專利名稱：一種長(zhǎng)pcr步移試劑盒及其使用方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及已知DNA片段側(cè)翼未知序列的克隆領(lǐng)域，具體涉及一種長(zhǎng)PCR步移試 劑盒及其使用方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
對(duì)于遺傳及分子生物學(xué)相關(guān)研究而言，獲取已知DNA序列側(cè)翼未知序列是一項(xiàng)經(jīng) 常面臨的重要任務(wù)。比如在植物功能基因組學(xué)中分析T-DNA插入位點(diǎn)；了解細(xì)菌轉(zhuǎn)座子 插入位點(diǎn)及攜帶的外源基因；根據(jù)已知的部分基因片段獲取全長(zhǎng)的基因；功能基因啟動(dòng)子 分析等。傳統(tǒng)的獲取已知DNA序列側(cè)翼未知序列的方法是構(gòu)建文庫，然后對(duì)文庫進(jìn)行大量 篩選。這種方法不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高，而且最終的結(jié)果依賴于構(gòu)建文庫的質(zhì)量。因此，基 于PCR技術(shù)的基因組步移(PCR步移)成為人們感興趣的目標(biāo)。目前已經(jīng)被使用的方法包 括反向PCR、接頭PCR、熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(Tail-PCR)。盡管這些方法在各自領(lǐng)域都有比較 廣泛的使用，但是這些方法在實(shí)際應(yīng)用中都具有各自的缺陷。在PCR操作前，反向PCR、接頭 PCR需先對(duì)基因組進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行連接(分子內(nèi)成環(huán)或酶切片段與接頭引物連接)，兩 種方法對(duì)提取基因組的質(zhì)量要求很高。由于側(cè)翼序列的未知性通常需要對(duì)多個(gè)內(nèi)切酶進(jìn)行 篩選，因此具有盲目性；分子內(nèi)成環(huán)以及接頭連接效率也是構(gòu)建能用于下一步PCR步移模 板的制約因素。因此實(shí)際操作中，一個(gè)設(shè)計(jì)合理的實(shí)驗(yàn)方案，往往并不能得到預(yù)期的結(jié)果， 反而增加了操作時(shí)間和耗費(fèi)。源于半隨機(jī)引物PCR方法的Tail-PCR是目前在植物基因組應(yīng) 用非常廣泛的擴(kuò)增未知側(cè)翼片段的方法。但是Tail-PCR設(shè)置程序復(fù)雜，為了得到持續(xù)穩(wěn)定 且正確的PCR產(chǎn)物，需要對(duì)程序條件進(jìn)行反復(fù)設(shè)置。此外采用有簡(jiǎn)并堿基末端的引物以及 Tail-PCR設(shè)置程序本身固有的限制，都致使這種方法不能獲得長(zhǎng)的側(cè)翼未知片段并且產(chǎn)物 具有較多的假陽性。總概上述方法，均存在操作繁瑣、非特異性片段較多、一次步移片段短 (小于1.5Kb)的缺陷。這些缺陷均限制了其更為廣泛的應(yīng)用，盡管獲取側(cè)翼未知序列是經(jīng) 常面臨的工作。因此十分有必要探索新的簡(jiǎn)單、快速、高效PCR步移方法，并開發(fā)成商業(yè)化 的試劑盒，廣泛應(yīng)用于各類分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種簡(jiǎn)單、快速、高效的長(zhǎng)PCR步移試劑盒。本發(fā)明另一目的在于提供上述長(zhǎng)PCR步移試劑盒的使用方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于闡明上述長(zhǎng)PCR步移試劑盒的應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)一種長(zhǎng)PCR步移試劑盒，包括(1)試劑A 其中，每9. 25 12. 5μ L試劑A中包含 IOmmol/L 的 dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP) 1 3 μ L，25mmol/LMgCl23 4 μ L，10 X PCR 緩沖液 5 μ L 及 LA Taq 酶 0· 25 0· 5 μ L ； (2)試劑 B ddH205 20mL ； (3)試劑 C 瓊脂糖 5 20g ； (4)試 劑D :6XPCR上樣緩沖液1 5mL ； (5)試劑E 核酸染料20 100 μ L ； (6)試劑F :50Χ電泳緩沖液l(T20mL ； (7)引物11條，序列如SEQ ID NO:廣11所示，每條各10^50 μ L0上述6 XPCR上樣緩沖液的成分為EDTA2(T30mmOl/L，甘油30 40體積％，二甲苯青 0. 