專利名稱：一種高密度檢測拷貝數(shù)變異的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及用熒光通用引物、限制性內(nèi)切酶消化樣本和PCR法制備內(nèi)對(duì)照模板的多重競爭性PCR檢測拷貝數(shù)變異的方法，應(yīng)用于生物科學(xué)研究與臨床分子診斷。
背景技術(shù)：
拷貝數(shù)變異(copy number variations, CNVs)是近年來發(fā)現(xiàn)的基因組多樣性的新形式，它是指與參考序列相比，基因組中l(wèi)kb 3Mb的DNA片段的結(jié)構(gòu)變異現(xiàn)象。CNVs廣泛存于基因組中，與一些遺傳性疾病的發(fā)生相關(guān)，對(duì)人類抗病性和易感性表型等變異有重要影響。這就要求建立一種快速、準(zhǔn)確和低成本的CNVs分型檢測技術(shù)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，不同的研究小組相繼開發(fā)了許多的檢測方法，主要包括 以雜交為基礎(chǔ)和以PCR為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)。前者可以在全基因組水平上對(duì)CNVs進(jìn)行檢測，代表技術(shù)有微陣列比較基因雜交(SolinasToldo, Lampel et al Genes ChromosomesCancer. 1997Dec; 20 (4) : 399-407)、全基因組 SNP 芯片(Irving, Bloodworth et al. CancerRes. 2005Aprl5; 65 (8) :3053-8),代表性寡核昔酸微陣列技術(shù)(Lucito, Healy etal. Genome Res. 20030ct; 13 (10) : 2291-305. Epub 2003 Sep 15.)等，其優(yōu)點(diǎn)是通量高且易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，但是普遍存在分辨率低、成本高和周期長的缺點(diǎn)。后者主要是針對(duì)具體的目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行檢測，代表性的技術(shù)有實(shí)時(shí)熒光定量PCR、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)(Schouten, McElgunn et al. Nucleic Acids Res. 2002 Jun 15; 30 (12) : e57)和多重可擴(kuò)增探針雜交(MAPH) (Armour, Sismani et al. Nucleic Acids Res. 2000Jan 15; 28 (2) :605-9.)等。實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)有操作簡單、重復(fù)性好、實(shí)驗(yàn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，但是檢測通量較?。慌c實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比，MLPA和MAPH的檢測通量有了很大提高，不過PCR微環(huán)境的變化會(huì)導(dǎo)致不同位點(diǎn)不能完全同步擴(kuò)增，而且PCR的平臺(tái)效應(yīng)也會(huì)影響檢測結(jié)果。以PCR為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)存在一個(gè)共同的缺陷就是待測樣本和對(duì)照樣本是分開檢測的，這樣兩者PCR效率的差異會(huì)引起檢測結(jié)果的偏差。競爭性PCR克服了這個(gè)缺陷，實(shí)現(xiàn)CNVs的快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的檢測。在PCR擴(kuò)增過程中，PCR產(chǎn)物的量可以用公式Y(jié)=A (1+R) n來表示，其Y表示PCR產(chǎn)物的量，A表示初始模板的量，R表示PCR的擴(kuò)增效率，η表示PCR的循環(huán)數(shù)，當(dāng)PCR擴(kuò)增效率相同時(shí)，PCR產(chǎn)物的量與初始模板的量成正比。