專(zhuān)利名稱(chēng)：一種基于pcr-ldr技術(shù)的檢測(cè)拷貝數(shù)變異的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及基于多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR以及LDR技術(shù)檢測(cè)拷貝數(shù)變異的方法，應(yīng)用于生物科學(xué)研究與臨床分子診斷。
背景技術(shù)：
拷貝數(shù)變異(copy number variations, CNVs)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的基因組多樣性的新形式，它是指與參考序列相比，基因組中l(wèi)kb 3Mb的DNA片段的結(jié)構(gòu)變異現(xiàn)象。CNVs廣泛存于基因組中，與一些遺傳性疾病的發(fā)生相關(guān)，對(duì)人類(lèi)抗病性和易感性表型等變異有重要影響。這就要求建立一種快速、準(zhǔn)確和低成本的CNVs分型檢測(cè)技術(shù)。
隨著生物技術(shù)的發(fā)展，不同的研究小組相繼開(kāi)發(fā)了許多的檢測(cè)方法，主要包括以雜交為基礎(chǔ)和以PCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)。前者可以在全基因組水平上對(duì)CNVs進(jìn)行檢測(cè)，代表技術(shù)有微陣列比較基因雜交(SolinasToldo, Lampel et al Genes Chromosomes Cancer. 1997Dec; 20 (4) : 399-407)、全基因組 SNP 芯片(Irving, Bloodworth et al. Cancer Res. 2005Aprl5; 65 (8) : 3053-8)、代表性寡核昔酸微陣列技術(shù)(Lucito, Healy et al. Genome Res. 20030ct; 13 (10) :2291-305. Epub2003Sepl5.)等，其優(yōu)點(diǎn)是通量高且易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，但是普遍存在分辨率低、成本高和周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)。后者主要是針對(duì)具體的目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，代表性的技術(shù)有實(shí)時(shí)熒光定量PCR、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA) (Schouten, McElgunn et al. Nucleic Acids Res. 2002Junl5; 30 (12) : e57)和多重可擴(kuò)增探針雜交(MAPH) (Armour, Sismani et al. Nucleic Acids Res. 2000Janl5; 28 (2) :605-9.) 等。實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、實(shí)驗(yàn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，但是檢測(cè)通量較小；與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比，MLPA和MAPH的檢測(cè)通量有了很大提高，不過(guò)PCR微環(huán)境的變化會(huì)導(dǎo)致不同位點(diǎn)不能完全同步擴(kuò)增，而且PCR的平臺(tái)效應(yīng)也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。以PCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)存在一個(gè)共同的缺陷就是待測(cè)樣本和對(duì)照樣本是分開(kāi)檢測(cè)的，這樣兩者PCR效率的差異會(huì)引起檢測(cè)結(jié)果的偏差。
競(jìng)爭(zhēng)性PCR克服了這個(gè)缺陷，實(shí)現(xiàn)CNVs的快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，PCR產(chǎn)物的量可以用公式Y(jié)=A (1+R) n來(lái)表示，其Y表示PCR產(chǎn)物的量，A表示初始模板的量，R表示PCR的擴(kuò)增效率，η表示PCR的循環(huán)數(shù)，當(dāng)PCR擴(kuò)增效率相同時(shí)，PCR產(chǎn)物的量與初始模板的量成正比。競(jìng)爭(zhēng)性PCR利用了這一原理，在同一 PCR反應(yīng)體系中涉及兩組模板，一組是待測(cè)樣本，另一組是合成的一段核酸序列，用作內(nèi)對(duì)照，兩組模板僅在目標(biāo)序列長(zhǎng)度上(存在一些堿基的插入或缺失)存在一些差異，其他反應(yīng)條件一致，因此兩者擴(kuò)增效率接近一致，兩種擴(kuò)增產(chǎn)物量的比直觀的反映了初始模板(待測(cè)樣本和內(nèi)對(duì)照不存在拷貝數(shù)差異)量的比，可以根據(jù)內(nèi)對(duì)照的初始模板的量來(lái)計(jì)算待測(cè)樣本的濃度。在檢測(cè)拷貝數(shù)變異時(shí)，當(dāng)兩模板具有相同的濃度或消除了濃度差異帶來(lái)的影響時(shí)，PCR產(chǎn)物量的比值就反映模板拷貝數(shù)的差異。PRT 法(Paralogue Ratio Test) (Armour, Palla et al. Nucleic Acids Res. 2007; 35 (3) :el9. Epub2006Decl4)是基于競(jìng)爭(zhēng)性PCR 的一種檢測(cè) CVNs 的一種方法，此方法的優(yōu)點(diǎn)是待測(cè)位點(diǎn)和內(nèi)對(duì)照共存于基因組序列中，但是缺點(diǎn)也是很明顯的，只能針對(duì)有限的基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，而且針對(duì)不同檢測(cè)位點(diǎn)都要設(shè)計(jì)一對(duì)熒光引物，加大了實(shí)驗(yàn)成本。