0004 0. 0008g/ml 和溴酚藍(lán) 0. 0004 0. 0006g/ml。上述50X電泳緩沖液中，每IL 50 X電泳緩沖液中含三羥甲基氨基甲烷242g， EDTA37. 2g，醋酸 57. lmL。本發(fā)明長(zhǎng)步移試劑盒的使用方法由兩輪PCR及后續(xù)的測(cè)序組成，具體步驟如下
(1) DNA提取，提取方法為常規(guī)方法，對(duì)基因組的完整性和純度沒有嚴(yán)格要求，對(duì)基 因組的物種來源沒有限制；(2)第一輪長(zhǎng)PCR步移根據(jù)已知的DNA序列設(shè)計(jì)與其互補(bǔ)的上游引物P，長(zhǎng) 18 22bp，濃度為Γ2 μ mol/L,當(dāng)反應(yīng)體系為25 μ L時(shí)，加入試劑Α4. 2 6. 25 μ L，上游引物 Ρ0. 5 1. 0 μ L，DNA模板0. 5 2. OyL,余量為試劑B ；(3)第一輪長(zhǎng)PCR步移擴(kuò)增程序92 94°C預(yù)變性2 5min，92 94°C變性15 30s， 56 60°C退火3(T60s，68 72°C延伸3 lOmin，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，將反應(yīng)體系降溫到 4 12°C，維持5 30min，在維持期間，迅速加入引物各0. 5 1. 0 μ L，引物序列如SEQ ID NO Γ10所示；加入引物后再進(jìn)行一個(gè)循環(huán)，該循環(huán)程序?yàn)?(T86°C變性15、08，36 431變性 廣3min，68 72°C延伸3 lOmin，68 72°C延伸5 8min ；所得PCR產(chǎn)物取1 μ L，加入試劑B，稀 釋10 30倍，作為第二輪長(zhǎng)PCR的DNA模板；(4)第二輪長(zhǎng)PCR步移根據(jù)已知的DNA序列設(shè)計(jì)與其互補(bǔ)的上游引Q，長(zhǎng) 26 29bp，濃度為10 20 μ mol/L,當(dāng)反應(yīng)體系為25 μ L時(shí)，加入試劑Α4. 2 6. 25 μ L，上游引物 Q0. 5 1.0 μ L，序列如SEQ ID NO :11所示的引物0. 5 1. 0 μ L，步驟(3)稀釋得到的DNA模 板0. 5 2 μ L，余量為試劑B ；PCR反應(yīng)對(duì)照組中，加入試劑Α4. 2 6. 25 μ L，序列如SEQ ID NO 11所示的引物0. 5^1. 0 μ L，步驟(3)稀釋得到的DNA模板0. 5^2 μ L，余量為試劑B ；(5)第二輪長(zhǎng)PCR步移擴(kuò)增程序92 94°C預(yù)變性2 5min，92 94°C變性15 30s， 68°C變性并延伸3 lOmin，共30個(gè)循環(huán)，最后68°C延伸5 8min ；(6) PCR步移產(chǎn)物檢測(cè)取第二輪長(zhǎng)PCR步移產(chǎn)物及對(duì)照組PCR產(chǎn)物各3飛μ L，加 入0. 5^1 μ L試劑D混合，上樣瓊脂糖凝膠，將試劑F用去離子水稀釋50倍用作電泳緩沖液， 電壓10(T140V，電泳2(T40min ；電泳結(jié)束后紫外成像，膠樣中，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)而對(duì)照組中不出 現(xiàn)的條帶即為陽性的PCR步移片段。其中，步驟(6)中，每IOOmL瓊脂糖凝膠含有試劑ΕΓ5 yL ；所述陽性PCR步移片 段用于下游PCR產(chǎn)物測(cè)序或克隆測(cè)序。上述長(zhǎng)步移試劑盒的原理如圖1所示，在第一輪PCR中，上游引物P長(zhǎng)2(Γ22堿 基，與已知序列特異互補(bǔ)，下游復(fù)合引物(如SEQ ID Ν0:廣10所示)長(zhǎng)39 40堿基，其5， 端包含29個(gè)固定堿基，3’端包含6 7個(gè)隨機(jī)設(shè)計(jì)的堿基(GC ^50%)，中間區(qū)域?yàn)?個(gè)完 全簡(jiǎn)并的堿基(NNNN)。3’端及中部區(qū)域形成一個(gè)實(shí)際的退火位點(diǎn)，其退火溫度相對(duì)較低 (38^430C )。