而且需要 的血樣很少，計(jì)算所需的序列數(shù)目可以大大減少，從而大幅度地降低測序成本。


圖1是將母體血漿的DNA制成可供雙端測序的文庫后，用的瓊脂糖凝膠電泳后 的圖像。左邊的通道是DNA IOObp標(biāo)準(zhǔn)樣的圖像，右邊的通道是可供雙端測序的文庫DNA 的圖像，最明顯的條帶位于^Obp左右，其中包含了 120bp的連接引物。圖2是樣品G367的DNA片段大小的分布圖。圖3是比對后樣品G367中確定來自X染色體的DNA片段根據(jù)片段大小所做的分 布圖。圖4是計(jì)算得出的和實(shí)際測得的G367X染色體的DNA片段根據(jù)片段大小所做的分 布圖，圖中帶星號的線表示G367樣品的總DNA序列數(shù)乘以X染色體的百分比后得到的圖 形，圓圈代表實(shí)際檢測到的X染色體的序列數(shù)。如圖中所示，計(jì)算得出的G367X染色體的 DNA片段的分布與實(shí)際測量得到的分布基本相同，兩條線基本完全吻合。
具體實(shí)施例方式需要說明的是，在不矛盾的情況下，本申請中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相 互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。本發(fā)明的附圖及其實(shí)施例僅僅 用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。名詞解釋雙端短序列是指緊接著5’端鏈接引物的小于50bp的序列和緊接著3’端鏈接引 物的小于50bp的序列。優(yōu)選地，雙端短序列是指緊接著5’端鏈接引物的不大于36bp的序 列和緊接著3’端鏈接引物的不大于36bp的序列。單端長序列是指緊接著5’端鏈接引物的大于99bp的序列或緊接著3’端鏈接引 物的大于99bp的序列。
雙端測序是指分別測試位于序列兩端的雙端短序列。DNA簇指由單一 DNA分子擴(kuò)增而成的位于一定固體面積的多個(gè)DNA分子。在該申 請的實(shí)施例中，DNA簇指由單一 DNA分子擴(kuò)增而成的位于1平方微米內(nèi)的大約1000個(gè)DNA 分子。乳化PCR指的是將PCR(Polymerase Chain Reaction)的反應(yīng)物，包括PCR模板 DNA、PCR引物、PCR聚合酶和堿基置于一個(gè)油珠內(nèi)進(jìn)行PCR反應(yīng)。通常情況下，乳化PCR的 模板只有一個(gè)DNA分子。實(shí)施例實(shí)施例1 一種檢測胚胎染色體拷貝數(shù)的方法步驟1 取母體血液，制備血漿在本實(shí)施例中，總共抽取了 5個(gè)母體血液樣品，血液樣品經(jīng)高速離心后得到除去 了血細(xì)胞的血漿樣品，每個(gè)樣品的血漿量大約為1ml，樣品的代號為G367、G374、G379、 G435和G440。上述樣品均由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院的鄔玲仟教授采集得到。步驟2:提取血漿DNA可以使用Qiagen公司生產(chǎn)的DNA抽提試劑盒來提取血漿中的DNA(產(chǎn)品號為 57704)。 步驟3 將血漿DNA制成可供雙端測序的文庫將提取的DNA末端補(bǔ)平并進(jìn)行5，端磷酸化將DNA30 μ 1、純水45 μ 1、具有IOmM ATP 的 T4DNA 連接酶緩沖液 10 μ IUOmM dNTP Mix 4 μ 1、T4DNA 聚合酶 5 μ 1、Klenow 酶1μ1、Τ4ΡΝΚ 5μ 1混合后，在20°C溫浴30分鐘(試劑為Illumina樣本準(zhǔn)備試劑盒 PE-102-1001提供)。溫浴后采用QIAGEN QIAquick PCR純化試劑盒(part把8104)純化 DNA。末端懸A 將上步的產(chǎn)物溶解在32 μ 1緩沖液中，加入Klenow緩沖液5 μ l、lmM dATP 10 μ 1、Klenow Εχο_3 μ 1，在37°C保持30分鐘(試劑為Illumina樣本準(zhǔn)備試劑盒 PE-102-1001 提供)，產(chǎn)物由 QIAGEN MinElute PCR 純化試劑盒(part把8004)連接DNA溶解在10 μ 1緩沖液中，加入DNA連接酶緩沖液h 25 μ 1、PE Adapter Oligo MixlOy 1，DNA連接酶5 μ 1，在20°C保持15分鐘(試劑為Illumina樣本準(zhǔn)備試劑 盒PE-102-1001提供)。溫浴后采用QIAGEN QIAquick PCR純化試劑盒(part把8104)純化 DNA。圖1是每個(gè)樣品的DNA被制作成可供雙端測序的文庫，將該文庫中的DNA用 的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，圖1是凝膠電泳的圖像，最明顯的條帶在^Obp左右，由于包含了 120bp的連接引物，因此母體血漿DNA主要片段集中在160bp左右。優(yōu)選地，還可以對可供雙端測序的文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增1μ 1 DNA、22yl純水、 1 μ IPE PCR 引物 PE 2. OU μ 1 PE PCR 引物 PE 1. 0、2x Phusion DNA 聚合酶(Finnzymes 0y)(試劑為Illumina樣本準(zhǔn)備試劑盒PE-102-1001提供)。通過PCR儀器擴(kuò)增DNA，程序 為98 °C 30秒；98°C 40秒，65°C 30秒，72°C 30秒，共進(jìn)行12個(gè)循環(huán)；72°C 5分鐘。步驟4 對所述DNA雙端測序文庫的雙端短序列進(jìn)行測序用I Ilumina的cBot儀器將DNA雙端測序文庫中單一的DNA分子制成DNA簇，這一 步也可由乳化PCR將單一 DNA分子變成珠子上的多分子。將上面生成的DNA簇或乳化PCR得到的DNA珠在Illumina的Genome Analyzer或HKeq2000測序儀進(jìn)行雙端測序。