專利名稱：作為乳腺癌標志的基因galnt6和針對基因galnt6的小干擾rna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，具體而言本發(fā)明涉及癌癥治療和診斷領(lǐng)域。 特別是本發(fā)明涉及由新基因573WiV編碼的乳腺癌相關(guān)新多肽。進而，本發(fā) 明涉及新基因573^W。本發(fā)明的基因和多肽，例如可以用于乳腺癌的診斷 中，作為抗病藥物開發(fā)的靶標分子，以及用于減弱乳腺癌的細胞生長。
背景技術(shù)：
乳l^癌是一種遺傳上異質(zhì)的疾病(genetically heterogeneous disease), 它 是在女性中最為常見的惡性胂瘤。全世界每年報道的推測的新發(fā)病例約為 800,000例(Parkin DM.等，(1999) CA Cancer J Clin 49: 33-64)。目前，對于該 疾病的治療，在同時并用的選擇方案中，乳房切除術(shù)是首選的治療方案。 然而，即便手術(shù)切除了原發(fā)性腫瘤，由于診斷時存在不能檢出的微小轉(zhuǎn)移 (SaphnerT.等，(1996) J Clin Oncol 14, 2738-2746),在局部或遠端部位復(fù)發(fā)。 為了殺死這樣的殘留細胞或癌前細胞，通常在手術(shù)后作為輔助療法施用細 胞毒劑。使用傳統(tǒng)的化學(xué)治療劑的治療常常依賴于經(jīng)驗，其主要是基于組織學(xué) 的肺瘤參數(shù)，而缺乏對具體機制的認識。因而，靶向性藥物正逐漸成為針對乳腺癌的基本治療。他莫昔芬(Tamoxifen )和芳香酶抑制劑是此類藥物 的2個代表，將其作為輔劑或化學(xué)預(yù)防劑適用于患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者， 獲得了良好的反應(yīng)(Fisher B.等(1998) J Natl Cancer Inst 90， 1371-88; Cuzick J (2002) Lancet 360， 817-24)。然而，其缺點是只有表達雌激素受體的患者 才對這些藥物敏感。最近，人們對其副作用的關(guān)注程度有所提高，這些副 作用明顯集中在長期的他莫昔芬治療引發(fā)子宮內(nèi)膜癌的可能性和對接受芳 香酶治療的絕經(jīng)后女性中骨折的有害作用(Coleman RE (2004) Oncology. 18(5 Suppl 3)， 16-20)。因為副作用和耐藥性的產(chǎn)生，基于特征明確的作用機制探索和鑒定選 擇性智能(smart)藥物的新分子靶標，現(xiàn)在已經(jīng)十分必要。為了實現(xiàn)該目 標，本發(fā)明人解析了包括8例DCIS和69例IDC的77例乳腺腫瘤的表達模 式(expression profile),其中通過激光孩i束顯微解剖(laser microbeam microdissection, LMM )和相當于27648個基因的cDNA微陣列的組合進行 純化。由這些實驗獲得的數(shù)據(jù)，不僅應(yīng)當是提供了乳腺腫瘤形成相關(guān)的重 要信息，而且對于候選基因的鑒定是非常重要的，所述候選基因的產(chǎn)物可 作為診斷標記和/或與乳腺癌治療相關(guān)的分子靶標起作用。在本發(fā)明中，本發(fā)明人通過乳腺癌的表達模式分離了在乳腺癌細胞中 顯著過高表達的新基因B7330N,而且，進一步通過半定量RT-PCR和 Northern印跡分析確認了 B7330N在乳腺癌細胞中是過高表達的。本發(fā)明人 發(fā)現(xiàn)，采用siRNA治療乳腺癌細胞可以有效抑制B7330N的表達，顯著抑 制乳腺癌的細胞/腫瘤生長?？傊?，本發(fā)明人提出，B7330N，又稱GL4丄iVr(5, 是用于診斷標記和乳腺癌藥物開發(fā)的卓越的新候選分子。旨在揭示癌癥發(fā)生機制的研究工作促進了抗腫瘤劑分子靶標的鑒定。 例如，在動物模型中，法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)可有效治療Ras依賴性腫 瘤(SunJ等，(1998) Oncogene 16:1467-73.),當初開發(fā)該抑制劑的目的是為 了抑制活化依賴于翻譯后法尼基化的Ras相關(guān)的生長信號傳導(dǎo)途徑。類似 地，使用抗癌藥物、以拮抗原癌基因受體HER2/neu為目的的抗HER2單克 隆抗體和trastuzumab的組合對人體進行的臨床測定，改善了乳腺癌患者的 臨床反應(yīng)和總存活(MolinaMA,等，(2001) Cancer Res.;61(12):4744-9.)。此外， 已經(jīng)開發(fā)出能夠選擇性失活bcr-abl融合蛋白的酪氨酸激酶抑制劑STI-571 以治療慢性髓性白血病，在所述慢性髓性白血病中，bcr-abl酪氨酸激酶的 組成型活化在白細胞轉(zhuǎn)化中起著至關(guān)重要的作用。這些種類的藥物被設(shè)計 成用于抑制具體基因產(chǎn)物的致癌活性(O'Dwyer ME & Druker BJ. (2000) Curr Opin Oncol.;12(6):594-7)。因此，在癌細胞中通常上調(diào)的基因產(chǎn)物顯然可以 成為開發(fā)新抗癌劑的潛力靶標。已證實，CD8+細胞毒T淋巴細胞(CTL)能識別MHC I類分子上呈遞的 腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的表位肽并裂解腫瘤細胞。自發(fā)現(xiàn)首例TAA即MAGE 家族以來，采用免疫學(xué)手段已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多其它的TAA (Boon, (1993) Int JCancer 54: 177-80; Boon and van der Bruggen, (1996) J Exp Med 183: 725-9; van der Bruggen等，(1991) Science 254: 1643-7; Brichard V等，(1993) J Exp Med 178: 489-95; Kawakami Y等，(1994) J Exp Med 180: 347-52.)。目前，正 作為免疫療法的靶標對一些新發(fā)現(xiàn)的TAA進行臨床開發(fā)。迄今為止所發(fā)現(xiàn) 的TAA包括MAGE (van der Bruggen等，(1991) Science 254: 1643-7), gplOO (Kawakami Y等，(1994) J Exp Med 180: 347-52), SART (Shichijo S等，(1998) J Exp Med 187: 277-88)和NY-ESO-1 (Chen YT等，(1997) Proc Natl Acad Sci USA94: 1914-8)。另一方面，經(jīng)證實在腫瘤細胞中特異性過高表達的基因產(chǎn) 物可以作為誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答的靶標被識別。這樣的基因產(chǎn)物包括p53 (Umano Y等，(2001) Brit J Cancer 84: 1052-7) ， HER2/neu (Tanaka H等，(2001) Brit J Cancer 84: 94-9)， CEA (Nukaya I等，(1999) Int J Cancer 80: 92-7)等。盡管已在與TAA有關(guān)的基礎(chǔ)和臨床研究中取得顯著進步(Rosenberg SA等，(1998) Nature Med 4: 321畫7.; Mukherji B等，(1995) Proc Natl Acad Sci USA92: 8078-82.; HuX等，(1996) Cancer Res 56: 2479-83.),但目前可以使 用的能治療腺癌、包括結(jié)腸直腸癌的候選TAA的數(shù)目仍然很有限。在癌細 胞中大量表達且其表達局限于癌細胞中的TAA被認為是理想的候選免疫治 療靶標。此外，鑒定能誘導(dǎo)有效而特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答的新型TAA有 望促進在臨床上針對多種類型的癌癥使用肽接種策略(Boon and van der Bruggen, (1996) J Exp Med 183: 725-9.; van der Bruggen等，(1991) Science 254: 1643-7.; Brichard V等，(1993) J Exp Med 178: 489-95.; Kawakami Y等， (1994) J Exp Med 180: 347-52.; Shichijo S等，(1998) J Exp Med 187: 277-88.; Chen YT等，(1997) Proc Natl Acad Sci USA 94: 1914-8.; Harris CC， (1996) J Natl Cancer Inst 88: 1442-5.; Butterfield LH等，(1999) Cancer Res 59: 3134-42.; Vissers JL等，(1999) Cancer Res 59: 5554-9.; van der Burg SH等，(1996) J Immunol 156: 3308-14.; Tanaka F等，(1997) Cancer Res 57: 4465-8.; Fujie T 等，(1999) Int J Cancer 80: 169-72.; Kikuchi M等，(1999) Int J Cancer 81: 459-66.; OisoM等，(1999) Int J Cancer 81: 387-94.)。