引物P首先被加入反應(yīng)體系，在較高的退火溫度下(56飛4°C )進(jìn)行線性特異 性擴(kuò)增。然后下游復(fù)合引物(如SEQ ID N0:廣10所示)加入快速冷卻的反應(yīng)系統(tǒng)，只進(jìn)行 一個(gè)較低退火溫度的循環(huán)。在這個(gè)循環(huán)中，變性溫度改為8(T86°C。在這種變性溫度下，原 始的模板DNA部分解鏈，從而減少下游復(fù)合引物與原始模板結(jié)合的機(jī)會(huì)，而增加其與新合 成的單鏈DNA結(jié)合引發(fā)延伸的機(jī)會(huì)。同時(shí)，下游復(fù)合引物濃度遠(yuǎn)大于引物P，因此在最后一輪PCR中，下游復(fù)合引物有更多的機(jī)會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合模板，在唯一的一輪低嚴(yán)謹(jǐn)退火溫度循環(huán)中，有效減少引物P與模板的非特異性結(jié)合。第一輪PCR最后一個(gè)循環(huán)實(shí)際起到將前面線 性擴(kuò)增產(chǎn)生的單鏈DNA互補(bǔ)成雙鏈DNA的作用。第一輪PCR產(chǎn)物經(jīng)純化并適當(dāng)稀釋后，用作第二輪PCR的模板。第二輪PCR上游 弓丨物Q與已知序列特異互補(bǔ)，位于引物P內(nèi)側(cè)；下游引物(如SEQ IDN0:11所示)與下游 復(fù)合引物(如SEQ ID NO:廣10所示)的5，端完全相同。二條引物同時(shí)加入反應(yīng)體系，進(jìn) 行常規(guī)的長(zhǎng)距離PCR即可。在第二輪PCR中，采用高嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饻囟?68°C，遠(yuǎn)高于第一輪 PCR退火溫度)，第一輪反應(yīng)中可能剩余的少量下游復(fù)合引物和P，不會(huì)產(chǎn)生干擾作用，因此 第一輪PCR產(chǎn)物不需要單獨(dú)純化去除引物。第二輪長(zhǎng)PCR步移結(jié)束后，切膠回收陽性片段， 用于直接測(cè)序或克隆測(cè)序，即可獲得已知DNA序列側(cè)翼長(zhǎng)片段未知序列。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明長(zhǎng)PCR步移試劑盒具有如下有益效果(1)本發(fā)明長(zhǎng)PCR步移試劑盒簡(jiǎn)單、快捷。本發(fā)明對(duì)基因組的質(zhì)量沒有嚴(yán)格要求， 既可以采用試劑盒或傳統(tǒng)的酚/氯仿提取方法，又可以使用最簡(jiǎn)單的水煮法；本發(fā)明無需 建庫，也無需耗時(shí)較長(zhǎng)的酶切、連接和固定步驟即可直接進(jìn)行PCR反應(yīng)；(2)本發(fā)明長(zhǎng)PCR步移試劑盒高效、可靠。本發(fā)明只需兩次長(zhǎng)PCR過程即可特異性 地將所需的長(zhǎng)翼片段擴(kuò)增出來，且非特異性片段少，較之傳統(tǒng)操作繁瑣、非特異性片段多、 產(chǎn)物片段短的方法明顯高效；(3)本發(fā)明長(zhǎng)PCR步移試劑盒的成本大大降低。本試劑盒及使用方法不需要精提 模板DNA，也不需要酶切篩選、連接或?qū)Φ谝惠哖CR產(chǎn)物進(jìn)行純化，摒除了常用方法中需要 多種酶切的尋找合適內(nèi)切酶的過程，因此在實(shí)際操作中，實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)大大降低；(4)本發(fā)明長(zhǎng)PCR步移試劑盒的應(yīng)用前景廣闊。由于本發(fā)明采用引物3’端堿基 隨機(jī)配置，因此沒有使用物種范圍的限制，微生物、動(dòng)物、植物均可使用。常規(guī)方法擴(kuò)增片段 短，在實(shí)際應(yīng)用中一次步移達(dá)不到需要了解的序列長(zhǎng)度范圍，本發(fā)明一次就可以獲得長(zhǎng)的 片段(大于3Kb)，減少了步移操作，用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中可以加快科研速度；用于商業(yè) 化生產(chǎn)中，可以提高生產(chǎn)效率，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。