競爭性PCR利用了這一原理，在同一 PCR反應(yīng)體系中涉及兩組模板，一組是待測樣本，另一組是合成的一段核酸序列，用作內(nèi)對(duì)照，兩組模板僅在目標(biāo)序列長度上(存在一些堿基的插入或缺失)存在一些差異，其他反應(yīng)條件一致，因此兩者擴(kuò)增效率接近一致，兩種擴(kuò)增產(chǎn)物量的比直觀的反映了初始模板(待測樣本和內(nèi)對(duì)照不存在拷貝數(shù)差異)量的比，可以根據(jù)內(nèi)對(duì)照的初始模板的量來計(jì)算樣本的濃度。在檢測拷貝數(shù)變異時(shí)，當(dāng)兩模板具有相同的濃度或削除了濃度差異帶來的影響時(shí)，PCR產(chǎn)物量的比值就反映模板拷貝數(shù)的差異。PRT 法(Paralogue Ratio Test) (Armour, Palla et al. Nucleic AcidsRes. 2007; 35 (3) :el9. Epub 2006 Decl4)是基于競爭性 PCR 的一種檢測 CVNs 的一種方法，此方法的優(yōu)點(diǎn)是待測位點(diǎn)和內(nèi)對(duì)照共存于基因組序列中，但是缺點(diǎn)也是很明顯的，只能針對(duì)有限的基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測，而且針對(duì)不同檢測位點(diǎn)都要設(shè)計(jì)一對(duì)熒光引物，加大了實(shí)驗(yàn)成本。與MLPA技術(shù)相比，常規(guī)的競爭性PCR方案因?yàn)橥粎^(qū)段中PCR間距小而會(huì)相互干擾，所以PCR間的間距要足夠遠(yuǎn)。一般PCR間距為5千個(gè)堿基時(shí)，相互之間沒有影響，即5000個(gè)堿基中只能有一個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)行檢測。所以當(dāng)需要精細(xì)檢測這個(gè)核酸區(qū)段中的拷貝數(shù)變化時(shí)，在需要用高密度的檢測位點(diǎn)將整個(gè)檢測區(qū)段全部覆蓋時(shí)，比如在IOOOkb中放置3個(gè)檢測位點(diǎn)，常規(guī)競爭性PCR法是無法進(jìn)行檢測的，而MLPA則可以完成。與此同時(shí)，由于內(nèi)對(duì)照模板一般構(gòu)建在質(zhì)粒載體上，一般長度為2-4kb，而線性化的基因組長度為20k，在檢測過程中，這種模板的長度差異，使得實(shí)際PCR效率不完全一致，這種差異在很多時(shí)候是不可以忽視的，尤其是在拷貝數(shù)變異的定量檢測中，這種差異無法避免造成定量結(jié)果不準(zhǔn)確，因此許多檢測區(qū)段無法用競爭性PCR進(jìn)行檢測。對(duì)于GC較高的檢測片段，這種差異現(xiàn)象更加突出。最后，由于常規(guī)的內(nèi)對(duì)照模板需要全基因合成及克隆在質(zhì)粒上，因此制備時(shí)間在I周到I個(gè)月，用PCR法直接制備則在一天內(nèi)可以內(nèi)對(duì)照的制備，快速進(jìn)入后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的空白，提供一種新的成本低、通量高、適用性好、方案建立時(shí)間短、實(shí)現(xiàn)和MLPA —樣高密度覆蓋的CNVs檢測方法。在總結(jié)現(xiàn)有技術(shù)中各種檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)基礎(chǔ)上，發(fā)明人經(jīng)過自主創(chuàng)新研發(fā)，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)通過如下設(shè)計(jì)，可以成功解決上述技術(shù)問題，并且成功應(yīng)用于生物科學(xué)研究與臨床分子診斷等領(lǐng)域。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)簡而言之，是通過利用一種或多種限制性內(nèi)切酶消化樣本，將大的目標(biāo)區(qū)段消化成一個(gè)個(gè)獨(dú)立的小片段，同時(shí)用一個(gè)引物方案簡單制備和酶切產(chǎn)物類似的內(nèi)對(duì)照模板，使得目標(biāo)模板和內(nèi)對(duì)照模板從起始開始的狀態(tài)基本一致，從而使基于熒光通用引物的多重競爭性PCR的檢測方案構(gòu)建時(shí)間更快，方案適用性更廣及使檢測區(qū)段實(shí)現(xiàn)高密度檢測位點(diǎn)覆蓋。