據(jù)多篇文獻報道，源自某些健康供體的經(jīng)肽刺激的外周血單個核細胞 (PBMC)應(yīng)答于該肽而產(chǎn)生顯著水平的IFN-a,但很少在"Cr-釋放測定中以 HLA-A24或A0201限制性方式對腫瘤細胞發(fā)揮細胞毒性(Kawano K等， (2000) Cancer Res 60: 3550-8.; Nishizaka S等，(2000) Cancer Res 60: 4830-7.;TamuraM等，(2001) Jpn J Cancer Res 92: 762-7.)。然而，與在白種人群中相 同，在日本人中，HLA-A24和HLA-A0201兩者均是常見的HLA等位基因 (Date Y等，(1996) Tissue Antigens 47: 93-101.; Kondo A等，(1995) J Immunol 155: 4307畫12.; Kubo RT等，(1994) J Immunol 152: 3913-24.; Imanishi T等， (1992) Proceeding of the eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference Oxford University Press, Oxford, 1065.; Williams F等，(1997) Tissue Antigen 49: 129.)。因此，由這些HLA呈遞的癌癥抗原肽對于治療日 本人和白種人人群的癌癥特別有用。另外，已知使用高濃度的肽通?？稍?體外誘導(dǎo)低親和力的CTL，由此在抗原呈遞細胞(APC)上產(chǎn)生高水平的特異 性肽/MHC復(fù)合物，這些復(fù)合物將有效激活這些CTL(Alexander-Miller MA 等，(1996) Proc Nat! Acad Sci USA 93: 4102-7.)。發(fā)明概述為了分離用于乳腺癌治療的新分子靶標，本發(fā)明人通過應(yīng)用cDNA微 陣列和激光微束顯孩吏解剖(laser microbeam microdissection, LMM )的組合， 考察了 77例閉經(jīng)前乳腺癌病例的精確的全基因組表達模式。在上調(diào)的基因 中，本發(fā)明人鑒定了 B7330N，又稱UDP-N-乙酰-a-D-半乳糖胺:多肽N-乙 酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶6 ( UDP-N-acetyl-alpha-D-Galactosamine: polypeptide N誦acetylgalactosaminyltransferase 6， 04丄iV:n5),其在本發(fā)明人能夠獲得表達 數(shù)據(jù)的77例乳腺癌病例中的27例(35%)中超過3倍過高表達。其后，通 過半定量RT-PCR也確認與包括乳房導(dǎo)管細胞或正常乳房在內(nèi)的正常人 器官相比較，在12例臨床乳腺癌樣品中的7例和20例乳腺癌細胞中的7 例中B7330N是上調(diào)的。Northern印跡分析表明B7330N轉(zhuǎn)錄物僅在乳腺 癌細胞系以及正常的人胎盤、胰臟、胃、氣管、乳腺和骨髓中表達。免疫 細胞化學(xué)染色顯示外源性B7330N的亞細胞定位在COS7細胞中以分泌小 泡(secretion vesicles )內(nèi)的顆粒(granulous )圖樣出現(xiàn)。向COS7細胞進行 B7330NcDNA的誘導(dǎo)，引起基因產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基，造成細胞生長的提高。 用小干擾RNA (siRNA)處理乳腺癌細胞有效阻礙B7330N的表達，同時 還抑制乳腺癌細胞系T47D和BT-20的細胞/腫瘤生長，這些事實提示該基 因以其自分泌形態(tài)在細胞生長和增殖方面起重要的作用。這些證據(jù)綜合提示B7330N是用于分子靶標療法開發(fā)的有希望的候選物質(zhì)，并且可以作為乳腺癌患者相關(guān)的卓越的診斷用腫瘤標志發(fā)揮作用。B7330N編碼由622個氨基酸構(gòu)成的蛋白。Northern印跡分析表明 B7330N的表達限于乳腺癌細胞系及正常的人胎盤、胰臟、胃、氣管、乳腺和骨髓。許多抗癌劑不僅對癌細胞，對正常生長的細胞也具有毒性。但是，基 于B7330N的表達限于正常的人胎盤、胰臟、胃、氣管、乳腺和骨髓的事實， 抑制B7330N的表達的物質(zhì)可能不給其它器官造成有害影響，因此可簡便地 用于乳腺癌的治療或預(yù)防。因而，本發(fā)明提供分離的基因5733(W,其是乳腺癌診斷標志的候選， 同時還是開發(fā)用于診斷的新策略和有效的抗癌劑的有希望的潛在靶標。進 一步，本發(fā)明在提供由該基因編碼的多肽的基礎(chǔ)上，還提供其生產(chǎn)和用途。 更具體地，本發(fā)明提供在乳腺癌細胞中表達上升的新人類多肽B7330N或其 功能等價物。在優(yōu)選的方式中，B7330N多肽包含622個氨基酸的蛋白，所述蛋白由 SEQ ID NO: 24或26的可讀框編碼。B7330N多肽優(yōu)選包含SEQ ID NO:25 所示的氨基酸序列。此外，本發(fā)明還提供下述分離的蛋白，其由B7330N多 核苷酸序列的至少一部分編碼，或者由與SEQ ID NO:24或26所示的序列 至少15°/。、優(yōu)選至少25%互補的多核苷酸序列編碼。本發(fā)明進一步提供新人類基因B7330N，其表達在大部分乳腺癌中與對 應(yīng)的非癌性乳房導(dǎo)管上皮相比顯著增加。分離的B7330N基因包含SEQ ID NO:24或26記載的多核普酸序列。特別是B7330N cDNA包含4381或4556 個核苷酸(SEQ ID NO:24或26)，其中包括1869個核苷酸的可讀框。本 發(fā)明還包含與SEQ ID NO:24或26所示的多核苷酸序列雜交、且與其至少 15%優(yōu)選25%互補的多核苷酸。這樣的多核苷酸的例子是由SEQ ID NO:24 或26的序列編碼的B7330N的簡并體(degenerate )和等位基因突變體(allelic mutant)。本說明書中，分離的基因是指一類多核苷酸，該多核苷酸的結(jié)構(gòu)不與 任何天然多核苷酸的結(jié)構(gòu)相同、也不與任何跨越超過3個獨立基因的天然 基因組多核苷酸的片段相同。因此，該術(shù)語包括例如(a )如下所述的DNA: 其具有天然生物基因組中之天然基因組DNA分子的部分序列；(b)如下 所述的多核苦酸其^皮納入原核生物或真核生物載體或基因組DNA中，由此產(chǎn)生的分子不與任何的天然載體或基因組DNA相同；(c)獨立的分子， 例如cDNA、基因組片段、由聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生的片段或限制性 片段；和(d)重組核苷酸序列，其為雜合基因(即編碼融合多肽的基因) 的一部分。因而在一個方案中，本發(fā)明提供編碼本說明書記載的多肽或其片段的 分離的多核苷酸。優(yōu)選地，分離的多核苷酸包含與SEQIDNO:24或26所 示的核苦酸序列至少60°/。同一的核苷酸序列。更優(yōu)選地，分離的核酸分子 與SEQIDNO: 24或26所示的核香酸序列至少65°/。、 70%、 75%、 80%、 85°/。、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或以上同一。 當分離的多核苷酸比參照序列(例如SEQ ID NO:24或26 )長或與之等長時， 其與參照序列的全長進行比較；而當分離的多核苷酸比參照序列短，例如 比SEQ ID NO:24或26短時，則與參照序列中相同長度的片段(除去同源 性計算所需的任何環(huán))進行比較。本發(fā)明還提供蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，該方法通過用編碼B7330N蛋白的多 核苷酸序列轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細胞，并表達該多核苷酸序列。進一步，本發(fā) 明還提供載體和宿主細胞，所述載體包含編碼B7330N蛋白的核苷酸序列， 所述宿主細胞含有編碼B7330N蛋白的多核苷酸。這樣的載體和宿主細胞可 以用于生產(chǎn)B7330N蛋白。本發(fā)明還提供特異性識別B7330N蛋白的結(jié)合劑。例如，結(jié)合劑可以是 針對B7330N蛋白激發(fā)產(chǎn)生的抗體。此外，結(jié)合劑可以是該蛋白的特異性配 體或與該蛋白特異性結(jié)合的合成多肽(參考例如WO2004/044011 )。此外， 本發(fā)明還提供B7330N基因的反義多核苷酸(例如反義DNA )、核酶和siRNA (小干護LRNA)。本發(fā)明進一步提供乳腺癌的診斷方法，該方法包括下述步驟確定來 自受試者的生物樣品中基因的表達水平；將5基因的表達水平與正常 樣品中的表達水平進行比較；以及定義樣品中B733^W基因的高表達水平表 示受試者患有乳腺癌或存在罹患乳腺癌的風險。本發(fā)明進一步提供用于乳腺癌的治療或預(yù)防的化合物的篩選方法。該 方法包括下述步驟使受試化合物與B7330N多肽接觸；并選擇與B7330N 多肽結(jié)合或者抑制其生物活性的受試化合物。本發(fā)明進一步提供用于乳腺癌的治療或預(yù)防的化合物的篩選方法。該方法包括下述步驟使受試化合物與表達B733^W多肽的細胞或?qū)肓嗽趫?道基因的上游含有5733(W轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的載體的細胞接觸；以及選擇抑制報 道基因的表達水平或活性的受試化合物。本發(fā)明還提供用于乳腺癌的治療或預(yù)防的化合物的篩選方法。該方法 包括下述步驟使受試化合物與B7330N多肽或表達B7330N多肽的細胞接 觸；以及選擇抑制B7330N多肽的糖基化水平的受試化合物。在這些實施方 案中，糖基化水平是指B7330N多肽的天冬酰胺476的糖基化水平。本申請還提供用于治療或預(yù)防乳腺癌的藥物組合物。