圖1是本發(fā)明長(zhǎng)PCR步移試劑盒的原理圖；圖2是實(shí)施例1中的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖，其中，A是引物1 (SEQ ID NO 1)參與 擴(kuò)增產(chǎn)生的條帶，B是引物5 (SEQ ID NO 5)參與擴(kuò)增產(chǎn)生的條帶；圖3是實(shí)施例2中的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖，其中，A、B和C是引物10 (SEQID NO: 10)參與擴(kuò)增產(chǎn)生的三條陽性條帶。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例1長(zhǎng)PCR步移用于擴(kuò)增獲得溶藻弧菌E0601類霍亂弧菌轉(zhuǎn)座子valT側(cè)翼未知DNA 序列。按以下配方配制試劑。
試劑盒組成1)試劑 A 為反應(yīng)預(yù)混體系 500 μ L。每 10. 5 μ L 包含 1 μ L dNTP (dATP、dTTP、dGTP、 dCTP 各 10mmol/L)，4 μ L MgCl2 (25mmol/L)，5 μ L IOXPCR buffer, 0. 5 μ LLA Taq 酶；2)試劑 B 為 IOmL ddH20 ；3)試劑C:為瓊脂糖，6g;4)試劑D :6XPCR產(chǎn)物上樣緩沖液lmL，其成份為30mmol/L EDTA,36% (V/V)甘 油、0.05% (ff/V) 二甲苯青、0.05% (W/V)溴酚藍(lán)。5)試劑 E 為 Goldview 核酸染料，40 μ L ；6)試劑F 為50 X TAE緩沖液10mL，每IL含三羥甲基氨基甲烷242g、ETDA37. 2g、 醋酸 57. lmL。7)引物系列，濃度ΙΟμ θΙ/L，各10 μ L0序列如SEQ ID NO :1 10所示；8)引物一條，10 μ L，濃度 10 μ mol/L，其序列如 SEQ ID N0:11 所示。按以下程序進(jìn)行操作(1)根據(jù)已知的溶藻弧菌E0601類霍亂弧菌轉(zhuǎn)座子valT部分序列，設(shè)計(jì)特異性引 物VapFl及VapF2，配制濃度分別為1 μ mol/L、10 μ mol/L。其序列如下VapFl :GTTCTATCCGACCATAGATG(SEQ ID NO 12)；VapF2 TGGGCTAACCTCGGATAGACAGGATTACT(SEQ ID NO 13)；(2)模板DNA提取最簡(jiǎn)單的水煮法進(jìn)行。取過夜培養(yǎng)溶藻弧菌E06011mL，5000g 離心5min取沉淀，加入100 μ L ddH20，100°C水浴lOmin，IOOOOg離心5min，取上清即為模 板 DNA ；(3)取10個(gè)PCR反應(yīng)管，分別加入試劑A 4. 75 μ L、0. 5 μ L引物VapFl、上述稀釋 之DNA模板各1 μ L、18. 75 μ L試劑B，混勻；(4)第一輪長(zhǎng)PCR步移反應(yīng)條件92°C預(yù)變性2min，92°C變性15s，58°C退火30s， 68°C延伸5min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；然后反應(yīng)體系降溫到4 12°C維持lOmin，在低溫維持期 間，迅速在PCR反應(yīng)管中各加入引物系列(SEQ IDNO 廣10)各0.5 μ L。引物加入后，跳過低 溫維持步驟。再進(jìn)行一個(gè)循環(huán)，該循環(huán)包括84°C變性30s，4(TC變性2min，68°C延伸5min。 最后68°C延伸8min ；取上述PCR產(chǎn)物各1 μ L，加入試劑B 10 μ L，成稀釋模板；(5)取10個(gè)PCR反應(yīng)管，分別加入引物VapF2、引物(SEQ ID NO :11) 0. 5 μ L、上述 稀釋模板1 μ L、試劑A 4. 75 μ L、試劑B 18. 25 μ L0另取10個(gè)PCR反應(yīng)管，加入引物(SEQ ID NO 11)1 μ L、上述稀釋模板1 μ L、試劑A 4. 75 μ L、試劑B 18. 25 μ L，分別用作上述各實(shí) 驗(yàn)管的對(duì)照管；(6)第二輪長(zhǎng)PCR步移程序92°C預(yù)變性2min，92°C變性15s，68°C變性并延伸 5min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后68°C延伸8min ；(7)取第二輪長(zhǎng)PCR步移產(chǎn)物及對(duì)照管PCR產(chǎn)物各5 μ L與1 μ L試劑D混合，上 樣0.7%瓊脂糖凝膠(每IOOmL凝膠含試劑E 2 μ L)。