本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供一種多重競爭性PCR檢測拷貝數(shù)變異的方法，包括以下步驟(I)提供多重競爭性PCR引物，由至少一對(duì)通用熒光引物、至少一對(duì)位于待測區(qū)段和至少一對(duì)位于參照區(qū)段的嵌合特異引物組成；所述通用熒光引物長度范圍為l(T25bp，5’端用熒光標(biāo)記，TM值彡57°C值，且對(duì)待測基因組具有特異性；所述嵌合特異引物針對(duì)待測區(qū)段和參照區(qū)段設(shè)計(jì)，TM值>62°C，長度范圍為28 50bp，3’端為18 25bp的特異引物序列，5’端為所述通用引物序列，所述3，端和5，端的兩個(gè)序列之間插入兩個(gè)堿基的固定組合；所有嵌合特異引物之間的TM值的差異不超過3°C ;當(dāng)有兩對(duì)或兩對(duì)以上時(shí)，所述參照引物設(shè)計(jì)在相同或不同的參照區(qū)段上，且與待測基因無特異性匹配；所述多重競爭性PCR引物所產(chǎn)生的不同擴(kuò)增產(chǎn)物片段之間有可檢出的長度差異；(2)提供至少一對(duì)內(nèi)對(duì)照的嵌合特異引物，針對(duì)待測區(qū)段或參照區(qū)段設(shè)計(jì)，其擴(kuò)增產(chǎn)物比多重競爭性PCR產(chǎn)物中待測區(qū)段或參照區(qū)段所對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物長或短l 6bp，且由三部分組成與(I)中所述的嵌合特異引物的3’端特異引物序列完全相同的5’端多重PCR引物區(qū)；與(1)中所述的嵌合特異引物下游18 25bp的序列相同，并且TM值>62°C、引物間TM值的差異不超過3°C的3’端序列；所述5’端多重PCR引物區(qū)和所述3’端序列之間是Hbp的長度調(diào)節(jié)序列，即在5’端和3’端兩序列間分別插入Ilbp任意堿基、或在5’和3’端序列間的靠3’端 分別刪除Ilbp堿基，使所述的內(nèi)對(duì)照的嵌合特異引物的擴(kuò)增產(chǎn)物即內(nèi)對(duì)照比多重競爭性PCR產(chǎn)物中待測區(qū)段或參照區(qū)段所對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物長或短l-6bp ；(3)用所述內(nèi)對(duì)照的嵌合特異引物對(duì)待測區(qū)段或參照區(qū)段模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增制備內(nèi)對(duì)照稀釋液，將PCR產(chǎn)物DNA定量、稀釋，直接作為內(nèi)對(duì)照模板使用；(4)用一至五種限制性內(nèi)切酶對(duì)目標(biāo)區(qū)段進(jìn)行消化；(5)多重競爭性PCR反應(yīng)(a)將含待測區(qū)段和參照區(qū)段的待測樣本和對(duì)照樣本與內(nèi)對(duì)照稀釋液及多重競爭性PCR反應(yīng)試劑混合在一起，進(jìn)行PCR，在前3 16個(gè)循環(huán)中，退火溫度高于所述通用熒光引物的退火溫度，用于所述嵌合特異弓I物引導(dǎo)的擴(kuò)增，在后17 20個(gè)循環(huán)中，退火溫度低于所述通用熒光引物的退火溫度，用于所述通用引物引導(dǎo)的擴(kuò)增，且兩組退火溫度的差距^ 5 0C ；(b)根據(jù)熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度不同，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物片段進(jìn)行檢測，獲得待測樣本中待測區(qū)段和參照區(qū)段以及內(nèi)對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物片段的長度信息與相應(yīng)的熒光強(qiáng)度信息；(6)數(shù)據(jù)分析i.計(jì)算每個(gè)待測區(qū)段和參照區(qū)段的樣本峰高和/或峰面積(S)和相應(yīng)內(nèi)對(duì)照的峰高和/或峰面積(I)，得到每個(gè)待測區(qū)段和參照區(qū)段的比值(S/I);ii以一個(gè)參照區(qū)段的比值為標(biāo)準(zhǔn)，將所有待測區(qū)段和參照區(qū)段的比值同其作比，進(jìn)行數(shù)據(jù)內(nèi)部標(biāo)化；iii.按照i和ii的步驟將對(duì)照樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)內(nèi)部標(biāo)化；iv.