藥物組合物可以 是例如抗癌劑。藥物組合物可以包含針對分別顯示及記載于SEQ ID NO:24 或26的B7330N多核苷酸序列的反義S-寡核苦酸、siRNA分子或核酶的至 少一部分。適宜的siRNA靶標是SEQIDNO:18或22的序列。因此，本發(fā) 明的siRNA含有來自SEQ ID NO:18或22的核香S吏序列。優(yōu)選的，可選擇 其作為本發(fā)明的用于治療或預(yù)防乳腺癌的靶標。藥物組合物可以包含這樣 的化合物，該化合物是通過本發(fā)明的治療或預(yù)防乳腺癌等細胞增殖性疾病 的化合物的篩選方法選出的。理想地，藥物組合物的作用途徑抑制乳腺癌等癌細胞的生長。藥物組 合物可以適用于包含人和家畜的哺乳動物。本發(fā)明進一步提供使用由本發(fā)明提供的藥物組合物治療或預(yù)防乳腺癌 的方法。本發(fā)明進一步提供治療或預(yù)防癌癥的方法，其包括施用B7330N多肽的 步驟。期望通過施用B7330N多肽誘導(dǎo)抗腫瘤免疫。因此，本發(fā)明還提供包 含施用B7330N多肽步驟的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，以及含有B7330N多肽 的用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物。以上的發(fā)明概要以及以下的詳細說明均是優(yōu)選方式，應(yīng)該理解的是 這并非是對本發(fā)明或本發(fā)明的其它替代方式的限制。


圖1圖1顯示了半定量RT-PCR和Northern印跡分析的結(jié)果。(a)乳 腺癌患者來源的腫瘤細胞和正常人組織，(b )在乳腺癌細胞系(HBC4, HBC5 HBL-100, HCC1937, MCF畫7， MDA-MB-231, SKBR3， T47D, YMB1 (上圖)， BT-20, BT-474, BT-549, HCC1143， HCC1500, HCC1599, MDA-MB-157,MDA-MB-435s, MDA-MB-453, OCUCB-F和ZR-75-l (下圖))中和乳腺中 B7330N的表達。各種人組織(c)和乳腺癌細胞系及正常人生命器官(d) 中的B7330N轉(zhuǎn)錄物的Northern印跡分析。圖2圖2 (a)顯示了外源性B7330N蛋白的亞細胞定位。圖2 (b)顯 示了通過Western印跡分析獲得的B7330N蛋白的外源表達。圖3圖3 (a)顯示了對B7330N蛋白的N-糖苦酶(N-glycosydase )處 理。圖3(b)顯示了細胞裂解物中野生型B7330N、 N476A突變體和N611A 突變體的Western印跡分析。圖3 (c)顯示了 N-糖基化對B7330N蛋白的 分泌的影響。圖4顯示了 T47D細胞和BT-20細胞中設(shè)計為減少B7330N表達的小干 擾RNA (siRNA)的生長抑制效果。圖4 (a)顯示半定量RT-PCR結(jié)果， 所述半定量RT-PCR顯示在乳腺癌細胞系T47D和BT-20中B7330N的內(nèi)源 性表達的抑制。G^PDi/用作內(nèi)部對照。圖4 (b)顯示MTT測定結(jié)果，所 述MTT測定顯示T47D細胞和BT-20細胞中B7330N的敲低(knock down ) 引起集落數(shù)的減少。圖4 (d)顯示集落形成測定結(jié)果，所述集落形成測定 顯示T47D細胞和BT-20細胞中B7330N的敲低引起集落數(shù)的減少。圖5顯示了 B7330N的自分泌作用的檢測。a:與不含B7330N的培養(yǎng) 基中的COS7細胞相比，含有B7330N的培養(yǎng)基中的COS7培養(yǎng)物的細胞生 長增強。b:暴露于抗B7330NpAb后，乳腺癌細胞生長減弱。細胞暴露于 濃度為10.2jig/mL的免疫前兔IgG或抗fflG2pAb5天。直方圖顯示由3次 實驗求得的平均值士SD。圖6顯示B7330N蛋白的同源二聚體化。用模擬、pCAGGS-B7330N-HA 和pcDNA3.1-B7330N-myc轉(zhuǎn)染的COS-7細月包的免疫沉淀分析。圖7乳腺癌細胞系和組織切片中B7330N的表達。a:通過使用了親和 純化抗B7330N抗體的Western印跡分析獲得的乳&i癌細胞系中內(nèi)源性 B7330N蛋白的表達，其與HMEC細胞系進行了比較。b:使用抗B7330N 抗體(紅色)和DAPI (藍色)對兩種乳腺癌細胞系——SKBR3和T47D進 行免疫細胞化學(xué)染色以區(qū)分細胞核(參考材料及方法部分)。c:對乳腺癌 (571T和164T )和正常乳房(425N)組織切片進行免疫組織化學(xué)染色的結(jié) 果。使用抗B7330NpAb對內(nèi)源性B7330N蛋白進行了染色?；旧衔礄z出 來自正常乳房組織(425N)的表達，但在包括導(dǎo)管內(nèi)組織(164T)和乳頭管狀(papillo-tubular)組織(571T)在內(nèi)的所有被3金癌組織中，癌細胞的細胞 質(zhì)均被強染色。代表性圖片為顯微鏡下的觀察結(jié)果，原始放大倍率，上圖 為x100，下圖為x200。 d:正常生命器官的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。使用 抗B7330NpAb抗體對內(nèi)源性B7330N蛋白進行了染色。在心臟、肺、肝、 腎及胰臟均未發(fā)現(xiàn)表達。圖8NIH3T3細胞中的外源性B7330N的生長促進效果。a:高水平表達 外源性B7330N的細胞或用模擬載體轉(zhuǎn)染的細胞的Western印跡分析。使用 抗帶HA標簽單克隆抗體確認了 B7330N表達的外源性導(dǎo)入。P-肌動蛋白用 作上樣對照。b: NIH3T3-B7330N細胞的體外生長。WT-B7330N (WT-B7330N 一#1和-弁2)和模擬(NIH3T3-Mock41和-#2)轉(zhuǎn)染的NIH3T3細胞，通過MTT 測定測量。
具體實施方式
除非另有說明，本說明書中使用的詞語"一個"或"一種"或"該" 是指至少一個或至少一種。應(yīng)該理解在本說明書和權(quán)利要求書的范圍內(nèi)， 除非上下文另有需要，詞語"包括"、"包含"或"含有"包括示出的實 體(integer)或步驟(step)、或者實體或步驟的群(group)，但也不排除 其它任何實體或步驟、或者實體或步驟的群。本發(fā)明人結(jié)合全基因組cDNA微陣列和激光微束顯微解剖，分析了乳 腺癌中基因的表達模式，以揭示乳腺癌的機制，并鑒定用于治療和/或預(yù)防 這些腫瘤的新診斷標記和/或藥物靶標。其結(jié)果，鑒定了在乳腺癌細胞中特 異性過高表達的B7330N。進一步，通過小干擾RNA(siRNA)抑制B7330N 基因的表達，引起了癌細胞的顯著生長抑制。這些認識提示B7330N賦予 癌細胞致癌活性，并且抑制這些蛋白活性可以成為乳腺癌等增殖性疾病的 治療和預(yù)防的有望策略。B7330N本發(fā)明提供B7330N基因。B7330N的cDNA由4381或4556個核苷酸 構(gòu)成(SEQ ID NO:24或26; GenBank Accession No. AB265820 ),其中包 括1869個核香酸的可讀框。該可讀框編碼622個氨基酸的蛋白。因此，本發(fā)明提供由前述基因編碼的、基本上純的多肽，包括含有SEQID NO:25所示氨基酸序列的多肽，或其功能等價物，只要其編碼B7330N 蛋白。與B7330N功能上等價的多肽的例子包括，例如，其它生物中與人 B7330N蛋白對應(yīng)的同源蛋白，以及人B7330N蛋白的突變體。在本發(fā)明中，術(shù)語"功能上等價"是指對象多肽具有如B7330N蛋白的 促進細胞增殖活性及賦予癌細胞致癌活性的活性。將編碼對象多肽的DNA 導(dǎo)入細胞并表達各多肽，然后檢測細胞增殖的增強或集落形成活性的提高， 可以判斷對象多肽是否具有細胞增殖活性。這樣的細胞例如包括NIH3T3, COS7和HEK293。與給定蛋白質(zhì)功能上等價的多肽的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知 的，包括向蛋白質(zhì)導(dǎo)入突變的常規(guī)方法。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過定 點誘變向人B733ON蛋白的氨基酸序列中導(dǎo)入適當?shù)耐蛔?，制備出與這些蛋 白功能上等價的多肽(Hashimoto-Gotoh " a/.， Gene 152:271-5 (1995); Zoller and Smith, Methods Enzymol 100: 468-500 (1983); Kramer & Nucleic Acids Res. 12:9441-56 (1984); Kramer and Fritz, Methods Enzymol 154: 350-67 (1987); Kunkel， Proc Natl Acad Sci USA 82: 488-92 (1985); Kunkel， W a/" Methods Enzymol 204: 125-39(1991))。氨基酸突變也可自然發(fā)生。在獲得的 突變多肽與人B7330N蛋白功能上等價的前提下，本發(fā)明的多肽還包括具有 一個或多個氨基酸殘基發(fā)生了突變的人B7330N蛋白的氨基酸序列的蛋白 質(zhì)。這些突變體中發(fā)生突變的氨基酸的數(shù)目一般為10個氨基酸以下，優(yōu)選 為6個氨基酸以下，更優(yōu)選為3個氨基酸以下。已知突變的蛋白或修飾的蛋白，即具有在給定氨基酸序列中取代、缺 失、插入和/或添加一個或多個氨基酸殘基而被修飾的氨基酸序列的蛋白， 保留原來的生物活性(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-5666(1984); Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10: 6487-6500(1982); Dalbadie畫McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-6413(1982》。