將試劑F用去離子水稀釋50倍，用 作電泳緩沖液。電壓120V，電泳30min ；(8)電泳結(jié)束后，紫外成像。膠樣中，凡實(shí)驗(yàn)管中PCR產(chǎn)物出現(xiàn)而相應(yīng)對(duì)照管PCR產(chǎn)物不出現(xiàn)的條帶即為陽性的PCR步移片段。在本實(shí)例的10條引物系列中，引物1 (SEQ ID NO 1)和5(SEQ ID NO 5)分別產(chǎn)生了長(zhǎng)度約2. OKb,4. OKb的陽性片段，而對(duì)照均沒有條帶產(chǎn)生(見附圖2，A、B 二個(gè)條帶。只顯示引物廣6所產(chǎn)生的結(jié)果)。將使用引物5所產(chǎn)生第 二輪PCR步移產(chǎn)物(長(zhǎng)約4. OKb)克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果證明其為已知序列部分正確的延伸， 第二輪長(zhǎng)PCR步移獲得了長(zhǎng)達(dá)3820bp的片段(序列見Genbank數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)EU787499)， 引物5及VapF2均正確地參入到PCR產(chǎn)應(yīng)中。該結(jié)果證實(shí)了方法的可靠性和有效性。實(shí)施例2根據(jù)部分創(chuàng)傷弧菌1. 1758rpoB基因部分序列，采用長(zhǎng)PCR步移擴(kuò)增rpoB近全長(zhǎng) 基因。按以下配方配制試劑1)試劑 A 反應(yīng)預(yù)混體系 300 μ L0 每 11. 4 μ L 試劑 A 包含 2 μ L dNTP (dATP、dTTP、 dGTP、dCTP 各 10mmol/L)，4μ L MgCl2 (25mmol/L)，5 μ L 10XPCR buffer，?！?4μ L LATaq 酶；2)試劑 B 為 20mL ddH20 ；3)試劑C:為瓊脂糖，IOg ；4)試劑D :6XPCR產(chǎn)物上樣緩沖液lmL，其成份為25mmol/L EDTA,30% (Υ/Υ)甘 油、0.06% (ff/V) 二甲苯青、0.04% (W/V)溴酚藍(lán)；5)試劑 E 為 Goldview 核酸染料，30 μ L ；6)試劑F 為50XTAE緩沖液30mL，每lL含三羥甲基氨基甲烷242g、ETDA 37. 2g、 醋酸 57. ImL ；7)引物系列，濃度15ymol/L，各10μ L。序列如SEQ ID NO:廣10所示；8)引物一條，15 μ L，濃度15 μ M，其序列如SEQ ID Ν0:11所示。按以下程序進(jìn)行操作(1)根據(jù)已知的創(chuàng)傷弧菌1. 1758rpoB基因部分序列，設(shè)計(jì)特異性引物rpoFl及 rpoF2,配制濃度分別為2 μ mol/L、15 μ mol/L。其序列如下rpoFl :TGGTTTACTCTTATACCGAG(SEQ ID NO 14)；rpoF2 TATACCGAGAAAAAGCGCATCCGTAAGGA(SEQ ID NO 15)；(2)模板DNA提取最簡(jiǎn)單的水煮法進(jìn)行。取過夜培養(yǎng)創(chuàng)傷弧菌1. 17581mL,6000g 離心3min取沉淀，加入80 μ L ddH20,100°C水浴lOmin，IOOOOg離心4min，取上清即為模板 DNA ；(3)取10個(gè)PCR反應(yīng)管，分別加入試劑A 5. 7 μ L、0. 5 μ L引物rpoFl、上述DNA模 板各1 μ L、17. 8 μ L試劑B，混勻；(4)第一輪長(zhǎng)PCR步移反應(yīng)條件94°C預(yù)變性2min，94°C變性15s，60°C退火30s， 68°C延伸3min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；然后反應(yīng)體系降溫到12°C維持lOmin，在低溫維持期間， 迅速在PCR反應(yīng)管中各加入引物系列(SEQ IDNO 廣10)各0.5 μ L。引物加入后，跳過低溫 維持步驟。再進(jìn)行一個(gè)循環(huán)，該循環(huán)包括86°C變性30s，43°C變性2min，68°C延伸4min。最 后68 °C延伸8min ；(5)取上述PCR產(chǎn)物各1 μ L，加入試劑B 15 μ L,成稀釋模板；(6)取10個(gè)PCR反應(yīng)管，分別加入rpoF2、引物(SEQ ID NO 11)0. 5 μ L、上述稀釋 模板1 μ L、試劑A 5. 7 μ L、試劑B 17. 3yL。另取10個(gè)PCR反應(yīng)管，加入引物(SEQ ID NO: 11) 1 μ L、上述稀釋模板1 μ L、試劑A 5. 7 μ L、試劑B 17. 3 μ L，分別用作上述各實(shí)驗(yàn)管的對(duì)眧管.