將待測樣本和對(duì)照樣本的內(nèi)部標(biāo)化值作比，獲得待測樣本與對(duì)照樣本的比值，該比值乘以對(duì)照樣本的拷貝數(shù)，得到待測樣本的拷貝數(shù)上述技術(shù)方案的優(yōu)選方式之一為，所述通用突光引物長度范圍為18 20bp。上述技術(shù)方案的優(yōu)選方式之二為，所述嵌合特異引物和所述參照引物長度范圍分別為38 45bp。上述技術(shù)方案的優(yōu)選方式之三為，所述多重PCR引物對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度范圍為12(T2000bp，且所述的可檢出的長度差異為8 50bp。上述技術(shù)方案的優(yōu)選方式之四為，所述樣本的DNA分子數(shù)與所述內(nèi)對(duì)照稀釋液的DNA分子數(shù)相差10倍范圍內(nèi)。優(yōu)選地，所述的內(nèi)對(duì)照稀釋液為濃度IOng/ μ L的所述內(nèi)對(duì)照PCR產(chǎn)物DNA稀釋一百萬倍。上述技術(shù)方案的優(yōu)選方式之五為，所述限制性內(nèi)切酶的用量為每種內(nèi)切酶
O.5U/5ng總DNA量/I μ L反應(yīng)體系。上述技術(shù)方案的優(yōu)選方式之六為，所述的多重競爭性PCR引物含一對(duì)通用突光引物、或者本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過現(xiàn)有的四色熒光標(biāo)記技術(shù)和ABI測序儀(如3130/3730)等的四色熒光檢測系統(tǒng)，可以非常容易地將本發(fā)明的藍(lán)色熒光標(biāo)記通用熒光引物的實(shí)施例擴(kuò)展至兩色、三色或者四色標(biāo)記的兩對(duì)、三對(duì)或四對(duì)通用熒光引物；在多重PCR技術(shù)領(lǐng)域，多至幾十對(duì)的在序列上無同源性的引物對(duì)在同一 PCR反應(yīng)體系中分別實(shí)現(xiàn)獨(dú)立的擴(kuò)增反應(yīng)也是常規(guī)技術(shù)。作為另一種具體實(shí)施方式
，所述的多重競爭性PCR引物由一對(duì)通用熒光引物、一對(duì)到二十對(duì)針對(duì)相同或不同待測基因的嵌合特異引物和一對(duì)到六對(duì)參照引物組成。與上述有關(guān)多重PCR技術(shù)領(lǐng)域的描述相同，現(xiàn)有技術(shù)提供了多于二十對(duì)、三十對(duì)、乃至更多對(duì)引物在同一 PCR反應(yīng)體系中分別實(shí)現(xiàn)獨(dú)立的擴(kuò)增反應(yīng)的原理、方案、和具體操作指導(dǎo)；本發(fā)明的具體實(shí)施方式
在這樣的技術(shù)背景下，不應(yīng)被視為對(duì)其他實(shí)施方式的限制，即現(xiàn)有技術(shù)完整地提供了實(shí)現(xiàn)其他實(shí)施方式的充分和必要條件。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是提供一種基于上述的多重競爭性PCR檢測拷貝數(shù)變異方法的試劑盒，包括至少一對(duì)通用熒光引物、至少一對(duì)位于待測基因上下游的嵌合特異引物和至少一對(duì)參照引物、至少一對(duì)內(nèi)對(duì)照的嵌合特異引物或者定量稀釋后的內(nèi)對(duì)照稀釋液、和至少一種限制性內(nèi)切酶、和/或多重競爭性PCR的反應(yīng)試劑。有益.效果 本發(fā)明提供了現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中所缺乏的成本低、通量高、適用性好、方案建立時(shí)間短、實(shí)現(xiàn)和MLPA —樣高密度覆蓋的CNVs檢測方法。本發(fā)明令人驚奇地發(fā)現(xiàn)具有以下優(yōu)點(diǎn)I、成本低。針對(duì)所有的檢測位點(diǎn)，應(yīng)用了通用熒光引物，并采用同一的參照區(qū)段，這些措施都大大降低了實(shí)驗(yàn)成本。2、內(nèi)對(duì)照制備時(shí)間短，省去了克隆，擴(kuò)增等等一系列制備過程，只要一次PCR就可制備完成。3、通過一種或多種內(nèi)切酶消化，使得目的片段消化成獨(dú)立的小片段，因?yàn)檫@些獨(dú)立片段相互不干擾，因此可實(shí)現(xiàn)在檢測片段上高密度覆蓋。4、數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確。因?yàn)镻CR產(chǎn)物內(nèi)對(duì)照和限制性內(nèi)切酶消化的檢測片段都是小片段，使得PCR擴(kuò)增效率更為一致。另外對(duì)于高GC的片段，也因?yàn)槟０宥际切∑危@個(gè)因素的影響也不存在。實(shí)驗(yàn)周期短。相對(duì)于MLPA技術(shù)(需要兩天)來講，一天內(nèi)就可以得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。可對(duì)少量樣本多個(gè)基因進(jìn)行同時(shí)檢測，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期，提高了實(shí)驗(yàn)效率。