對(duì)于一些基于多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR的定量技術(shù)，因?yàn)槠銹CR產(chǎn)物的長(zhǎng)度必須能清晰分離，這對(duì)PCR產(chǎn)物的設(shè)計(jì)提出了較高的要求。對(duì)于一些PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度相近的情況則無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明就是利用LDR技術(shù)，對(duì)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度不提出要求，解決了多重PCR設(shè)計(jì)的難點(diǎn)。發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)一些多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度設(shè)計(jì)難點(diǎn)的問(wèn)題，提供一種成本低、通量高、樣本需求低、檢測(cè)靈敏性高、普及度廣的CNVs檢測(cè)方法。
技術(shù)方案
在總結(jié)現(xiàn)有技術(shù)中各種檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)基礎(chǔ)上，發(fā)明人經(jīng)過(guò)自主創(chuàng)新研發(fā)，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)通過(guò)如下設(shè)計(jì)，可以成功解決上述技術(shù)問(wèn)題，并且成功應(yīng)用于生物科學(xué)研究與臨床分子診斷等領(lǐng)域。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供一種多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR和LDR聯(lián)合檢測(cè)拷貝數(shù)變異的方法，包括以下步驟
(I)提供多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物所述的多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物由分別針對(duì)待測(cè)區(qū)段和參照區(qū)段設(shè)計(jì)的至少一對(duì)待測(cè)區(qū)段引物和至少一對(duì)參照區(qū)段引物組成，TM值> 62°C，長(zhǎng)度范圍為18飛Obp，所述多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物所產(chǎn)生的不同擴(kuò)增產(chǎn)物片段間的長(zhǎng)度差異沒(méi)有要求；
(2)提供內(nèi)對(duì)照序列通過(guò)全基因合成法合成一條與所述多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物片段之一相比僅一個(gè)替換堿基的差異的序列，且所述替換堿基的位置不在引物結(jié)合區(qū)；或者通過(guò)載體克隆法將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒上，并在某個(gè)堿基上導(dǎo)入替換突變，且所述替換突變的堿基的位置不在引物結(jié)合區(qū)；
(3)多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR反應(yīng)將含待測(cè)區(qū)段和參照區(qū)段的待測(cè)樣本和對(duì)照樣本分別與所述內(nèi)對(duì)照的稀釋液混合在一起，所述待測(cè)樣本和所述對(duì)照樣本的DNA分子數(shù)分別與所述內(nèi)對(duì)照稀釋液的DNA分子數(shù)相差10倍范圍內(nèi)，進(jìn)行多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR反應(yīng)；
(4)多重LDR測(cè)序反應(yīng)取所述多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR反應(yīng)的產(chǎn)物與含所述測(cè)序探針的 LDR反應(yīng)體系混合，進(jìn)行LDR測(cè)序反應(yīng)；
(5) LDR測(cè)序產(chǎn)物電泳分離對(duì)所述LDR測(cè)序反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，利用LDR 測(cè)序反應(yīng)將單堿基差異轉(zhuǎn)變成序列長(zhǎng)度差異的原理將所述待測(cè)樣本或所述對(duì)照樣本分別與內(nèi)對(duì)照產(chǎn)物區(qū)分開(kāi)、且利用LDR測(cè)序產(chǎn)物的濃度和模板濃度成線(xiàn)性關(guān)系的原理，通過(guò)檢測(cè)LDR測(cè)序產(chǎn)物在電泳分離后的濃度分別獲得所述待測(cè)樣本、所述對(duì)照樣本、和所述內(nèi)對(duì)照所對(duì)應(yīng)的各個(gè)模板的相對(duì)濃度，所述的相對(duì)濃度以電泳分離片段的峰高和/或峰面積表示；