/、、、Izzt 9(7)第二輪長(zhǎng)PCR步移程序92°C預(yù)變性3min，92°C變性20s，68°C變性并延伸3min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后68°C延伸8min ；(8)取第二輪長(zhǎng)PCR步移產(chǎn)物及對(duì)照管PCR產(chǎn)物各3μ L與0.5μ L試劑D混合，上 樣0.8%瓊脂糖凝膠(每IOOmL凝膠含試劑E 2 μ L)。將試劑F用去離子水稀釋50倍，用 作電泳緩沖液。電壓100V，電泳30min ；(9)電泳結(jié)束后，紫外成像。膠樣中，凡實(shí)驗(yàn)管中PCR產(chǎn)物出現(xiàn)而相應(yīng)對(duì)照管PCR 產(chǎn)物不出現(xiàn)的條帶即為陽性的PCR步移片段。在本實(shí)例的10條引物系列中，引物10(SEQ ID NO 10)產(chǎn)生了長(zhǎng)度約0. 9Kb,3. OKb和4. OKb的陽性片段，而對(duì)照及其它引物均沒有條 帶產(chǎn)生(見附圖3，A、B、C三個(gè)條帶，只顯示引物10所產(chǎn)生的結(jié)果)。將使用引物10所產(chǎn) 生第二輪PCR步移產(chǎn)物(分別長(zhǎng)約0. 9Kb,3. 0Kb,4. 0Kb)克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果證明三者均為 已知序列部分正確的延伸，引物10及VapF2均正確地參入到PCR產(chǎn)應(yīng)中，而引物10在本實(shí) 例PCR延伸范圍內(nèi)共有3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。該結(jié)果再一次證實(shí)了方法的可靠性和有效性。一種長(zhǎng)PCR步移試劑盒及其使用方法和應(yīng)用序列表SEQUENCE LISTING<110>中國科學(xué)院南海海洋研究所<120> 一種長(zhǎng)PCR步移試劑盒及其使用方法和應(yīng)用<130><160>15<170>PatentIn version 3. 2<210>1<211 >40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(30). . (33)<223>n is a, c, g, or t<400>1tagtcatgcc atgtcagttc tagcatctgn nnnctgctga 40<210>2<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(30). . (33)<223>n is a, c, g, or t<400>2tagtcatgcc atgtcagttc tagcatctgn nnngacgact 40<210>3<211>40
<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(30). . (33)<223>n is a, c, g, or t<400>3tagtcatgcc atgtcagttc tagcatctgn nnncagcagt 40<210>4<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(30). . (33)<223>n is a, c, g, or t<400>4tagtcatgcc atgtcagttc tagcatctgn nnngtcgtca 40<210>5<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(30). . (33)<223>n is a, c, g, or t<400>5tagtcatgcc atgtcagttc tagcatctgn nnngctctca 40<210>6<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(30). . (33)<223>n is a, c, g, or t<400>6tagtcatgcc atgtcagttc tagcatctgn nnnggatcca 40
