專利名稱：利用三氯甲烷篩選楊桃細菌性斑點病菌拮抗菌的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用三氯甲烷篩選楊桃細菌性斑點病菌拮抗菌的方法，屬于農(nóng)作 物病害生物防治技術的領域。
背景技術：
楊桃細菌性斑點病是由楊桃細菌性斑點病原細菌(/^ei/i/offloaas syringae)侵染 引起的一種病害。楊桃(Averrhoa carambola L.)系酢漿草科，屬于熱帶、亞熱帶常綠喬 木果樹。在我國廣東、海南等省普遍栽種。近年，在廣東、海南兩省一些楊桃種植園或苗圃 發(fā)現(xiàn)一種導致嚴重落葉的葉斑病，切取葉片病斑組織作顯微鏡檢查，發(fā)現(xiàn)有細菌溢流，認為 是一種細菌性病害，當時該病害在國內(nèi)外尚未見報道，因此，有必要對該病害進行研究，為 防治該病提供理論依據(jù)(文衍堂，黃智輝，1995)。在臺灣，本病害于1997年11月在苗栗縣 卓蘭鎮(zhèn)首次被發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過全臺灣主要楊桃產(chǎn)區(qū)調(diào)查結(jié)果，目前僅在栗縣卓蘭鎮(zhèn)、臺中縣東勢 鎮(zhèn)、石網(wǎng)鄉(xiāng)、新社鄉(xiāng)、南投縣國姓鄉(xiāng)及彰化縣員林鎮(zhèn)等地發(fā)生。楊桃細菌性斑點病全年發(fā)生，可感染葉片、枝條以及果實，但以葉片最為嚴重。葉 片患病時，初期產(chǎn)生暗綠色水浸狀斑點。以后擴大為紫紅色的斑點，病斑周圍有明顯的黃色 暈環(huán)，嚴重時葉片黃化并提前落葉。枝條患病時，呈暗褐色壞疽斑點。果實患病時，初期產(chǎn) 生紫褐色大小不一的壞疽病斑，病斑周圍有黃色暈環(huán)，嚴重時果實畸形。該病的傳染途徑 患病的葉片、枝條以及果實為主要感染源，病原菌可借由雨水飛濺傳播，并經(jīng)由氣孔以及傷 口侵入感染，因此，春雨、梅雨以及臺風季節(jié)本病發(fā)生較為嚴重。傳統(tǒng)的防治方法是利用化學藥品經(jīng)行噴灑，常用藥品為73%鋅波爾多可濕性粉 劑，85%堿性氯化銅可濕性粉劑，68. 8%多保鏈霉素可濕性粉劑，4-4式波爾多液73%可濕性 粉劑，以及40%銅快得寧可濕性粉劑等。但這些化學制劑容易在果實上殘留，對人體有一定 的危害性，同時在土壤里也有一定的殘留量。為解決農(nóng)藥帶來的影響，各國學者都在研究如 何采用生物防治來替代藥物防治。其中最常見的就是采用無害的拮抗菌對病原菌進行抑 制，從而抵抗該病的發(fā)生，提高農(nóng)作物的產(chǎn)量，實現(xiàn)無農(nóng)藥殘留。目前常用的拮抗菌篩選方法是采用試管混菌平板涂布法初篩后再用管碟法(趙 麗先，2004)復篩，用瓊脂移塊法篩選，濾紙片法，對峙培養(yǎng)法等。但這些方法耗時較長，將拮 抗菌與病原菌同時接入培養(yǎng)基時，有時會由于病原菌的生長較快而蓋過拮抗菌，還可能在 拮抗菌未釋放出抑制物時，就已被病原菌蓋過。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術中楊桃細菌性斑點病菌拮抗菌篩選所需時間長，篩選效果不穩(wěn)定等 問題，本發(fā)明提供了一種利用三氯甲烷篩選楊桃細菌性斑點病菌拮抗菌的方法，該方法易 于操作、耗時較短且結(jié)果較穩(wěn)定。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案包括先對試樣菌株進行培養(yǎng)，而后通 過三氯甲烷進行熏蒸，再接上病原菌培養(yǎng)，然后根據(jù)抑菌圈大小篩選拮抗菌。
具體步驟如下
(1)菌株培養(yǎng)
用接種環(huán)將試樣菌株接種在NA培養(yǎng)基平板的中央，28°C條件下倒扣培養(yǎng)72h;菌株分 別接3個皿進行平行篩選；
(2)楊桃細菌性斑點病菌的培養(yǎng)
將楊桃細菌性斑點病菌接種于200mL LB液體培養(yǎng)基中，在28°C，160r/min條件下振蕩 培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后用無菌水調(diào)整至濃度為IO8CfuAiL的楊桃細菌性斑點病菌菌液；
(3)三氯甲烷熏蒸
在新的皿蓋中倒入3mL三氯甲烷，將已培養(yǎng)的菌株平板倒扣在皿蓋上，熏蒸8-lOmin， 將皿蓋打開，棄去余液；
(4)接病原菌菌液