圖I為一個(gè)參照區(qū)段和三個(gè)目標(biāo)區(qū)段的多重PCR的試驗(yàn)結(jié)果。圖2為圖I的多重PCR的試驗(yàn)的原理示意圖(分析過程中涉及兩組引物一組是多重上下游嵌合特異引物；另一組是熒光通用引物)。圖3為實(shí)施例I中樣本檢測結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
實(shí)施例I利用本發(fā)明所述的方法對(duì)VIPR2基因區(qū)段(GeneBank序列號(hào)NT_007741)和10號(hào)，5號(hào)染色體上參照區(qū)段(GeneBank序列號(hào)NT_030059、NT_006576)進(jìn)行了拷貝數(shù)的檢測，其中選擇限制性內(nèi)切酶BamHI和Hindlll，并VIPR2基因區(qū)段上連續(xù)設(shè)計(jì)3個(gè)PCR進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)步驟I、通用熒光引物、位于待測基因上下游的嵌合特異引物的設(shè)計(jì)通用熒光引物的設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)原則保證上下游引物的TM值彡57°C，且差距不超過3°C，針對(duì)小鼠和人基因組特異，引物相互作用小，上游通用引5’端用Fam熒光標(biāo)記。通用引物序列為上游5’ -TTCATCCGTTCGTCCTAC-3’ ；下游5’ -ACAGCGTCAATCTCGTTC-3’。嵌合特異引物的設(shè)計(jì)我們選擇了 I個(gè)目標(biāo)基因VIPR2和2個(gè)參基因區(qū)段，共設(shè)計(jì) 了 5對(duì)特異引物，并與通用引物組合成特異引物，且在通用引物的3’端插入ct兩個(gè)堿基，要求TM值彡62°C，擴(kuò)增產(chǎn)物的長度在12(T400bp之間。所有的引物均經(jīng)過Blast和Oligomask軟件的分析，從而減少非特異擴(kuò)增和引物二聚體。含待測區(qū)段的VIPR2的序列如下，限制性內(nèi)切酶TaqI和BamHI進(jìn)行雙酶切，序列中酶切位點(diǎn)用斜體下劃線表示。多重PCR嵌合特異引物的特異性序列區(qū)用雙劃線表示。
>VIPR2 序列(5，-3，) CAGGGCAGGGCCGGGTGGTCGGGCCCCAGCACACGGCTCGGGGAGCCTCCCACACTTGGTGATCCCGAGCCCTCAGTCTGCTGGTGGTGGTGCTCGAGAACTGTGGCTTACAGTGCGGGTGGGC AAGCGGAGAGGAGCAGCT GTGGAGGGCAAGGACTGGGGCCATTGCTCCTTGATACACTGTGGATGAAACCCTTTACTCAGTGAAGACCTAAGACTCCCCCAGGCCTGAAAGCTGGTCTTGGCAGGAAGAGGACACAGACGGGAAGACCTTGG ACAGGGAGAC i GAT CCCT' GGCTGGCTTATCTGCTTCAGGATCTGACTGCAGCAGGTGAGACCCCAAATAAAGGCCCAGACCATGGCCACGGCTGGTGCGGCCCCTTGGGCTCCAGGTCCAGATGAGATGCAGCTGCTCAGCAGTGCCCAGGGCTGCCCTAGAGCCCTCTGGTCCGCAGAGCCCTTCTCCTCCCAGGGGCTCCCACACCCACATCTCTGCTGATTCCCTCACACATGTAGCCAAGTCTGTGGCTTCTGTGGAGGCTAATTTTTTTTCTCGAATTTAATTAATTTCGAAAACAATAAACAATAATGATTGCACACACAACACCCAGGGCAGACTTTGGCCCTGTGCAAGCAGGAAACACAACTAAAAATGTG