<210>7
<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(30). . (33)<223>n is a，c, g, or t<400>7tagtcatgcc atgtcagttc tagcatctgn nnnggtacca 40<210>8<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(30). . (33)<223>n is a，c, g, or t<400>8tagtcatgcc atgtcagttc tagcatctgn nnngactcta 40<210>9<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(30). . (33)<223>n is a，c, g, or t<400>9tagtcatgcc atgtcagttc tagcatctgn nnnacgcgta 40<210>10<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(30). . (33)<223>n is a，c, g, or t<400>10tagtcatgcc atgtcagttc tagcatctgn nnngtgcaca 40
<210>11<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>11tagtcatgcc atgtcagttc tagcatctg29<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>12gttctatccg accatagatg20<210>13<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>13tgggctaacc tcggatagac aggattact29<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>14tggtttactc ttataccgag20<210>15<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>15tataccgaga aaaagcgcat ccgtaagga29.
權(quán)利要求
一種長(zhǎng)PCR步移試劑盒，其特征在于包括(1)試劑A其中，每9.25~12.5μL試劑A中包含10mmol/L的dNTP1~3μL，25mmol/LMgCl23~4μL，10×PCR緩沖液5μL及LA Taq酶0.25~0.5μL；(2)試劑BddH2O5~20mL；(3)試劑C瓊脂糖5~20g；(4)試劑D6×PCR上樣緩沖液1~5mL；(5)試劑E核酸染料20~100μL；(6)試劑F50×電泳緩沖液10~20mL；(7)引物11條，序列如SEQ ID NO1~11所示，每條各10~50μL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)PCR步移試劑盒，其特征在于所述6XPCR上樣緩沖液 的成分為EDTA2(T30mmol/L，甘油30 40體積％，二甲苯青0. 0004 0. 0008g/ml和溴酚藍(lán) 0.0004 0. 0006g/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)PCR步移試劑盒，其特征在于每IL50 X電泳緩沖液中含 三羥甲基氨基甲烷242g，EDTA37. 2g，醋酸57. lmL。
4.權(quán)利要求3所述的長(zhǎng)PCR步移試劑盒的使用方法，其特征在于所述方法包括如下步驟(1)DNA提取；(2)第一輪長(zhǎng)PCR步移根據(jù)已知的DNA序列設(shè)計(jì)與其互補(bǔ)的上游引物P，長(zhǎng) 18 22bp，濃度為Γ2 μ mol/L,當(dāng)反應(yīng)體系為25 μ L時(shí)，加入試劑Α4. 2 6. 25 μ L，上游引物 Ρ0. 5 1. 0 μ L，DNA模板0. 5 2. OyL,余量為試劑B ；(3)第一輪長(zhǎng)PCR步移擴(kuò)增程序:92 94V預(yù)變性2 5min，92 94 V變性15 30s， 56 60 °C退火3(T60s，68 72 V延伸3 lOmin，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，將反應(yīng)體系降溫到 4 12°C，維持5 30min，在維持期間，迅速加入引物各0. 