優(yōu)選將待突變的氨基酸殘基突變?yōu)楸Ａ舭被醾?cè)鏈性質(zhì)的其它氨基酸 (該過程即公知的保守氨基酸取代)。氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)的例子包括疏水氨基酸 (A, I, L, M, F， P， W， Y, V)、親水氨基酸(R， D， N, C, E， Q， Q H, K, S, T)以及具有 以下官能團或共有特性的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(QA，V，L,I，P);含羥基側(cè)鏈(S, T, Y);含疏原子側(cè)鏈(C, M);含羧酸和酰胺側(cè)鏈(D， N, E, Q);含堿(base)側(cè)鏈(R， K， H)和含芳香族側(cè)鏈(H, F, Y， W)。需說明的是括號中的字母表示氨基 酸的單字母符號。在本發(fā)明中，B7330N蛋白的優(yōu)選功能等價物保留了其糖基化位點。例 如，已經(jīng)確認B7330N蛋白在476N處發(fā)生糖基化。因此，在優(yōu)選的方式中， B7330N蛋白的功能等價物由在同源序列中包含476N或與476N同源的氨基 酸序列構(gòu)成。通過比較氨基酸序列，可以確定B7330N蛋白的功能等價物的 氨基S吏序列、與第476位同源的位置。在所關(guān)注的蛋白中的位置不一定是476 位。例如，如果是具有因一個或多個氨基酸殘基發(fā)生取代、缺失、插入和/ 或添加而被修飾的B7330N蛋白的結(jié)構(gòu)的蛋白，其同源位置可以是476位以外 的位置。在這樣的蛋白中，為了確定與B7330N蛋白中的476位同源的位置， 必要時可以通過在兩氨基酸序列中插入適當?shù)目瘴粊肀葘傻鞍椎陌被?序列，以使彼此的氨基酸以及具有相似性質(zhì)的氨基酸盡可能一致。這樣， 就可以確定所關(guān)注的對象蛋白中與B733ON蛋白中的476位同源的位置的相 應(yīng)位置。這樣的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，可以容易地使用商品化的 或公開的計算機軟件，例如分析軟件GENETYX-MACVER. 10(Software)等 進行。在人B7330N蛋白的氨基酸序列中添加一個或多個氨基酸殘基所得的多 肽的例子是含有人B7330N蛋白的融合蛋白。本發(fā)明包括人B7330N蛋白與其 它肽或蛋白質(zhì)的融合物即融合蛋白。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)即可 制備融合蛋白，例如通過將編碼本發(fā)明的人B7330N蛋白的DNA與編碼其它 肽或蛋白的DNA連接，使得讀碼框一致，然后將融合DNA插入表達載體并 在宿主中表達所述融合DNA。對于與本發(fā)明的蛋白融合的肽或蛋白沒有限 制。可以用作與本發(fā)明蛋白融合的已知肽的肽包括例如FLAG (Hopp et al.， (1988) Biotechnology 6: 1204-10)、含有6個His (組氨酸)殘基的6xHis、 10xHis、 流感病毒凝集素(HA)、人c-myc片段、VSP-GP片段、pl8HIV片段、T7-標簽、 HSV-標簽、E-標簽、SV40T抗原片段、lck標簽、a-微管蛋白片段、B-標簽、 蛋白C片段等?？梢耘c本發(fā)明的蛋白融合的蛋白的例子包括GST (谷胱甘肽 -S-轉(zhuǎn)移酶)、流感病毒凝集素(HA)、免疫球蛋白恒定區(qū)、P-半乳糖苷酶、MBP (麥芽糖-結(jié)合蛋白)等。通過將編碼上述融合肽或蛋白的可商購的DNA與編碼本發(fā)明的多肽的 DNA融合，并表達所制備的融合DNA,即可制備出融合蛋白。本領(lǐng)域公知的分離功能等價多肽的方法有，例如，使用雜交技術(shù)的方 法(Sambrook d a/.， (1989)Molecular Cloning 2nd ed. 9.47-9,58, Cold Spring Harbor Lab. Press)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地分離出與編碼人B7330N蛋白 的DNA序列(即SEQ ID NO: 24或26)的全部或部分具有高度同源性的DNA, 并且由分離的DNA分離與人B7330N蛋白功能上等價的多肽。本發(fā)明的多肽 包括由與編碼人B7330N蛋白的DNA序列的全部或部分雜交的DNA編碼的、 功能上等價于人B7330N蛋白的多肽。這些多肽包括對應(yīng)于人源蛋白的哺乳 動物同源物(例如由猴、大鼠、兔和?；蚓幋a的多肽)。在從動物中分離與 編碼人B7330N蛋白的DNA高度同源的cDNA時，特別優(yōu)選使用乳腺癌細胞 以及來自正常人的胎盤、胰臟、胃、氣管、乳腺和骨髓的組織。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以按常規(guī)選擇用于分離編碼與人B7330N蛋白功能上 等價的多肽的DNA的雜交條件。例如雜交可通過如下方式進行使用 "Rapid-hyb緩沖液"(Amersham LIFE SCIENCE)于68。C預(yù)雜交30分鐘或更長 時間，加入標記的4笨針，并在68。C保溫1小時或更長時間。其后的洗滌步驟， 例如可以在低度嚴緊條件下進行。低度嚴緊條件為，例如42。C 、 2xSSC、 0.1% SDS,或優(yōu)選50。C、 2xSSC、 0.1°/。SDS。更優(yōu)選使用高嚴緊條件。高嚴緊條 件為，例如室溫下用2xSSC、 0.01% SDS洗滌3次、每次20分鐘，然后于37 。C用lxSSC、 0.1。/oSDS洗滌3次，每次20分鐘，再于50。C用lxSSC、 0.1% SDS 洗滌2次、每次20分鐘。然而，幾種因素，如溫度和鹽濃度會影響雜交的嚴 緊度，本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當選擇這些因素以獲得所需的嚴緊度?？梢圆捎没驍U增法，例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法代替雜交來分離編碼 與人B7330N蛋白功能上等價的多肽的DNA,所述基因擴增法使用基于編 碼蛋白的DNA的序列信息(SEQ ID NO: 24或26)合成的引物。由通過上述雜交技術(shù)或基因擴增技術(shù)分離的DNA編碼的、與人B7330N 蛋白功能上等價的多肽一般與人B7330N蛋白的氨基酸序列具有高度同源 性。本說明書中使用的術(shù)語"高度同源性" 一般指多肽或多核苷酸序列與 參照序列之間的同源性為40%或更高，優(yōu)選為60%或更高，更優(yōu)選為80%或 更高，更優(yōu)選85%、 90%、 93%、 95%、 98%、 99°/?；蚋?。百分比同源性(又 稱百分比同一性)通常在兩個最優(yōu)比對的序列之間測定。為了進行比較而比對序列的方法是本技術(shù)領(lǐng)域公知的。序列的最佳比對和比較可例如使用"Wilbur and Lipman, (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:726-30 "中的算法進 行。本發(fā)明的多肽在氨基酸序列、分子量、等電點、存在或不存在糖鏈或 形式等方面有差異，這取決于用于產(chǎn)生所述多肽的細胞或宿主或者采用的 純化方法。無論如何，只要該多肽具有等價于本發(fā)明的人B7330N蛋白的功 能，就落入本發(fā)明的范圍。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法可以以重組蛋白或天然蛋白的形式制 備本發(fā)明的多肽。采用下述方法可以制備重組蛋白將編碼本發(fā)明多肽的 DNA (例如含有SEQ ID NO: 24或26所示核普酸序列的DNA)插入適當?shù)谋?達載體，將載體導(dǎo)入適當?shù)乃拗骷毎?，獲得提取物，然后對提取物進行層 析以純化多肽，所述層析包括例如離子交換層析、反相層析、凝膠過濾、 或利用固定有抗本發(fā)明蛋白抗體的柱子的親和層析，或多于一種所述柱的 組合。此外，當在宿主細胞(例如動物細胞和大腸桿菌)中以與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移 酶蛋白所成的融合蛋白的形式、或者以添加了多個組氨酸的重組蛋白的形 式表達本發(fā)明的多肽時，可以使用谷胱甘肽柱或鎳柱純化所表達的重組蛋 白?；蛘撸斠詭-myc、多個組氨酸或FLAG標簽的蛋白的形式表達本發(fā) 明的多肽時，可以分別使用針對c-myc 、 His或FLAG的抗體進行檢測和純化。純化融合蛋白之后，根據(jù)需要也可以通過用凝血酶或Xa因子切割融合 蛋白來除去目的多肽之外的區(qū)域。可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法分離出天然蛋白，所述方法例如 使后述的結(jié)合有可與B7330N蛋白結(jié)合的抗體的親和柱與表達本發(fā)明多肽的 組織或細胞的提取物接觸?？贵w可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明還包括本發(fā)明的多肽的部分肽。部分肽具有本發(fā)明多肽特有的 氨基酸序列，并由至少7個、優(yōu)選至少8個或更多、更優(yōu)選至少9個或更多氨 基酸組成。部分肽例如可以用于制備抗本發(fā)明多肽的抗體、篩選與本發(fā)明 多肽結(jié)合的化合物以及篩選本發(fā)明多肽的抑制劑。通過基因工程、已知的肽合成法或用適當?shù)碾拿赶景l(fā)明的多肽， 均可以產(chǎn)生本發(fā)明的部分肽。