將楊桃細菌性斑點病菌菌液涂布于熏蒸過的菌株平皿上，28°C倒扣培養(yǎng)48h，觀察抑菌 圈，根據(jù)抑菌圈大小篩選拮抗菌。抑菌圈大小為抑菌圈外徑扣去培養(yǎng)的拮抗菌的半徑，抑菌圈越大說明拮抗效果越 好，平行實驗誤差大小不大于0. 25cm。平行實驗結(jié)果穩(wěn)定。一般情況下，抑菌圈> 2. 2抑菌 效果較好。本發(fā)明采用先對拮抗菌培養(yǎng)一段時間，讓其成分在培養(yǎng)基中釋放代謝物質(zhì)，而后 通過三氯甲烷將其熏死，再接上病原菌培養(yǎng)，觀察其生長情況。該方法能為楊桃細菌性斑點 病菌的拮抗菌篩選提供快速有效的方法，為楊桃細菌性斑點病害的生物防治奠定有利的實 驗基礎，對進一步研究該病害的生物防治方法有十分重要的意義。本發(fā)明有益效果本發(fā)明方法適用于楊桃細菌性斑點病菌以及其他病原細菌的拮 抗菌的快速篩選，對于楊桃細菌性斑點病害的生物防治具有重要的實用價值。本發(fā)明與現(xiàn) 有技術相比，具有以下的技術優(yōu)勢和積極的效果
1、效果穩(wěn)定本發(fā)明對楊桃細菌性斑點病菌拮抗菌的篩選結(jié)果穩(wěn)定，重復性較好。2、操作簡便快速應用本發(fā)明方法，對病原細菌拮抗菌的篩選，所用儀器藥品簡 單，操作簡易，一般整個篩選過程5天便可以觀察結(jié)果。專用于對楊桃細菌性斑點病菌等病 原細菌的拮抗細菌進行篩選，操作簡易、快速，能在較短時間內(nèi)篩選出其拮抗細菌，效果穩(wěn) 定。


圖1為實施例1所篩選的楊桃細菌性斑點病菌拮抗菌的抑菌圈大小圖。
具體實施例方式實施例1
(1)對可能的拮抗菌的培養(yǎng)
用接種環(huán)將試樣菌株 ZB-77、ZB-80、ZB-82、ZB-88、ZB-95、ZB-142、ZB-178 接種在 NA 培 養(yǎng)基平板的中央，28°C條件下倒扣培養(yǎng)72h ；菌株分別接3個皿進行平行篩選；
(2)楊桃細菌性斑點病菌的培養(yǎng)
將楊桃細菌性斑點病菌接種于200mL LB液體培養(yǎng)基中，28°C，160r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后將用無菌水調(diào)整至濃度為IO8CfuAiL的菌液；
(3)利用三氯甲烷熏蒸已培養(yǎng)的拮抗菌
在新的皿蓋中倒入3mL三氯甲烷，將已培養(yǎng)的試樣菌株平板倒扣在皿蓋上，熏蒸 8-lOmin，將皿蓋打開，棄去余液；
(4)接病原菌菌液
將稀釋過的楊桃細菌性斑點病菌菌液涂布于熏蒸過的試樣菌株平皿上，28°C倒扣培養(yǎng) 48h，觀察抑菌圈。抑菌圈大小平均值分別為ZB-77為1. 8cm、ZB-80為1. 5cm、ZB-82為 2. 9cm、ZB-88 為 2. 25cm、ZB_95 為 2. 95cm、ZB_142 為 1. 9cm、ZB_178 為 1. 3cm。由圖 1 可見 ZB-82、ZB-88、ZB-95的抑菌圈較大、且清晰，抑菌效果較好。上述涉及菌株均保藏在福建省 農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所分子病理實驗室。
權利要求
1.一種利用三氯甲烷篩選楊桃細菌性斑點病菌拮抗菌的方法，其特征在于所述方法采用先對試樣菌株進行培養(yǎng)，而后通過三氯甲烷進行熏蒸，再接上病原菌培 養(yǎng)，然后根據(jù)抑菌圈大小篩選拮抗菌。
2.根據(jù)權利要求1所述的利用三氯甲烷篩選楊桃細菌性斑點病菌拮抗菌的方法，其特 征在于所述方法的具體步驟如下(1)菌株培養(yǎng)用接種環(huán)將試樣菌株接種在NA培養(yǎng)基平板的中央，28°C條件下倒扣培養(yǎng)72h;菌株分 別接3個皿進行平行篩選；(2)楊桃細菌性斑點病菌的培養(yǎng)將楊桃細菌性斑點病菌接種于200mL LB液體培養(yǎng)基中，在，160r/min條件下振蕩 培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后用無菌水調(diào)整至濃度為IO8CfuAiL的楊桃細菌性斑點病菌菌液；(3)三氯甲烷熏蒸在新的皿蓋中倒入3mL三氯甲烷，將已培養(yǎng)的菌株平板倒扣在皿蓋上，熏蒸8-lOmin， 將皿蓋打開，棄去余液；(4)接病原菌菌液將楊桃細菌性斑點病菌菌液涂布于熏蒸過的菌株平皿上倒扣培養(yǎng)48h，觀察抑菌 圈，根據(jù)抑菌圈大小篩選拮抗菌。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用三氯甲烷對篩選楊桃細菌性斑點病菌拮抗菌的方法，該方法采用先對菌株培養(yǎng)一段時間，讓其成分在培養(yǎng)基中釋放代謝物質(zhì)，而后通過三氯甲烷將其熏死，再接上病原菌培養(yǎng)，觀察其生長情況。此法可用于病原細菌有效穩(wěn)定的篩選，為楊桃細菌性斑點病害的生物防治奠定基礎，提供可靠的技術和理論依據(jù)。
文檔編號C12N1/04GK102071142SQ201010582969
公開日2011年5月25日 申請日期2010年12月10日 優(yōu)先權日2010年12月10日
發(fā)明者蘭成忠, 李本金, 李煒, 林靜, 翁啟勇, 陳慶河 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所