(6)數(shù)據(jù)分析
i.將每個(gè)待測(cè)區(qū)段和參照區(qū)段的峰高和/或峰面積(S)和內(nèi)對(duì)照的峰高和/或峰面積(I)作比，得到每個(gè)待測(cè)區(qū)段和參照區(qū)段的比值(S/I);
以一個(gè)參照區(qū)段的比值為標(biāo)準(zhǔn)，將其他待測(cè)區(qū)段和參照區(qū)段的比值分別同其作比，進(jìn)行數(shù)據(jù)內(nèi)部標(biāo)化；
iii.將待測(cè)樣本和對(duì)照樣本的內(nèi)部標(biāo)化值作比，獲得待測(cè)樣本與對(duì)照樣本的比值，該比值乘以對(duì)照樣本的拷貝數(shù)，得到待測(cè)樣本的拷貝數(shù)。
上述技術(shù)方案的優(yōu)選方式之一為，所述待測(cè)區(qū)段引物和所述參照區(qū)段引物的長(zhǎng)度范圍均為38 45bp。
上述技術(shù)方案的優(yōu)選方式之二為，所述多重PCR引物對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度范圍為 120 1000bp。
上述技術(shù)方案的優(yōu)選方式之三為，所述LDR測(cè)序探針對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物的長(zhǎng)度范圍為 70 200bp。
上述技術(shù)方案的優(yōu)選方式之四為，所述的多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物含一到二十五對(duì)針對(duì)不同待測(cè)基因的待測(cè)區(qū)段引物。作為另一種具體實(shí)施方式
，所述的多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物由一對(duì)到二十對(duì)針對(duì)不同待測(cè)基因的待測(cè)區(qū)段引物和一對(duì)到六對(duì)參照引物組成。作為又一種具體實(shí)施方式
，所述的多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物由一對(duì)到十對(duì)針對(duì)不同待測(cè)基因的待測(cè)區(qū)段弓I物和一對(duì)到三對(duì)參照弓I物組成。
在多重PCR技術(shù)領(lǐng)域，多至幾十對(duì)的在序列上無(wú)同源性的引物對(duì)在同一 PCR反應(yīng)體系中分別實(shí)現(xiàn)獨(dú)立的擴(kuò)增反應(yīng)已經(jīng)是常規(guī)技術(shù)?，F(xiàn)有技術(shù)也提供了多于二十對(duì)、三十對(duì)、 乃至更多對(duì)引物在同一 PCR反應(yīng)體系中分別實(shí)現(xiàn)獨(dú)立的擴(kuò)增反應(yīng)的原理、方案、和具體操作指導(dǎo)，即現(xiàn)有技術(shù)完整地提供了實(shí)現(xiàn)其他實(shí)施方式的充分和必要條件；本發(fā)明的具體實(shí)施方式
或?qū)嵤├谶@樣的技術(shù)背景下，不應(yīng)被視為對(duì)其他實(shí)施方式的限制。
上述技術(shù)方案的優(yōu)選方式之五為，所述的測(cè)序探針由四色熒光標(biāo)記。作為具體實(shí)施方式
之一，所述的測(cè)序探針由藍(lán)色熒光FAM標(biāo)記。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)現(xiàn)有的四色熒光標(biāo)記技術(shù)和ABI測(cè)序儀(如3130/3730)等的四色熒光檢測(cè)系統(tǒng)，可以非常容易地將本發(fā)明的藍(lán)色熒光FAM標(biāo)記LDR測(cè)序探針的實(shí)施例擴(kuò)展至兩色、三色或者四色標(biāo)記的熒光探針，以支持二十五對(duì)乃至更多對(duì)多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR 引物的測(cè)序分析，完成二十五個(gè)乃至更多不同待測(cè)基因的拷貝數(shù)檢測(cè)。
本發(fā)明的技術(shù)方案之二是一種基于上述方法的試劑盒，包括提供多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR 引物由至少一對(duì)待測(cè)區(qū)段引物和至少一對(duì)參照區(qū)段引物組成、定量的內(nèi)對(duì)照DNA、LDR熒光標(biāo)記測(cè)序探針、和/或多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR的反應(yīng)的試劑、和/或LDR測(cè)序反應(yīng)的試劑。
本發(fā)明的技術(shù)方案之三是提供上述的試劑盒在檢測(cè)人類(lèi)基因拷貝數(shù)變異中的應(yīng)用。
有益效果
本發(fā)明經(jīng)過(guò)巧妙設(shè)計(jì)檢測(cè)方案、令人驚奇地具有以下優(yōu)點(diǎn)
I、多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR設(shè)計(jì)引物和產(chǎn)物時(shí)，并不需要考慮分離不同產(chǎn)物而設(shè)計(jì)產(chǎn)物長(zhǎng)度差異。
2、適用性廣。對(duì)所有的基于毛細(xì)管電泳的測(cè)序儀都適用。
3、如果利用靈長(zhǎng)類(lèi)其他物種和人類(lèi)的序列高度同源性，從靈長(zhǎng)類(lèi)的核酸模板入手，可以通過(guò)PCR克隆法快速制備內(nèi)對(duì)照。