例如，肽合成可以采取固相合成或液相合成。本發(fā)明還提供編碼上述B7330N多肽的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可以用于體內(nèi)或體外產(chǎn)生上述本發(fā)明多肽，或者可以用于由本發(fā)明蛋白編碼 基因的基因異常所致疾病的基因治療?？梢允褂帽景l(fā)明多核苷酸的任何形式，包括mRNA、 RNA、 cDNA、基因組DNA和化學(xué)合成的多核苷酸，只要 其編碼本發(fā)明的多肽。本發(fā)明的多核香酸包括含有給定核苷酸序列及其簡 并序列的DNA,只要所得的DNA編碼本發(fā)明多肽。可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備本發(fā)明的多核苷酸。例如可 以采用以下方法制備本發(fā)明的多核苷酸由表達本發(fā)明多肽的細胞制備 cDNA文庫，然后以本發(fā)明的DNA(侈')如SEQ ID NO: 24或26)的部分序列為探 4十進4亍雜交。采用Sambrook ef a/" Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)中所述的方法可以制備cDNA文庫；或者可以使用可 商購的cDNA文庫。還可以采用下述方法制備cDNA文庫從表達本發(fā)明多 肽的細胞中提取RNA，基于本發(fā)明DNA的序歹'J(例如SEQ ID NO: 24或26)合 成寡聚DNA，以寡聚DNA為引物進行PCR，擴增編碼本發(fā)明的蛋白的cDNA。另外，通過對所得cDNA的核苷酸進行測序，可以常規(guī)地確定由cDNA 編碼的翻譯區(qū)，這樣就可以容易地獲得本發(fā)明多肽的氨基酸序列。而且， 通過以所得cDNA或其部分作為探針篩選基因組DNA文庫，可以分離出基因 組DNA。更具體地，可以從表達本發(fā)明的對象多肽的細胞、組織、器官(例如乳 腺癌細胞以及正常人的胎盤、胰臟、胃、氣管、乳腺和骨髓)中首先制備 mRNA?？梢圆捎霉姆椒ǚ蛛xmRNA;例如，總RNA的制備可以采用胍 超離心法(Chirgwin d a/" (1979) Biochemistry 18:5294-9)或AGPC法 (Chomczynski and Sacchi， (1987) Anal Biochem 162:156-9)。另外，可以4吏用 mRNA純化試劑盒(Pharmacia)等由總RNA純化mRNA?；蛘?，可以使用 QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia)直4妄純化mRNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶從獲得的mRNA合成cDNA。可以使用可商購的試劑盒， 如AMV逆轉(zhuǎn)錄酶cDNA第 一鏈合成試劑盒(Seikagaku Kogyo)等合成cDNA。 或者，可以使用本說明書所述引物等、5，-Ampli FINDER RACE試劑盒 (Clontech)和聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR),采用5'-RACE法(Frohman W a/., Proc Natl Acad Sci USA 85: 8998-9002 (1988); Belyavsky " Nucleic Acids Res 17: 2919-2932(1989))合成和擴增cDNA。由PCR產(chǎn)物制備所需DNA片段,.并與載體DNA連接。使用重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌等，由選出的菌落制備所需的重組載體。采用常規(guī)方法，如雙脫氧核苷酸鏈終止法驗證所需DNA的核苷酸序列?？紤]待用表達宿主中密碼子使用的頻率，可以將本發(fā)明多核苷酸的核 苷酸序列設(shè)計成能夠更有效地表達的形式(Grantham " a/., Nucleic Acids Res 9: 43-74 (1981))?？梢允褂每缮藤彽脑噭┖谢虺^方法改變本發(fā)明的多核苷 酸的序列。例如，可以通過用限制性酶消化、插入合成的寡核苷酸或適當 的多核苷酸片段、添加接頭或插入起始密碼子(ATG)和/或終止密碼子(TAA, TGA或TAG)的方式改變序列。具體地說，本發(fā)明的多核苷酸包括含有SEQIDNO: 24或26所示核苷酸 序列的DNA。此外，本發(fā)明提供在嚴緊條件下與具有SEQIDNO: 24或26所示核苷酸 序列的多核苷酸雜交、并且編碼與上述的本發(fā)明B7330N蛋白功能上等價的 多肽的多核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適宜地選擇合適的嚴緊條件。例如， 可以采用低嚴緊條件。優(yōu)選可采用高嚴緊條件。這些條件與前述的條件相 同。上述的雜交DNA優(yōu)選為cDNA或染色體DNA。本發(fā)明還提供與編碼人B7330N蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO: 24或26) 或其互補鏈互補，并含有至少15個核香酸的多核香酸。本發(fā)明的多核苷酸 優(yōu)選為與編碼本發(fā)明的B7330N多肽的DNA特異性雜交的多核苷酸。本文 使用的術(shù)語"特異性雜交"指在通常的雜交條件下、優(yōu)選在嚴緊的雜交條 件下不與編碼其它蛋白的DNA發(fā)生明顯的交叉雜交(cross-hybridization)。 這樣的多核苷酸包括與編碼本發(fā)明多肽的DNA或其互補鏈特異性雜交的探 針、引物、核苦酸和核苦酸衍生物(例如，反義寡核苷酸和核酶)。此外，這 樣的多核香酸可以用于制備DNA芯片。載體和宿主細胞本發(fā)明還提供導(dǎo)入了本發(fā)明的多核苷酸的載體和宿主細胞。本發(fā)明的 載體可以用于在宿主細胞中維持本發(fā)明的多核苷酸、尤其是DNA,以表達本發(fā)明多肽，或者用于施用本發(fā)明的多核苷酸以供基因治療。當宿主細胞為大腸桿菌，并且在大腸桿菌(如JM109， DH5oc， HB101或 XL 1 Blue)中大量擴增和制備載體時，載體應(yīng)具有用于在大腸桿菌中擴增的 "ori"和用于選擇轉(zhuǎn)化大腸桿菌的標記基因(例如通過藥物，如氨節(jié)青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、氯霉素等選擇的藥物抗性基因)。例如，可以使用M13 系列栽體、pUC系列載體、pBR322、 pBluescript、 pCR-Script等。另外，與 上述載體相同，pGEM-T、pDIRECT和pT7也可以用于亞克隆和提取cDNA。 當使用載體制備本發(fā)明的蛋白時，表達載體是特別有用的。例如，在大腸 桿菌中表達的表達載體須具備上述特征，以便在大腸桿菌中擴增。當將大 腸桿菌，如JM109，DH5ot,HB101或XLlBlue用作宿主細胞時，載體應(yīng)具有 在大腸桿菌中有效表達所需基因的啟動子，例如lacZ啟動子(Ward et al.， Nature 341: 544-546(1989); FASEB J 6: 2422-2427(1992))、 araB啟動子(Better etal.， Science 240: 1041-1043(1988))、 T7啟動子等。在這方面，可以4吏用例 如pGEX陽5X-l (Pharmacia) 、 "QIAexpress系統(tǒng),，(Qiagen)、 pEGFP和pET (此 時，宿主優(yōu)選為表達T7RNA聚合酶的BL21)來替代上述載體。另外，載體 也可以含有用于多肽分泌的信號序列。指導(dǎo)多肽分泌至大腸桿菌周質(zhì)的例示性信號序列為pelB信號序列(Lei W "/.， J Bacteriol 169: 4379(1987))。將載 體導(dǎo)入耙宿主細胞的方法包括例如氯化鉀法和電穿孔法。除大腸桿菌外，可以使用下述載體制備本發(fā)明多肽例如源自哺乳動 物的表達載體(例如pcDNA3 (Invitrogen)和pEF-BOS (Mizushima S and Nagata S, (1990) Nucleic Acids Res 18(17): 5322)、 pEF、 pCDM8),源自昆蟲 細胞的表達載體(例如"Bac-to-BAC桿狀病毒表達系統(tǒng)"(GIBCO BRL), pBacPAK8)，源自植物的表達載體(例如pMHl， pMH2),源自動物病毒的表 達載體(例如pHSV, pMV, pAdexLcw)，源自逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達載體(例如 pZIpneo),源自酵母的表達載體(例如"畢赤酵母(Pichia)表達試劑盒" (Invitrogen)， pNVll, SP-Q01)以及源自枯草芽孢桿菌CBa"7/ws wte'fc)的表達 載體(如pPL608, pKTH50)。為了在動物細胞，如CHO, COS或NIH3T3細胞中表達載體，載體應(yīng)具 有在所述細胞中進行表達所必需的啟動子，例如SV40啟動子(Mulligan " a/.: Nature 277: 108 (1979))、 MMLV-LTR啟動子、EFla啟動子(Mizushima "a/., Nucleic Acids Res 18: 5322(1990))、 CMV啟動子等，并優(yōu)選具有用于選擇轉(zhuǎn) 化子的標記基因(例如通過藥物(例如新霉素、G418)進行選擇的藥物抗性基 因)。具有這些特征的已知載體的例子包括例如pMAM、 pDR2、 pBK-RSV、 pBK-CMV、 pOPRSV和pOP13。產(chǎn)生多肽另外，本發(fā)明提供產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法。多肽可以通過培養(yǎng)攜帶表 達載體的宿主細胞來制備，其中所述表達載體含有編碼所述多肽的基因。