5 1. 0 μ L，引物序列如SEQ ID NO 廣10所示；加入引物后再進(jìn)行一個(gè)循環(huán)，該循環(huán)程序?yàn)?(T86°C變性15、08，36 431變性 廣3min，68 72°C延伸3 lOmin，68 72°C延伸5 8min ；所得PCR產(chǎn)物取1 μ L，加入試劑B，稀 釋10 30倍，作為第二輪長(zhǎng)PCR的DNA模板；(4)第二輪長(zhǎng)PCR步移根據(jù)已知的DNA序列設(shè)計(jì)與其互補(bǔ)的上游引Q，長(zhǎng)26 29bp， 濃度為10 20 μ mol/L,當(dāng)反應(yīng)體系為25 μ L時(shí)，加入試劑Α4. 2 6. 25 μ L，上游引物 Q0. 5 1.0 μ L，序列如SEQ ID NO :11所示的引物0. 5 1. 0 μ L，步驟(3)稀釋得到的DNA模 板0. 5 2 μ L，余量為試劑B ；PCR反應(yīng)對(duì)照組中，加入試劑Α4. 2 6. 25 μ L，序列如SEQ ID NO 11所示的引物0. 5^1. 0 μ L，步驟(3)稀釋得到的DNA模板0. 5^2 μ L，余量為試劑B ；(5)第二輪長(zhǎng)PCR步移擴(kuò)增程序92 94°C預(yù)變性2 5min，92 94°C變性15 30s，68°C變 性并延伸3 lOmin，共30個(gè)循環(huán)，最后68°C延伸5 8min ；(6)PCR步移產(chǎn)物檢測(cè)取第二輪長(zhǎng)PCR步移產(chǎn)物及對(duì)照組PCR產(chǎn)物各3飛μL，加入 0. 5^1 μ L試劑D混合，上樣瓊脂糖凝膠，將試劑F用去離子水稀釋50倍用作電泳緩沖液，電 壓10(T140V，電泳2(T40min ；電泳結(jié)束后紫外成像，膠樣中，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)而對(duì)照組中不出現(xiàn) 的條帶即為陽性的PCR步移片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的長(zhǎng)PCR步移試劑盒的使用方法，其特征在于步驟(6)中，每 IOOmL瓊脂糖凝膠含有試劑Ε1 5 μ L。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的長(zhǎng)PCR步移試劑盒的使用方法，其特征在于步驟(6)中 所述陽性PCR步移片段用于下游PCR產(chǎn)物測(cè)序或克隆測(cè)序。
7.權(quán)利要求廣3中任意一條權(quán)利要求所述的長(zhǎng)PCR步移試劑盒的應(yīng)用，其特征在于所 述長(zhǎng)PCR步移試劑盒用于克隆已知DNA片段側(cè)翼的未知序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種長(zhǎng)PCR步移試劑盒及其使用方法和應(yīng)用。本發(fā)明長(zhǎng)PCR步移試劑盒包括(1)試劑A其中，每9.25~12.5μL試劑A中包含10mmol/L的dNTP1~3μL，25mmol/L MgCl23~4μL，10×PCR緩沖液5μL及LA Taq酶0.25~0.5μL；(2)試劑BddH2O5~20mL；(3)試劑C瓊脂糖5~20g；(4)試劑D6×PCR上樣緩沖液1~5mL；(5)試劑E核酸染料20~100μL；(6)試劑F50×電泳緩沖液10~20mL；(7)引物11條，序列如SEQ ID NO1~11所示，每條各10~50μL。本發(fā)明長(zhǎng)PCR步移試劑盒成本低，較之其它擴(kuò)增方法明顯簡(jiǎn)單、快速，效率高，一次即可獲得長(zhǎng)達(dá)3Kb以上的側(cè)翼片段，用于獲取DNA側(cè)翼未知序列沒有物種限制，可廣泛用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中。
文檔編號(hào)C12R1/63GK101812494SQ200910214350
公開日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2009年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日
發(fā)明者任春華, 羅鵬, 胡超群, 蘇婷 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院南海海洋研究所