此過 程均由儀器本身自動(dòng)完成。可替換地，也可將上面生成的DNA簇或乳化PCR得到的DNA珠在11 Iumina的 GenomeAnalyzer或Hikq2000測序儀進(jìn)行單端長序列的測序。在Illumina的Genome Analyzer和HiSeq2000測序儀上的測序步驟和反應(yīng)條件與以上描述的一樣。步驟5 確定血漿中的DNA片段來自幾號染色體，并確定待測染色體的拷貝數(shù)是否 正常在進(jìn)行了 DNA文庫的雙端測序后(可替換地，也可以是測定單端長序列)，當(dāng)已 知了一個(gè)DNA片段兩端各36bp的堿基序列后，可以將這兩端的序列與人類基因組標(biāo)準(zhǔn)序 歹丨J 37. 1 (http //www, ncbi. nlm. nih. gov/pro iects/genome/assembly/grc/human/data/ ？ build = 37)，該數(shù)據(jù)庫也稱hgl9比對，確定了這兩端的序列分別在染色體上的位置，該兩 端序列之間的距離就是該DNA片段的長度，同時(shí)該兩端序列所在的染色體位置即確定了該 DNA片段來自幾號染色體。圖2是根據(jù)上述的方法確定得到的樣品G367的DNA片段大小的分布圖，從圖中可 以看出，母體血漿的短DNA主要集中在IOObp到220bp之間。圖3是將比對后樣品G367中確定來自X染色體的DNA片段根據(jù)片段大小所做的 分布圖。所得到的圖形與圖2幾乎一致。步驟6 取DNA的序列長度在100bp_250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的所 有DNA的比對結(jié)果，計(jì)算并確定待測染色體的拷貝數(shù)在本實(shí)施例中我們?nèi)×碎L度在150bp到區(qū)間的DNA片段的比對結(jié)果，將7 號和14號染色體作為參考染色體，X、Y和21號染色體作為待測染色體。表1中列出了在 150bp到區(qū)間，來自7、14、X、Y和21號染色體的DNA片段占該區(qū)間的總DNA片段的 百分?jǐn)?shù)樣品 chr7 chrl4 chr21 chrXchrYG367_46xx 0.010527261 5. 440913867 3. 168290974 1. 3591621044. 011180933G374_46xx 0. 012214554 5. 451782745 3. 164119016 1. 3536778943. 962889744G379_46xx 0.009586766 5. 445655908 3. 170272522 1. 3522686254. 037545306G452_47xy 0.060654459 T21 5. 371282594 3. 174026866 1. 5010533123. 490446542G440_45x 0.0101686 5. 467367816 3. 189015757 1. 3566645683.679299238根據(jù)比對的結(jié)果，得知G367的X染色體的序列數(shù)占總序列數(shù)的4. 0112%，可以驗(yàn) 證本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)的是將圖2的縱坐標(biāo)乘以4. 0112%得到了與圖3非常吻合的圖形，具體 參見圖4，圖中帶星號的線表示G367樣品的總DNA序列數(shù)乘以X染色體的百分比后得到的 圖形，圓圈代表實(shí)際檢測到的X染色體的序列數(shù)。在表2中列出了 5個(gè)樣品中來自X和Y染色體的DNA片段數(shù)占150bp到區(qū)間的總DNA片段數(shù)的百分?jǐn)?shù)與來自7號和14號染色體的DNA片段數(shù)占150bp到區(qū) 間的總DNA片段數(shù)的百分?jǐn)?shù)的比值，也列出了這些比值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。根據(jù)平均值 和標(biāo)準(zhǔn)誤差，得到Z數(shù)值Z=(樣品比值-平均值)/標(biāo)準(zhǔn)誤差。在該實(shí)施例中，根據(jù)Z數(shù) 值可以判斷胚胎中X和21號染色體的個(gè)數(shù)以及Y染色體是否存在，在此聲明，本發(fā)明不用 于非醫(yī)學(xué)需要的胎兒性別鑒定或者性別選擇性的人工終止妊娠的性別鑒定。
權(quán)利要求
1.一種檢測胚胎染色體拷貝數(shù)的試劑盒，包括 從母體取血液的器械；適合將所述血液中的血細(xì)胞和血漿分離的器械； 抽提所述血漿中的DNA的試劑和器械；通過物理方法根據(jù)所述DNA的片段大小對其進(jìn)行分離的試劑和器械；和 取100bp-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的所有DNA進(jìn)行測序的試劑和器械。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述物理方法是瓊脂糖凝膠電泳的方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，還包括將所述DNA制成供雙端測序的文庫的試劑 和器械。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的試劑盒，還包括對所述從血漿中抽提的DNA或所述供 雙端測序的文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增的試劑和器械。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述100-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū) 間的 DNA 是 150bp-170bp 的 DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其中所述100-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū) 間的 DNA 是 150bp-170bp 的 DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其中所述100-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一 個(gè)區(qū)間的DNA是167bp的DNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中所述雙端測序?qū)λ鯠NA兩端各小于50bp的雙 端短序列進(jìn)行測試。
