專利名稱：一種胎兒9號染色體異常疾病的篩查試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，特別涉及一種胎兒9號染色體異常疾病的篩查試劑盒。
背景技術(shù)：
人類的9號染色體是23對染色體中的一對，正常情況下每個體細(xì)胞擁有兩條該染色體，此染色體含有約有800到1200個基因，占細(xì)胞內(nèi)所有DNA的4%到4.5%。9號染色體中有95個基因與疾病有關(guān)，其中之一可抑制腫瘤形成，還有一個基因與某種類似亨廷頓氏癥的神經(jīng)退化疾病有關(guān)。9號染色體的異常，如9號染色體三體綜合征，主要病理特征是小頭畸形、第4腦室擴大，先天心臟、指趾異常，先天性髖關(guān)節(jié)脫位、馬蹄外翻足、隱睪、陰囊陰莖異常、特殊面容、握拳手、手指重疊等，并且患者出生以后早年死亡的可能性大。因此，在懷孕早期進行檢測，確定胎兒的9號染色體是否異常，對妊娠及時干預(yù)以及胎兒出生后的及時治療具有極為重要指導(dǎo)意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種胎兒9號染色體異常疾病的篩查試劑盒，檢測孕婦血清或尿液PLGF水平的試劑在制備胎兒9號染色體異常疾病篩查試劑中的用途。本發(fā)明胎兒9號染色體異常疾病的篩查試劑盒，它包括檢測孕婦血清或尿液PLGF水平的試劑。其中，所述試劑為ELISA檢測用試劑。所述ELISA檢測用試劑為ELISA直接法、ELISA間接法、ELISA雙抗體夾心法或者ELISA競爭法檢測用試劑。所述ELISA雙抗體夾心法檢測用試劑包括抗人PLGF抗體、人PLGF標(biāo)準(zhǔn)品、ELISA檢測用酶和ELISA檢測用底物。優(yōu)選地，所述抗人PLGF抗體包括抗人PLGF單克隆抗體和生物素標(biāo)記的抗人PLGF多克隆抗體；所述ELISA檢測用酶是辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素；所述ELISA檢測用底物為TMB。本發(fā)明還提供了檢測孕婦血清或尿液PLGF水平的試劑在制備胎兒9號染色體異常疾病篩查試劑中的用途。其中，所述檢測孕婦血清或尿液PLGF水平的試劑為ELISA檢測用試劑。所述ELISA檢測用試劑為ELISA直接法、ELISA間接法、ELISA雙抗體夾心法或者ELISA競爭法檢測用試劑。所述ELISA雙抗體夾心法檢測用試劑包括抗人PLGF抗體、人PLGF標(biāo)準(zhǔn)品、ELISA檢測用酶和ELISA檢測用底物。

優(yōu)選地，所述抗人PLGF抗體包括抗人PLGF單克隆抗體和生物素標(biāo)記的抗人PLGF多克隆抗體；所述ELISA檢測用酶是辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素；所述ELISA檢測用底物為TMB。本發(fā)明篩查試劑盒和方法能夠有效篩查胎兒的9號染色體是否異常，使胎兒可以得到及時的治療，降低死亡率，并且本發(fā)明試劑盒是對孕婦進行血液或尿液進行檢查，使用方便，患者依從性高，具有良好的臨床應(yīng)用前景。以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式實施例1樣本采集1、采集對象:2011年10月-2012年4月在四川大學(xué)華西第二醫(yī)院門診及成都中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院門診就診的孕早期孕婦共36例。2、早期妊娠診斷標(biāo)準(zhǔn):參考全國高等醫(yī)學(xué)院校教材《婦產(chǎn)科學(xué)》第7版記載的方法(包括①停經(jīng)史；@HCG陽性；③確診為宮內(nèi)妊娠(B型超聲見到宮腔內(nèi)有妊娠囊)。3、納入標(biāo)準(zhǔn):①符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者；②孕周:5周-13+6周；③知情同意，志愿受試。4、排除標(biāo)準(zhǔn):有心血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等并發(fā)癥，或其他原發(fā)性疾病及精神病患者。 5、脫落標(biāo)準(zhǔn):①納入后發(fā)現(xiàn)不符合納入標(biāo)準(zhǔn)或伴有排除標(biāo)準(zhǔn)的病例予以剔除
因其他原因失訪的病例患者自行退出；④納入后發(fā)現(xiàn)無法從受試者處獲得真實、全面的臨床資料。6、樣本人口特征:納入孕婦年齡范圍21歲-43歲，平均年齡31.96±6.1歲。7、胎兒9號染色異常檢測方法:羊水穿刺后G顯帶分析。檢測結(jié)果:34例正常，I例為9號染色體三體,I例為9號染色體臂間倒位。8、樣本采集(I)血液樣本:采用含有EDTA的試管采集孕婦靜脈血(空腹)4ml,經(jīng)4°C低溫離心(4000rpm, IOmin)后將其上清液，編號保存于_80°C冰箱冷凍待測。(2)尿液樣本:留取受試者中段尿6ml，經(jīng)4°C低溫離心(4000rpm, IOmin)后將其上清液，編號保存于_80°C冰箱冷凍待測。實施例2PLGF水平的檢測方法1、主要儀器(I)酶標(biāo)儀:Molecular Devices 公司，Spectra Max5(2)冷凍離心機:BECKMAN 公司，AllegraTMMR(3)_2CTC冰箱:Electrolux 公司(4)超低溫冰箱:Thermo 公司，SK501(5)電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海森信實驗儀器有限公司，DRP-91622、實驗試劑及材料(I) Capture Antibody:鼠抗人 PLGF 單克隆抗體 Human PLGF Antibody(Monoclonal Mouse IgGl)，購自 R&D 公司，MAB264 ；