根據(jù)需要，可以采用本方法在穩(wěn)定地表達基因的同時，在擴增細胞中基因的拷貝數(shù)。例如，可以將含有互補性(complementary) DHFR基因的載體(例 如pCHO I)導(dǎo)入核酸合成途徑缺失的CHO細胞，然后利用曱氨蝶呤(MTX) 擴增該載體。另外，當瞬時表達基因時，可以采用如下方法用含有SV40 復(fù)制起點的載體(pcD等)轉(zhuǎn)化染色體上含有SV40 T抗原表達基因的COS細胞。按上述方法獲得的本發(fā)明多肽可分離自宿主細胞的內(nèi)部或外部(如培養(yǎng) 基)，并被純化成基本上純的均質(zhì)多肽。本說明書中使用的與給定多肽有關(guān) 的術(shù)語"基本上純的"是指多肽基本上不含有其它生物大分子?；旧霞?的多肽以干重表示為至少75%(例如至少80°/。、 85%、 95%或99%)純?？刹?用任何適當?shù)臉藴史椒▉頊y定純度，所述方法例如柱層析、聚丙烯酰胺凝 膠電泳或HPLC分析。多肽的分離和純化方法并不局限于任何特定的方法， 實際上可以采用任何標準方法。例如，可以適當選擇和組合柱層析、過濾、超濾、鹽析、溶劑沉淀、 溶劑提取、蒸餾、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點電泳、透 析和重結(jié)晶等方法，進行多肽的分離與純化。層析的例子包括例如親和層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、 反相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak et al.， Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996))。這些層析可通過液相色i普，例如HPLC和FPLC來 進行。因此，本發(fā)明提供通過上述方法制備的高純度多肽?？扇芜x地通過在純化前和/或純化后用適當?shù)牡鞍仔揎椕柑幚肀景l(fā)明多 肽來對其進行修飾或部分缺失。有用的蛋白修飾酶包括但不限于胰蛋白酶、 胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、賴氨酰內(nèi)肽酶、蛋白激酶、葡糖苷酶等?？贵w本發(fā)明提供與本發(fā)明多肽結(jié)合的抗體。本發(fā)明的抗體可以作為任意形 式，如單克隆或多克隆抗體使用，并包括用本發(fā)明的多肽免疫動物如兔獲得的抗血清、所有種類的多克隆抗體和單克隆抗體，人抗體和通過基因重 組制備的人源化抗體。作為抗原使用以獲得抗體的本發(fā)明多肽，可源自任何動物物種，但優(yōu) 選源自哺乳動物，如人、小鼠或大鼠，更優(yōu)選源自人。人源多肽可以由本 發(fā)明公開的核苷酸或氨基酸序列獲取。根據(jù)本發(fā)明，用作免疫抗原的多肽可以是完整的蛋白，或者是蛋白的部分肽。部分肽可以包含例如本發(fā)明多肽的氨基(N)末端片段或羧基(C) 末端片段。在本說明書中，抗體定義為與本發(fā)明多肽的全長和/或片段反應(yīng)的蛋白。 可將編碼本發(fā)明多肽或其片段的基因插入已知的表達載體，然后用該載體轉(zhuǎn)化如本說明書所述的宿主細胞?？赏ㄟ^任意標準方法從宿主細胞內(nèi) 或細胞外回收所需多肽或其片段，然后可將其用作抗原。此外，表達多肽 的全細胞或其裂解物，或者化學(xué)合成的多肽均可用作抗原?？梢杂每乖庖呷我獠溉閯游?，但優(yōu)選考慮與用于細胞融合的親本細胞的相容性。通常使用嚙齒目(Rodentia)，兔形目(Lagomorpha)或靈長類 (Primates)動物。嚙齒目動物包括例如小鼠、大鼠和倉鼠(hamster)。兔形目動 物包括例如家兔。靈長類動物包括例如狹鼻猿(Catarrhini)(東半球猴(old world monkey))如食蟹猴(Macaca fascicularis)、恒河猴(rhesus monkey)、狒狒 (sacred baboon)和黑程猩(chimpanzee)。用抗原免疫動物的方法是本領(lǐng)域中已知的。腹腔注射或皮下注射抗原 是免疫動物的標準方法。更具體地，可以在適量的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、 生理鹽水等中稀釋和懸浮抗原。如果需要，將抗原懸液與適量的標準佐劑 如弗氏(Freund，s)完全佐劑混合，制成乳液，然后施用于哺乳動物。優(yōu)選其 后每4至21天施用數(shù)次與適量弗氏不完全佐劑混合的抗原。也可使用合適 的載體進行免疫。如上述進行免疫后，用標準方法檢驗血清中所需的抗體 量的增加?？梢园慈缦路椒ㄖ苽溽槍Ρ景l(fā)明多肽的多克隆抗體從經(jīng)檢測其血清 中所需的抗體增加的免疫哺乳動物收集血液，并通過任意常規(guī)的方法從所 述血液中分離血清。多克隆抗體包括含有多克隆抗體的血清，以及可以從 所述血清中分離含有該多克隆抗體的級分。使用例如與本發(fā)明多肽偶聯(lián)的 親和柱，并進一步用蛋白A或蛋白G柱純化該級分可乂人-f義識別本發(fā)明多肽的級分中制備免疫球蛋白G或M。為了制備單克隆抗體，從用抗原免疫的哺乳動物收集免疫細胞，如上 所述檢查血清中所需抗體水平升高，并用于細胞融合。用于細胞融合的免 疫細胞優(yōu)選獲自脾。其它與上述免疫細胞融合的優(yōu)選親本細力包包括例如哺 乳動物骨髓瘤細胞，更優(yōu)選獲得了用于藥物選擇融合細胞的性質(zhì)的骨髓瘤 細胞。#4居已知的方法，如Milstein等(Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46(1981))的方法可將上述免疫細胞和骨髓瘤細胞進行融合。在標準選擇培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基(含次黃嘌呤，氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng) 基)中進行培養(yǎng)，可以選出由細胞融合所得的雜交瘤。通常，細胞培養(yǎng)是在 HAT培養(yǎng)基中連續(xù)進行數(shù)天至數(shù)周，這段時間足以使除了所需的雜交瘤細 胞之外的所有其它細胞(非融合的細胞)死亡。然后，進行標準有限稀釋 (standard limiting dilution)篩選并克隆生產(chǎn)所需抗體的雜交瘤細胞。除了上述以抗原免疫非人動物制備雜交瘤的方法外，還可以在體外用 多肽、表達多肽的細胞或其裂解物來免疫人淋巴細胞，如EB病毒感染的淋 巴細胞。然后，使免疫后的淋巴細胞與能夠無限分裂的源自人的骨髓瘤細 胞，如U266融合，可以獲得產(chǎn)生能與所述多肽結(jié)合的期望人抗體的雜交瘤 細胞(特開昭63-17688)。然后將獲得的雜交瘤細胞移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。獲得的單克 隆抗體可以通過例如碌u酸4妄沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE離子交換層 析或偶聯(lián)了本發(fā)明多肽的親和柱進行純化。本發(fā)明的抗體不僅可以用于純 化和檢測本發(fā)明多肽，還可以作為本發(fā)明多肽的激動劑和拮抗劑的候選物。 此外，該抗體可以用于與本發(fā)明多肽相關(guān)的疾病的抗體治療。當將獲得的 抗體施用于人體時(抗體治療)，優(yōu)選使用人抗體或人源化抗體以降低免疫原 性。例如，可以使用選自多肽、表達多肽的細胞或其裂解物的抗原來免疫 具有人抗體基因庫(repertory)的轉(zhuǎn)基因動物。然后，從該動物收集產(chǎn)生抗體 的細胞，將其與骨髓瘤細胞融合以獲得雜交瘤，從該雜交瘤可制備針對所 述多肽的人抗體(參見WO92-03918， WO94-02602，WO94-25585,WO96-33735 和WO96-34096)。或者，可以通過癌基因使產(chǎn)生抗體的免疫細胞，如經(jīng)免疫的淋巴細胞永生化(immortalize),并用于制備單克隆抗體。如此獲得的單克隆抗體也可以利用基因工程技術(shù)重組制備(參見例如 Borrebaeck and Larrick, (1990) Therapeutic Monoclonal Antibodies, MacMillan Publishers LTD于英國出版)。例如，可以從免疫細胞，如產(chǎn)生抗體的雜交瘤 或經(jīng)免疫的淋巴細胞克隆編碼抗體的DNA，將該DNA插入合適的載體并 引入宿主細胞，從而制備重組抗體。本發(fā)明還提供如上所述制備的重組抗 體。此外，本發(fā)明的抗體可以是抗體片段或修飾的抗體，只要其結(jié)合一種 或多種本發(fā)明的多肽。例如，所述抗體片段可以是Fab、 F(ab，)2、 Fv或?qū)?自H鏈和L鏈的Fv片段通過合適的接頭連接而成的單鏈Fv (scFv) (Huston (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83)。更具體地，可以用酶如木 瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體以產(chǎn)生抗體片段?；蛘撸€可以構(gòu)建編碼該 抗體片段的基因，將其插入合適的表達載體，并在適合的宿主細胞中表達(參 見例如Co " a/" (1994) J Immunol 152: 2968-76; Better and Horwitz， (1989) Methods Enzymol 178: 476-96; Pluckthun and Skerra， (1989) Methods Enzymol 178: 497-515; Lamoyi, (1986) Methods Enzymol 121: 652-63; Rousseaux a (1986) Methods Enzymol 121: 663-9; Bird and Walker, (1991) Trends Biotechnol 9: 132-7)。