9.一種檢測胚胎染色體拷貝數(shù)的試劑盒，包括 從母體取血液的器械；適合將所述血液中的血細(xì)胞和血漿分離的器械； 抽提所述血漿中的DNA的試劑和器械； 將所述DNA制成可供雙端測序的文庫的試劑和器械；和 對所述DNA進(jìn)行雙端短序列測序的試劑和器械。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中所述雙端短序列是所述DNA兩端各小于50bp 的核苷酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的試劑盒，還包括對所述從血漿中抽提的DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增的試劑和器械。
12.—種檢測胚胎染色體拷貝數(shù)的裝置，包括檢測模塊，用于對母體血漿樣本中的DNA進(jìn)行測序；比對模塊，用于將所述DNA的測序結(jié)果與染色體組序列圖譜進(jìn)行比對，以確定所述DNA 中的每段DNA來自幾號染色體以及所述每段DNA的序列長度；計(jì)算模塊，用于計(jì)算在同一樣本內(nèi)所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一 個(gè)區(qū)間的所有DNA中來自待測染色體與來自參考染色體的DNA片段數(shù)的比值，并計(jì)算各個(gè) 樣本間所述比值的變異，根據(jù)所述變異的數(shù)值確定待測染色體的拷貝數(shù)；以及 輸出模塊，用于輸出所述待測染色體的拷貝數(shù)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其中對所述母體血漿樣本中DNA進(jìn)行測序僅包括對 所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的DNA進(jìn)行測序，通過物理方法可以分離出100bp-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的DNA。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的裝置，其中所述母體血漿樣本中DNA在檢測前被制作 成可供雙端測序的文庫。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的裝置，其中所述雙端測序?qū)λ鯠NA兩端各小于50bp的雙 端短序列進(jìn)行測試。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的裝置，其中對所述DNA的所述雙端短序列進(jìn)行測試后，通過 將所測得的DNA的雙端短序列與染色體組序列圖譜進(jìn)行比對能夠確定每段所述DNA的長度 以及每段所述DNA來自幾號染色體。
17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其中所述母體血漿樣本中DNA在檢測前進(jìn)行了PCR 的擴(kuò)增。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的裝置，其中所述母體血漿樣本中DNA在被制作成可供雙端 測序的文庫之前或之后進(jìn)行了 PCR的擴(kuò)增。
19.根據(jù)權(quán)利要求13或15所述的裝置，其中所述100-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一 個(gè)區(qū)間的DNA是150bp-170bp的DNA。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的裝置，其中所述100-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū) 間是DNA是167bp的DNA。
21.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其中所述參考染色體是2號、7號、12號、14號染色 體或它們的任意組合。
22.根據(jù)權(quán)利要求12或21所述的裝置，其中所述待測染色體是13號、18號、21號、X、 Y染色體或它們的任意組合。
23.一種檢測胚胎染色體拷貝數(shù)的方法，包括以下步驟取母體血液；將所述血液中的血漿和血細(xì)胞分離；通過物理方法將所述血漿中的DNA根據(jù)所述DNA的片段大小對其進(jìn)行分離；對所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的DNA進(jìn)行測序；將所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的所有DNA的測序結(jié)果與 染色體組序列圖譜進(jìn)行比對，以確定所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè) 區(qū)間的所有DNA中的每段DNA來自幾號染色體以及所述每段DNA的序列長度；以及計(jì)算在同一樣本內(nèi)所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的所有 DNA中來自待測染色體與來自參考染色體的DNA片段數(shù)的比值，并計(jì)算各個(gè)樣本間所述比 值的變異，根據(jù)所述變異的數(shù)值確定待測染色體的拷貝數(shù)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述物理方法是是瓊脂糖凝膠電泳的方法。