(2)Detection Antibody:生物素標(biāo)記的羊抗人PLGF多克隆抗體Human PLGFBiotinylated Antibody (Ployclonal Goat IgG)，購自 R&D 公司，BAF264 ;(3)PLGF 標(biāo)準(zhǔn)品:重組人 PLGF Recombinant Human PLGF,購自 R&D 公司，264-PG-10 ；(4)辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素Streptavidin-horseradish peroxidase:R&D 公司，DY998 ；(5) TMB:Sigma 公司，T0440-1L ；(6) PBS:自配，ρΗ7.4，137mM NaCl, 2.7mM KC1,8.1mM Na2HPO4, 1.5mMKH2PO4, pH7.2-7.4, 0.2 μ m filtered ；(7) Tween-20:上海生工；(8)包被緩沖液:自配，ρΗ9.6、50mM 碳酸鹽緩沖液，Na2CO3L 59g，NaHC032.93g，加蒸餾水至IL ；(9)洗滌液:自配，PBS-T (PBS，含 0.02%Tween-20)(10)終止液:自 配，2M H2SO4 ；(11)脫脂奶粉:伊利集團；(12)牛血清白蛋白(BSA):羅氏公司；(13)胎牛血清(FBS):GIBC0 公司；(14)可拆式 96 孔 ELISA 板:COSTAR 公司。3、實驗方法(I)將所測樣本放在室溫下復(fù)蘇后，再進行檢測；(2)包被 Capture Antibody, 4 μ g/ml, 100 μ 1/well, 4°C放置過夜(約 16_20h);(3)3%BSA溶液、3%FBS溶液或為5%脫脂奶粉溶液封閉，100 μ 1/well，37 °C孵育2h ；(4)PBS-T洗板三次；分別加入8個不同濃度PLGF標(biāo)準(zhǔn)品(濃度分別為2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.625pg/ml)及待測樣品，100μ 1/well，均設(shè)置兩個復(fù)孔，同時設(shè)置兩個空白孔，37°C孵育2h ；(5)PBS_T 洗板三次；分別加入 Detection Antibody, I μ g/ml, 100 μ 1/well, 37°C孵育2h ；(6) PBS-T 洗板三次；加入 streptavidin-horseradish peroxidase, 1:200,100μ 1/well，室溫，Ih ；(7) 85-1'洗板三次；加入了]\^，10(^1/^11，避光于371:孵育 IOmin ;(8)直接加終止液，50 μ 1/well ；450nm處檢測OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待檢樣品的PLGF水平。實施例3PLGF水平與9號染色體異常的相關(guān)性按照實施例2的方法分別檢測實施例1采集的血液和尿液樣本，統(tǒng)計結(jié)果如表I所示:表I胎兒9號染色體異常與血清PLGF水平的相關(guān)性
權(quán)利要求
1.一種胎兒9號染色體異常疾病的篩查試劑盒，其特征在于:它包括檢測孕婦血清或尿液PLGF水平的試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩查試劑盒，其特征在于:所述試劑為ELISA檢測用試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩查試劑盒，其特征在于:所述ELISA檢測用試劑為ELISA直接法、ELISA間接法、ELISA雙抗體夾心法或者ELISA競爭法檢測用試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩查試劑盒，其特征在于:所述ELISA雙抗體夾心法檢測用試劑包括抗人PLGF抗體、人PLGF標(biāo)準(zhǔn)品、ELISA檢測用酶和ELISA檢測用底物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩查試劑盒，其特征在于:所述抗人PLGF抗體包括抗人PLGF單克隆抗體和生物素標(biāo)記的抗人PLGF多克隆抗體；所述ELISA檢測用酶是辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素；所述ELISA檢測用底物為TMB。
6.檢測孕婦血清或尿液PLGF水平的試劑在制備胎兒9號染色體異常篩查試劑中的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于:所述檢測孕婦血清或尿液PLGF水平的試劑為ELISA檢測用試劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于:所述ELISA檢測用試劑為ELISA直接法、ELISA間接法、ELISA雙抗體夾心法或者ELISA競爭法檢測用試劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于:所述ELISA雙抗體夾心法檢測用試劑包括抗人PLGF抗體、人PLGF標(biāo)準(zhǔn)品、ELISA檢測用酶和ELISA檢測用底物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其`特征在于:所述抗人PLGF抗體包括抗人PLGF單克隆抗體和生物素標(biāo)記的抗人PLGF多克隆抗體；所述ELISA檢測用酶是辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素；所述ELISA檢測用底物為TMB。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種胎兒9號染色體異常疾病的篩查試劑盒，它包括檢測孕婦血清或尿液PLGF水平的試劑。本發(fā)明還公開了檢測孕婦血清或尿液PLGF水平的試劑在制備胎兒9號染色體異常篩查試劑中的用途。本發(fā)明試劑盒可以對胎兒的9號染色體是否異常進行評估，臨床應(yīng)用前景良好。
文檔編號G01N33/577GK103235133SQ20131015735
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月28日
發(fā)明者陸華, 高小平, 劉小章 申請人:成都中醫(yī)藥大學(xué)