抗體可以通過與各種分子如聚乙二醇(PEG)連接來進行修飾。本發(fā)明提 供這樣的修飾抗體?？赏ㄟ^將抗體進行化學(xué)修飾來獲得修飾抗體。這些修 飾方法是本領(lǐng)域常規(guī)的?？蛇x地，可以以嵌合抗體或人源化抗體的形式獲得本發(fā)明的抗體，所 述嵌合抗體為源自非人抗體的可變區(qū)與源自人抗體的恒定區(qū)之間的嵌合抗抗體的框架區(qū)(FR)和恒定區(qū)的人源化抗體。所述抗體可利用已知技術(shù)制備。 人源化可通過用嚙齒類的CDRs或CDR序列取代人抗體的相應(yīng)序列的方式 進行(見例如Verhoeyen W a/.， (1988) 5We"ce 239:1534-1536)。因而，這樣的 人源化抗體是嵌合抗體，其中實質(zhì)上小于完整人可變結(jié)構(gòu)域的區(qū)域已被來 自非人物種的相應(yīng)序列取代。除人框架區(qū)和恒定區(qū)外還包含人可變區(qū)的完整人抗體也是可以利用 的。這樣的抗體可利用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)制備。例如，體外方法包括使用在噬菌體上展示的人抗體片段的重組文庫(例如，Hoogenboom & Winter, (1992) J. Mol. Biol. 227:381-8)。類似地，可通過將人免疫球蛋白基因座引入 轉(zhuǎn)基因動物，例如內(nèi)源性免疫球蛋白基因部分或完全失活的小鼠，來制備 人抗體。該方法描述于例如美國專利Nos. 6,150,584; 5，545，807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016?？梢詫⑷缟汐@得的抗體純化至均質(zhì)。例如，可根據(jù)用于普通蛋白的分 離和純化方法進行抗體的分離和純化。例如，可以通過適當選擇和組合使 用柱層析如親和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電 〉永、等電聚焦，來分離抗體(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, (1988) Cold Spring Harbor Laboratory),但并不局卩艮于此。蛋白A 柱和蛋白G柱可以用作親和柱。例示性的可Y吏用的蛋白A柱包括例如Hyper D, POROS和Sepharose F.F. (Pharmacia)。除親和層析外，例示性的層析包括例如離子交換層析、疏水層析、 凝膠過濾、反相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al" (1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press)。可以通過液相層片斤，如HPLC 和FPLC進行層析程序。例如，可以采用吸光度測定、酶耳關(guān)免疫吸附測定(ELISA)、酶免疫測定合活性。在ELISA中，將本發(fā)明的抗體固定在平板上，將本發(fā)明多肽施加 到平板上，再施加含有所需抗體的樣品，如產(chǎn)生抗體的細胞的培養(yǎng)上清液 或純化的抗體。然后施加用酶(如堿性磷酸酶)標記的、識別第一抗體的第二 抗體，并溫育平板。接下來在洗滌后，在平板中加入酶底物如磷酸對硝基 苯酯，測定吸光度以評價樣品的抗原結(jié)合活性。多肽的片段，如C-末端或 N-末端片l殳可以用作抗原來評^f介抗體的結(jié)合活性?？梢允褂肂IAcore (Pharmacia)評價本發(fā)明抗體的活性。上述方法允許通過將本發(fā)明的抗體暴露于假定含有本發(fā)明多肽的樣 品，再檢測或測定由抗體和多肽形成的免疫復(fù)合物，來才企測或測定本發(fā)明 的多肽。因為本發(fā)明所述的檢測或測定多肽的方法可特異性地檢測或測定多 肽，所以該方法可應(yīng)用于使用多肽的各種實驗。反義多核苦酸、小干擾RNA及核酶本發(fā)明包括與SEQ ID NO: 24或26所示核苷酸序列內(nèi)的任意位點雜交 的反義寡核苷酸。這種反義寡核苷酸優(yōu)選針對SEQ ID NO: 24或26所示核 苷酸序列中至少15個連續(xù)的核苷酸。更優(yōu)選在上述至少15個連續(xù)的核苷 酸中含有起始密碼子的上述反義寡核苷酸。反義寡核苦酸的衍生物或修飾產(chǎn)物也可以用作反義寡核苷酸。所述修 飾產(chǎn)物的例子包括低級烷基膦酸酯(lower alkyl phosphonate)修飾如膦酸曱 酯型(methyl-phosphonate type)或膦酸乙酯型(ethyl畫phosphonate-type),石;U義石岸 酉吏酯(phosphorothioateyfi務(wù)飾以及氨基石岸酸酯(phosphoroamidate"l^牟。如本說明書中使用的術(shù)語"反義核酸"，不但指其中與構(gòu)成DNA或 mRNA —定區(qū)域的那些核苷酸對應(yīng)的核苦酸為完全互補的反義核酸，還指 具有一個或多個核苷酸錯配的核酸，只要DNA或mRNA及反義寡核苷酸 能與SEQ IDNO:24或26所示核苷酸序列特異性雜交。包括這樣的多核苷酸，它們在"至少15個連續(xù)核苷酸序列區(qū)域"內(nèi)， 具有至少約70%或更高、優(yōu)選至少約80%或更高、更優(yōu)選約至少90%或更 高、更優(yōu)選至少約95%或更高的同源性。所述同源性可使用本說明書記載 的算法確定.也可使用本領(lǐng)域已知的算法確定同源性。此外在本發(fā)明中，所 述反義寡核苦酸的衍生物或修飾產(chǎn)物也可以用作反義寡核香酸。所述修飾 產(chǎn)物的例子包括但不限于低級烷基膦酸酯修飾如膦酸曱酯型 (methyl-phosphonate type)或膦酸乙酉旨型(ethyl畫phosphonate畫type),石克 石舞酸酉旨 修飾以及氨基磷酸酯修飾。所述反義多核芬酸可用作分離或檢測編碼本發(fā)明多肽的DNA的探針， 或者作為用于擴增的引物。本發(fā)明的反義寡核苦酸衍生物通過如下方式作用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的 細胞與編碼本發(fā)明多肽的DNA或mRNA結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄或翻譯，促 進mRNA降解并抑制本發(fā)明多肽的表達，由此抑制該多肽的功能。此外，本發(fā)明還包括小干擾RNA(siRNA)，所述小干擾RNA包含SEQ ID NO:24或26所示核苷酸序列的有義鏈核酸和反義鏈核酸的組合。更具體 地，此類用于抑制B7330N表達的siRNA包括以SEQ ID NO:18或22所述 核苷酸序列為靶標的那些siRNA。術(shù)語"siRNA"指能阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子。采用標準技術(shù)，包括以DNA為RNA轉(zhuǎn)錄模板的技術(shù)，將siRNA導(dǎo)入細胞。siRNA含有編 碼人B7330N蛋白的多核苷酸(SEQIDNO:24或26)的有義核酸序列和反 義核酸序列。構(gòu)建siRNA以使單一轉(zhuǎn)錄物(雙鏈RNA)兼具來自耙基因的 有義序列和互補的反義序列(例如為發(fā)夾結(jié)構(gòu))。在靶細胞中，siRNA與對應(yīng)于B7330N的轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，導(dǎo)致由該細胞產(chǎn) 生的蛋白減少。寡核苷酸的長度為至少IO個核苷酸，可以與天然存在的轉(zhuǎn) 錄物等長。優(yōu)選寡核苷酸的長度為少于約75、約50、約25個核苷酸。更 優(yōu)選寡核苷酸的長度為約19至約25個核苷酸。抑制癌細胞生長的B7330N siRNA寡核苷酸的例子包括含有SEQ ID NO:18或22的靶序列。為了增強 siRNA的抑制活性，可以將核苦酸"u，，添加到耙序列反義鏈的3，端。添加的 "u，，的數(shù)目為至少約2 ，通常為約2-約10 ，優(yōu)選為約2-約5 。添加的"u"在siRNA 的反義鏈的3'端形成單鏈。B7330N siRNA以能與mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合的形式直接導(dǎo)入細胞。在這些 實施方案中，本發(fā)明的siRNA分子一般如上文對反義分子的描述進行修飾。 而其它的修飾也是可能的，例如膽固醇偶聯(lián)的siRNA顯示了改善的藥理學(xué) 性質(zhì)(Song d a/. 7Va&" 9:347-51 (2003))。或者，編碼B7330N siRNA 的DNA是在載體中。例如，通過將B7330N靶序列以兩條鏈均能表達(通過DNA分子的轉(zhuǎn) 錄)的形式克隆到表達載體中來制備上述載體，所述表達載體具有位于該靶 序列側(cè)翼的、可才喿作連接的調(diào)控序列(Lee， N.S., W (2002) Nature Biotechnology 20 : 500-5.)。與B7330N mRNA反義的RNA分子由第 一啟動 子(例如位于所克隆的DNA 3'側(cè)的啟動子序列)轉(zhuǎn)錄，作為B7330N mRNA 的有義鏈的RNA分子由第二啟動子(例如位于所克隆的DNA 5，側(cè)的啟動子 序列)轉(zhuǎn)錄。所述有義鏈和反義鏈在體內(nèi)雜交，從而產(chǎn)生用于沉默B7330N 基因的siRNA構(gòu)建體。或者，可以利用兩個構(gòu)建體生成siRNA構(gòu)建體的有 義鏈和反義鏈?？寺〉腂7330N可編碼具有二級結(jié)構(gòu)(例如發(fā)夾)的構(gòu)建體， 其中，單一轉(zhuǎn)錄物具有來自靶基因的有義序列和互補的反義序列。