AATCTGGGAAGCAAGTGG' GCCTGATGGGACGAAGCGTGAGCTCCGGGCAGGAGAAACTCTGTTCAGTTCAGCTCCCAGGCAGCCCTGCGCTCGCCGGTGGGCAGAGCCGGCCCAGGACCGTGCATGTCCACCCCGTGGCTGCCTGGGGCCTGTTCTGGTGCTTGCAGCCTCCAGAGCCGCCTGTGCTATGTGCTGTT GCTTCGTCTTGGAAGCGAGT CCCTMACCAACCAAGTATTCAAAGTATTCAACGAGCAGMACTGCMCAGGAAGAAAAATTATTCATTTTGGTTTTGTGCCATCCTTTTCTTTGCTTTCTCACTTTAAAATATTTTGACTTTCTAATCCCTTAGCAGTGAATATGCACTTATAATATTTGCAGAATCTCTGAAATGTTTAATTAAGAAGAAAAATAGTTCTTCAGACTAAACAGCAAAGCATCAGGGGATCACAGAGCCACTATGCTCACGCAGGCAGGGTTTACTTACAGGCCTCGATGAAGGACCAGTGGACCC AGAAGAGCTTGCCACGTGTC CCTGGGATGCCTCACAGGGTGTGCCCAGGAGGAGACAGGAGATAAGGAGCTTGGGCATGACTCTGTGGGCTGACATTGCCACAGCAGGCGGCGGCTGTCACTGCCTCCCAGATCCACATCACTCTTTATAACCCAGGCTGGGGCTCAGAAAGGAGGTTCCCAGGGAATGCTTATTGAATAAAGGAAGGAGAGAATGAACGACGGAGCCT GCACATACGGGGCTC TGG GTGACGCTGCTGGGGGCCTTGGTCTCTGCTCTTCACCAGCACCTCTGTCCTAATGTCTCCCAGGCACAGTTGCCGGCTAGGTGCAGACGAAGATGAAGACTCAGAGGTGGTGCCTCCAACACACCGGGGATCCCACCTGGACCTTGAAATCCCCCCCAGGCCACAGAAGCCCCTGAGACCCCTGG
>10號(hào)染色體序列(5，-3’ )TCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGAAATACAGGCATGTGCCACCATGCCCAGCTAATTTTGTATTTTTAGTAAAGATGGAGTTTCTTCATGTTGGCCAGGTTGGTCTCAAA.TTCCTGACCTCAGGTGATCCACCTGCCTTGGCCTCCCAMGTGCTCGGATTACAGGCATGAGTCACTGCACCTGGCATATAGATACCATTTTAAATGAGACATTTAAATAMTTACAGACACCATCACACTTCATCCCT CAATACTTCGGCATGGGTCT CCTATACGTMGGGCATTTTCCTGTGAAACAATAATACCATTATCATACCTAAGAAAATTAATGTTAAGTCACCATTGTTACCTAATATGTGCAGTCCATAGTAACATTTCCCCAATTTTCCCAATGGTGTCTCTTGTAACTCTTTTTGT>5號(hào)染色體序列(5’ -3’ )AGTCACCCAGGACAAAGCTGAGGATTCTTTATTTTTTATAAGTTTCAAAAATTTAAAGTCTAGATGAAAACTTCTCTGAAACATCCTAGATTTCTTGAATAGATATGCTCACGTTATGCTAAGGTTTGTAATATATTGTGCTAAAGTAGATGCAAAATGAAGCAAACACTATAG TGATCCT ACTACACGGCAGA CACTGCTGTACTAGGATTGTCTTATTCAATTTACTTAAGGTCTATGGTTATCTGATTCTACCGTTTAAGAAGCAGAAGCTAAGGAGACAACAAGTCAAACATACAGTTCTGGAAAATAAGTTATTAAACATATTTCTGATGTTCTATATGGGTACTGTCACCAGAGAAAGACTAGAAAAGGTTCTCTGGGATTTAGGTTTTACCACTGTGTATTAGATAGGCCATAATAATATATTGCATTATAACCTTCTTATCACTGTAGAAAGAACTGTCATCTTCAAAATAGGTTCTGCCTGACCTTTCCTCCTATTGCCACACTCTAAAGCTG CTCTTGGCCTTACAGGGTTATCATTCTGAGCTAAAGATAGTCATCTGTACCTAAGCAGTGACATTCTATGTGGAAAGCCATAAGACAAGGCTGCTTCATTGCGGACCTCTCCACCAGCAGGGTGTGTTGTTC表一目標(biāo)區(qū)段和參照區(qū)段的嵌合特異引物序列
權(quán)利要求