4、實(shí)驗(yàn)周期短。相對(duì)于MLPA技術(shù)(需要兩天)來(lái)講，一天內(nèi)就可以得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 可對(duì)少量樣本多個(gè)基因進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期，提高了實(shí)驗(yàn)效率。


圖I為一個(gè)參照區(qū)段和三個(gè)目標(biāo)區(qū)段的多重PCR的試驗(yàn)結(jié)果。R為參照區(qū)段；I、 2、3為3個(gè)檢測(cè)區(qū)段。
圖2為L(zhǎng)DR技術(shù)的基本原理圖解。
圖3為實(shí)施例I中樣本檢測(cè)結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解，實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式有同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
實(shí)施例I
利用本發(fā)明所述的方法對(duì)VIPR2基因區(qū)段(GeneBank序列號(hào)NT_007741)和10號(hào)染色體、5號(hào)染色體(GeneBank序列號(hào)NT_030059、NT_006576)上參照區(qū)段進(jìn)行了拷貝數(shù)的檢測(cè)，其中在VIPR2的基因區(qū)段中設(shè)計(jì)3個(gè)PCR檢測(cè)區(qū)段。
I、多重PCR引物的設(shè)計(jì)
多重PCR引物的設(shè)計(jì)根據(jù)待測(cè)區(qū)段和參照區(qū)段選擇我們共設(shè)計(jì)了 5對(duì)特異引物， 要求TM值彡62°C，擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度在10(T500bp之間。所有的引物均經(jīng)過(guò)Blast和Oligo mask軟件的分析，從而減少非特異擴(kuò)增和引物二聚體。
序列中多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物的序列用下劃線(xiàn)表示，連接位點(diǎn)堿基用斜體小寫(xiě)字符表不。
所設(shè)計(jì)核酸序列如下所示
>10號(hào)染色體片段(5，-3，)
權(quán)利要求
1. 一種多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR和LDR聯(lián)合檢測(cè)拷貝數(shù)變異的方法，包括以下步驟 (1)提供多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物所述的多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物由分別針對(duì)待測(cè)區(qū)段和參照區(qū)段設(shè)計(jì)的至少一對(duì)待測(cè)區(qū)段引物和至少一對(duì)參照區(qū)段引物組成，TM值> 62°C，長(zhǎng)度范圍為18飛Obp，所述多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物所產(chǎn)生的不同擴(kuò)增產(chǎn)物片段間的長(zhǎng)度差異沒(méi)有要求； (2)提供內(nèi)對(duì)照序列通過(guò)全基因合成法合成一條與所述多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物片段之一相比僅一個(gè)替換堿基的差異的序列，且所述替換堿基的位置不在引物結(jié)合區(qū)；或者通過(guò)載體克隆法將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒上，并在某個(gè)堿基上導(dǎo)入替換突變，且所述替換突變的堿基的位置不在引物結(jié)合區(qū)； (3)多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR反應(yīng)將含待測(cè)區(qū)段和參照區(qū)段的待測(cè)樣本和對(duì)照樣本分別與所述內(nèi)對(duì)照的稀釋液混合在一起，所述待測(cè)樣本和所述對(duì)照樣本的DNA分子數(shù)分別與所述內(nèi)對(duì)照稀釋液的DNA分子數(shù)相差10倍范圍內(nèi)，進(jìn)行多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR反應(yīng)； (4)多重LDR測(cè)序反應(yīng)取所述多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR反應(yīng)的產(chǎn)物與含所述測(cè)序探針的LDR反應(yīng)體系混合,進(jìn)行LDR測(cè)序反應(yīng)； (5)LDR測(cè)序產(chǎn)物電泳分離對(duì)所述LDR測(cè)序反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，利用LDR測(cè)序反應(yīng)將單堿基差異轉(zhuǎn)變成序列長(zhǎng)度差異的原理將所述待測(cè)樣本或所述對(duì)照樣本分別與內(nèi)對(duì)照產(chǎn)物區(qū)分開(kāi)、且利用LDR測(cè)序產(chǎn)物的濃度和模板濃度成線(xiàn)性關(guān)系的原理，通過(guò)檢測(cè)LDR測(cè)序產(chǎn)物在電泳分離后的濃度分別獲得所述待測(cè)樣本、所述對(duì)照樣本、和所述內(nèi)對(duì)照所對(duì)應(yīng)的各個(gè)模板的相對(duì)濃度，所述的相對(duì)濃度以電泳分離片段的峰高和/或峰面積表示； (6)數(shù)據(jù)分析 1.