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，還包括在通過物理方法分離所述DNA大小之前或之 后將DNA制成可供雙端測序的文庫，其中對所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點(diǎn)或任 意一個(gè)區(qū)間的DNA進(jìn)行測序采用的是雙端測序的方法。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述100-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū) 間的 DNA 是 150bp-170bp 的 DNA。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述100-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū) 間的DNA是167bp的DNA。
28.根據(jù)權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述雙端測序?qū)λ鯠NA兩端各小 于50bp的雙端短序列進(jìn)行測試。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的方法，還包括將所述DNA的所述雙端短序列的測試結(jié)果與 染色體組序列圖譜進(jìn)行比對以確定每段所述DNA的長度的步驟。
30.根據(jù)權(quán)利要求M46或28中任一項(xiàng)所述的方法，還包括在通過所述物理方法分離 所述DNA之前或所述測序之前對所述DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟。
31.一種檢測胚胎染色體拷貝數(shù)的方法，包括以下步驟取母體血液；將所述血液中的血漿和血細(xì)胞分離；對所述血漿中的DNA制作成可供雙端測序的文庫；對所述DNA雙端測序文庫的雙端短序列進(jìn)行測序；將所述測序的結(jié)果與染色體組序列圖譜進(jìn)行比對，確定每段所述DNA序列來自幾號染 色體以及每段所述DNA序列的長度；以及取所述DNA的序列長度在100bp-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的所有DNA的 測序和比對結(jié)果，計(jì)算在同一樣本內(nèi)所述DNA中100bp-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè) 區(qū)間的所有DNA中來自待測染色體與來自參考染色體的DNA片段數(shù)的比值，并計(jì)算各個(gè)樣 本間所述比值的變異，根據(jù)所述變異的數(shù)值確定待測染色體的拷貝數(shù)。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述100-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū) 間的 DNA 是 150bp-170bp 的 DNA。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述100-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū) 間的DNA是167bp的DNA。
34.根據(jù)權(quán)利要求32或33所述的方法，其中所述雙端測序?qū)λ鯠NA兩端各小于50bp 的雙端短序列進(jìn)行測試。
35.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中通過測試所述血漿中的DNA的單端長序列以代 替雙端測序。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測胚胎染色體拷貝數(shù)的試劑盒、裝置和方法，使用本發(fā)明的試劑盒、裝置和方法能夠相對無創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)地檢測胚胎染色體的拷貝數(shù)。本發(fā)明主要基于發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在母體血漿中的胚胎DNA大部分為100bp到250bp的片段，且各個(gè)染色體占總DNA的比例與各個(gè)染色體占母體血漿中100bp-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的DNA的比例是一致的。因此本發(fā)明的方法僅需要測定100bp到250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的DNA中的每段DNA來自幾號染色體，并計(jì)算在同一樣本內(nèi)100bp-250bp之間的任意一點(diǎn)或任意一個(gè)區(qū)間的所有DNA中來自待測染色體與來自參考染色體的DNA片段數(shù)的比值，并計(jì)算各個(gè)樣本間所述比值的變異，根據(jù)所述變異的數(shù)值確定待測染色體的拷貝數(shù)。
文檔編號C12Q1/68GK102108406SQ20101059523
公開日2011年6月29日 申請日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月20日
發(fā)明者周代星, 張建光, 王珺, 田鳳, 高揚(yáng) 申請人:北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司