1. 一種多重競爭性PCR檢測拷貝數(shù)變異的方法，包括以下步驟 (1)提供多重競爭性PCR引物，由至少一對(duì)通用熒光引物、至少一對(duì)位于待測區(qū)段和至少一對(duì)位于參照區(qū)段的嵌合特異引物組成； 所述通用熒光引物長度范圍為l(T25bp，5’端用熒光標(biāo)記，TM值彡57°C值，且對(duì)待測基因組具有特異性； 所述嵌合特異引物針對(duì)待測區(qū)段和參照區(qū)段設(shè)計(jì)，TM值彡62°C，長度范圍為28 50bp，3’端為18 25bp的特異引物序列，5’端為所述通用引物序列，所述3’端和5’端的兩個(gè)序列之間插入兩個(gè)堿基的固定組合；所有嵌合特異引物之間的TM值的差異不超過3°C ;當(dāng)有兩對(duì)或兩對(duì)以上時(shí)，所述參照引物設(shè)計(jì)在不同的參照區(qū)段上，且與待測基因無特異性匹配； 所述多重競爭性PCR引物所產(chǎn)生的不同擴(kuò)增產(chǎn)物片段之間有可檢出的長度差異； (2)提供至少一對(duì)內(nèi)對(duì)照的嵌合特異引物，針對(duì)待測區(qū)段或參照區(qū)段設(shè)計(jì)，其擴(kuò)增產(chǎn)物比多重競爭性PCR產(chǎn)物中待測區(qū)段或參照區(qū)段所對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物長或短l 6bp，且由三部分組成與(I)中所述的嵌合特異引物的3’端特異引物序列完全相同的5’端多重PCR引物區(qū)；與(I)中所述的嵌合特異引物下游18 25bp的序列相同，并且TM值>62°C、引物間TM值的差異不超過TC的3’端序列；所述5’端多重PCR引物區(qū)和所述3’端序列之間是Hbp的長度調(diào)節(jié)序列，即在5’端和3’端兩序列間分別插入Ilbp任意堿基、或在5’和3’端序列間的靠3’端分別刪除Ilbp堿基，使所述的內(nèi)對(duì)照的嵌合特異引物的擴(kuò)增產(chǎn)物即內(nèi)對(duì)照比多重競爭性PCR產(chǎn)物中待測區(qū)段或參照區(qū)段所對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物長或短l-6bp ； (3)用所述內(nèi)對(duì)照的嵌合特異引物對(duì)待測區(qū)段或參照區(qū)段模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增制備內(nèi)對(duì)照稀釋液，將PCR產(chǎn)物DNA定量、稀釋，直接作為內(nèi)對(duì)照模板使用； (4)用一至五種限制性內(nèi)切酶對(duì)目標(biāo)區(qū)段進(jìn)行消化； (5)多重競爭性PCR反應(yīng) (a)將含待測區(qū)段和參照區(qū)段的待測樣本和對(duì)照樣本與內(nèi)對(duì)照稀釋液及多重競爭性PCR反應(yīng)試劑混合在一起，進(jìn)行PCR，在前3 16個(gè)循環(huán)中，退火溫度高于所述通用熒光引物的退火溫度，用于所述嵌合特異弓I物引導(dǎo)的擴(kuò)增，在后17 20個(gè)循環(huán)中，退火溫度低于所述通用熒光引物的退火溫度，用于所述通用引物引導(dǎo)的擴(kuò)增，且兩組退火溫度的差距彡5°C ； (b)根據(jù)熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度不同，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物片段進(jìn)行檢測，獲得待測樣本中待測區(qū)段和參照區(qū)段以及內(nèi)對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物片段的長度信息與相應(yīng)的熒光強(qiáng)度信息； (6)數(shù)據(jù)分析 1.計(jì)算每個(gè)待測區(qū)段和參照區(qū)段的樣本峰高和/或峰面積(S)和相應(yīng)內(nèi)對(duì)照的峰高和/或峰面積(I)，得到每個(gè)待測區(qū)段和參照區(qū)段的比值(S/I); 以一個(gè)參照區(qū)段的比值為標(biāo)準(zhǔn)，將所有待測區(qū)段和參照區(qū)段的比值同其作比，進(jìn)行數(shù)據(jù)內(nèi)部標(biāo)化； iii.按照i和ii的步驟將對(duì)照樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)內(nèi)部標(biāo)化； iv.