將每個(gè)待測(cè)區(qū)段和參照區(qū)段的峰高和/或峰面積(S)和內(nèi)對(duì)照的峰高和/或峰面積(I)作比，得到每個(gè)待測(cè)區(qū)段和參照區(qū)段的比值(S/I); 以一個(gè)參照區(qū)段的比值為標(biāo)準(zhǔn)，將其他待測(cè)區(qū)段和參照區(qū)段的比值分別同其作比，進(jìn)行數(shù)據(jù)內(nèi)部標(biāo)化； iii.將待測(cè)樣本和對(duì)照樣本的內(nèi)部標(biāo)化值作比，獲得待測(cè)樣本與對(duì)照樣本的比值，該比值乘以對(duì)照樣本的拷貝數(shù)，得到待測(cè)樣本的拷貝數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)拷貝數(shù)變異的方法，其特征在于，所述待測(cè)區(qū)段引物和所述參照區(qū)段引物的長(zhǎng)度范圍均為38 45bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)拷貝數(shù)變異的方法，其特征在于，所述多重PCR引物對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度范圍為12(Tl000bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)拷貝數(shù)變異的方法，其特征在于，所述LDR測(cè)序探針對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物的長(zhǎng)度范圍為7(T200bp。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)拷貝數(shù)變異的方法，其特征在于，所述的多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物含一到二十五對(duì)針對(duì)不同待測(cè)基因的待測(cè)區(qū)段引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)拷貝數(shù)變異的方法，其特征在于，所述的多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物由一對(duì)到二十對(duì)針對(duì)不同待測(cè)基因的待測(cè)區(qū)段引物和一對(duì)到六對(duì)參照引物組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)拷貝數(shù)變異的方法，其特征在于，所述的多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物由一對(duì)到十對(duì)針對(duì)不同待測(cè)基因的待測(cè)區(qū)段引物和一對(duì)到三對(duì)參照引物組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)拷貝數(shù)變異的方法，其特征在于，所述的測(cè)序探針由四色突光標(biāo)記。
9.一種基于權(quán)利要求I所述的檢測(cè)拷貝數(shù)變異的方法的試劑盒，包括提供多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物由至少一對(duì)待測(cè)區(qū)段引物和至少一對(duì)參照區(qū)段引物組成、定量的內(nèi)對(duì)照DNA、LDR熒光標(biāo)記測(cè)序探針、和/或多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR的反應(yīng)的試劑、和/或LDR測(cè)序反應(yīng)的試劑。
10.權(quán)利要求9所述的試劑盒在檢測(cè)人類(lèi)基因拷貝數(shù)變異中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于通用熒光引物的多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR檢測(cè)拷貝數(shù)變異的方法，包括下列步驟(1)提供多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物，由至少一對(duì)待測(cè)區(qū)段引物和至少一對(duì)參照區(qū)段引物組成；(2)提供競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)對(duì)照模板，內(nèi)對(duì)照模板序列與實(shí)際序列在序列中僅有一個(gè)堿基替換；(3)多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR反應(yīng)；(4)LDR反應(yīng)；和(5)數(shù)據(jù)分析。本發(fā)明還提供基于以上檢測(cè)方法的試劑盒，適用于5~25個(gè)基因/反應(yīng)的拷貝數(shù)變異的檢測(cè)，是一種快速、中通量、經(jīng)濟(jì)的拷貝數(shù)變異檢測(cè)方案。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102978280SQ20121043210
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月1日
發(fā)明者陸炯, 肖君華, 陳軼群 申請(qǐng)人:上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司