將待測樣本和對(duì)照樣本的內(nèi)部標(biāo)化值作比,獲得待測樣本與對(duì)照樣本的比值,該比值乘以對(duì)照樣本的拷貝數(shù)，得到待測樣本的拷貝數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數(shù)變異的方法，其特征在于，所述通用熒光引物長度范圍為18 20bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數(shù)變異的方法，其特征在于，所述嵌合特異引物和所述參照引物長度范圍分別為38 45bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數(shù)變異的方法，其特征在于，所述多重PCR引物對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度范圍為12(T2000bp，且所述的可檢出的長度差異為8 50bpo
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數(shù)變異的方法，其特征在于，在所述多重競爭性PCR反應(yīng)中，所述待測樣本和所述對(duì)照樣本的DNA分子數(shù)與所述內(nèi)對(duì)照稀釋液的DNA分子數(shù)相差10倍范圍內(nèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數(shù)變異的方法，其特征在于，所述的內(nèi)對(duì)照稀釋液為濃度IOng/ μ L的所述內(nèi)對(duì)照PCR產(chǎn)物DNA稀釋一百萬倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數(shù)變異的方法，其特征在于，所述限制性內(nèi)切酶的用量為每種內(nèi)切酶O. 5U/5ng總DNA量/I μ L反應(yīng)體系。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數(shù)變異的方法，其特征在于，所述的多重競爭性PCR引物含一對(duì)通用熒光引物、或者兩對(duì)、三對(duì)或四對(duì)不同熒光標(biāo)記的通用熒光引物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數(shù)變異的方法，其特征在于，所述的多重競爭性PCR引物由一對(duì)通用熒光引物、一對(duì)到二十對(duì)針對(duì)相同或不同待測基因的嵌合特異弓I物和一對(duì)到六對(duì)參照弓I物組成。
10.一種基于權(quán)利要求I所述的多重競爭性PCR檢測拷貝數(shù)變異方法的試劑盒，包括至少一對(duì)通用熒光引物、至少一對(duì)位于待測基因上下游的嵌合特異引物和至少一對(duì)參照引物、至少一對(duì)內(nèi)對(duì)照的嵌合特異引物或者定量稀釋后的內(nèi)對(duì)照稀釋液、和至少一種限制性內(nèi)切酶、和/或多重競爭性PCR的反應(yīng)試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速高密度多重競爭性PCR法檢測拷貝數(shù)變異的方法，包括下列步驟(1)提供多重競爭性PCR引物，由至少一對(duì)通用熒光引物、至少一對(duì)位于待測區(qū)段和至少一對(duì)位于參照區(qū)段的嵌合特異引物組成；(2)用限制性內(nèi)切酶消化樣本獲得獨(dú)立的結(jié)構(gòu)相似的樣本模板小片段，使得該檢測片段能被高密度PCR所檢測，且對(duì)于高GC序列不敏感；(3)利用PCR法直接制備內(nèi)對(duì)照模板；(4)多重競爭性PCR反應(yīng)；和(5)數(shù)據(jù)分析。本發(fā)明的方法能在一天內(nèi)快速簡便地建立起中通量的適于5～28個(gè)基因/反應(yīng)的拷貝數(shù)變異的檢測方案，結(jié)果準(zhǔn)確，適用性廣。本發(fā)明還提供相應(yīng)的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102936624SQ20121037885
公開日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2012年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月8日
發(fā)明者陸炯, 陳軼群, 肖君華 申請(qǐng)人:上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司