此外，為了形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，可在有義序列和反義序列之間放置由任 意核苦酸序列組成的環(huán)序列(loop sequence)。因此，本發(fā)明還提供具有通式 5'-[A]-[B]-[A，]-3，的siRNA,其中，[A]為核糖核苷酸序列，其對應(yīng)于與來自 B7330N基因的mRNA或cDNA特異性雜交的序列。在優(yōu)選的實施方案中，[A]為對應(yīng)于下述序列的核糖核香酸序列SEQ ID NO:24的417-435位或 SEQ ID NO:26的623 641位(SEQ ID NO: 18 )，以及SEQ ID NO:24的 1366~1384位或SEQ ID NO:26的1572~1590位(SEQ ID NO:22 )。 [B]為由約3~約23個核苦酸組成的核;瞎核香酸序列，和 [A，]是由[A]的互補序列組成的核糖核苷酸序列。所述環(huán)序列可以由長 度優(yōu)選為3-23個核苷酸的任意序列構(gòu)成。所述突環(huán)序列，例如可以選自由 如下序歹ij組成的組(http:〃www.ambion.com/ techlib/tb/tb—506.html)。在本發(fā)明 的siRNA中，為了增強siRNA的抑制活性，可以將核苷酸"u"添加到[A，]的 3，端。添加的"u"的數(shù)目為至少約2，通常為約2-約10，優(yōu)選為約2-約5。 此外，由23個核苷酸組成的環(huán)序列也提供活性siRNA (Jacque， J.-M.， " a/.， (2002) Nature 418: 435-8.)。CCC， CCACC或CCACACC: Jacque， J,M.， " a/.， Nature 418: 435-8 (2002);UUCG: Lee， N,S.， " a/.， (2002) Nature Biotechnology 20: 500-5. Fruscoloni, a/" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(4): 1639-44 (2003);和UUCAAGAGA: Dykxhoorn, D. M., a a/" Nature Reviews Molecular Cell Biology 4: 457-67 (2003)。例如，具有本發(fā)明的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的優(yōu)選siRNA如下所示。在下面的結(jié)構(gòu) 中，環(huán)序歹'J可以選自下組CCC， UUCG， CCACC, CCACACC和 UUCAAGAGA。優(yōu)選的環(huán)結(jié)構(gòu)是UUCAAGAGA (DNA中為"ttcaagaga")。gcacuguuucaaugccuuu-[B]-aaaggcauugaaacagugc (4十對SEQ ID NO: 18的 靶序列)gagaaauccuucggugaca-[B]-ugucaccgaaggauuucuc (針對SEQ ID NO: 22的靶序列)B7330N序列側(cè)翼的調(diào)節(jié)序列是相同的或者不同的，這樣它們的表達能 夠獨立地，或者以時間性或空間性方式被調(diào)控。通過將B7330N基因模板克 隆到載體上來在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA,其中所述載體含有例如來自小核RNA (snRNA) U6的RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄單元或人HI RNA啟動子。為了將載體 導(dǎo)入細月包，可以4吏用轉(zhuǎn)染增強劑(transfection陽enhancing agent)。 FuGENE (Roche diagnostices) ， Lipofectamine 2000 (Invitrogen) , Oligofectamine (Invitrogen)和Nucleofector (Wako pure Chemical)可以用作轉(zhuǎn)染增強劑。適當?shù)膕iRNA的核苷酸序列可使用能夠從Ambion網(wǎng)站 (http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNA一finder:html)i方問的siRNA i殳i十 計算機程序來設(shè)計。所述計算機程序基于如下規(guī)程選擇核苷酸序列用于 siRNA合成。選擇siRNA把位點1. 從目標轉(zhuǎn)錄物的AUG起始密碼子開始向下游掃描，尋找AA二核苷靶位點。Tuschl等在Gew^Dev 13(24): 3191-7 (1999)中，不推薦針對5'和3' 非翻譯區(qū)(UTRs)和鄰近起始密碼子的區(qū)域(75個堿基之內(nèi))設(shè)計siRNA,因為 上述區(qū)域可能更為富含調(diào)控蛋白結(jié)合位點。UTR結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復(fù) 合物可干擾siRNA內(nèi)切核酸酶復(fù)合物的結(jié)合。2. 將所述潛在靶位點與人基因組數(shù)據(jù)庫進行比較，將任何與其它編碼 序列顯著同源的靶序列排除在考慮之外?？刹捎肂LAST (Altschul SF， et. al.， Nucleic Acids Res. 1997; 25(17):3389-402.; J Mol Biol. 1990; 215(3):403-10) 進行同源性搜索，其可見于NCBI服務(wù)器www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。3. 選擇合格的靶序列用于合成。在Ambion，可優(yōu)選沿待評價的基因的 長度選擇幾個靶序列。采用標準方法，針對與B7330N mRNA的不同部分互補的寡核苷酸和寡 核普酸，在體外檢測它們降低腫瘤細胞中B7330N的產(chǎn)生的能力(例如使用 乳腺癌細胞系HBL國IOO， HCC1937， MCF-7， MDA-MB國435s, YMB1, SKBR3, T47D， BT-20, BT-474, BT-549, HCC1143, HCC1500, HCC1599, MDA-MB-157,MDA-MB453,OUCB-F,ZR-75-l)。使用B7330N特異性抗體 或采用其它檢測策略檢測到，與不存在候選siRNA組合物的情況下培養(yǎng)的 細胞相比，與所述候選siRNA組合物接觸的細胞中B7330N基因產(chǎn)物減少。 接著，對于在體外細胞測定或無細胞測定中減少B7330N產(chǎn)生的序列，進一 步測定它們對細胞生長的抑制作用。對于在體外細胞測定中抑制細胞生長 的序列，在大鼠或小鼠中進行體內(nèi)測定，以確認有惡性新生物的動物中 B7330N產(chǎn)生的減少和腫瘤細胞生長的降j氐。同樣地，本發(fā)明還包括含有靶序列的核酸序列的雙鏈分子，所述靶序 列例如SEQ ID NO:24的417 435位核苷酸或SEQ ID NO:26的623 641位 核香酸(SEQ ID NO:18 )，以及SEQ ID NO:24的1366~1384位核苷酸或SEQIDNO:26的1572~1590位核香酸(SEQIDNO:22)。在本發(fā)明中，雙 鏈分子包括有義鏈和反義鏈，其中所述有義鏈包含對應(yīng)于SEQ ID NO: 18 或22的核糖核苷酸序列，而所述反義鏈包含與所述有義鏈互補的核糖核苷 酸序列，其中所述有義鏈和所述反義鏈相互雜交形成所述雙鏈分子，且其 中所述雙鏈分子，當被導(dǎo)入表達B7330N基因的細胞時，抑制所述基因的表 達。在本發(fā)明中，當分離的核酸為RNA或其衍生物時，應(yīng)在核苷酸序列中 將堿基"t"替換為"u，，。本說明書中使用的術(shù)語"互補的"指核酸分子的核 苷酸單位之間形成Watson-Crick或Hoogsteen堿基配對。而術(shù)語"結(jié)合"指兩 核酸或化合物、或者相關(guān)核酸或化合物、或者其組合之間的物理或化學(xué)相 互作用?；パa的核酸序列在適宜條件下雜交，形成幾乎不含或不含錯配的穩(wěn)定 雙鏈體。此外，本發(fā)明的分離核苷酸的有義鏈和反義鏈可以通過雜交形成 雙鏈核香酸或發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選的實施方案中，這樣的雙鏈體的平均每 10個配對中含有的錯配不超過1個。在特別優(yōu)選的實施方案中，雙鏈體的 鏈完全互補，這樣的雙鏈不含錯配。核酸分子長度少于4381個核苷酸(對于 SEQ ID NO: 24)或4556個核苷酸(對于SEQ ID NO: 26)。例如，核酸分子的 長度短于500、 200、 75個核苷酸。本發(fā)明還包括包含一個或多個本說明書 中描述的核酸的載體，以及包含所述載體的細胞。對于針對B7330N的 siRNA或者編碼這些siRNA的DNA而言，本發(fā)明的分離核酸是有用的。將 這些核酸用于siRNA或其編碼DNA時，有義鏈優(yōu)選為長于約19個核苷酸， 更優(yōu)選長于約21個核苷酸。本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA抑制本發(fā)明多肽的表達，因而可以用 于抑制本發(fā)明多肽的生物學(xué)活性。并且，含有本發(fā)明的反義寡核苷酸或 siRNA的表達抑制劑，在其可以用于抑制本發(fā)明多肽的生物學(xué)活性這一點 上是有用的。因此，含有本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA的組合物可用于 治療乳腺癌。在哺乳動物中抑制表達的B7330N siRNA寡核苷酸的例子包括 含有SEQIDNO:18或22的靶序列。此外，為了增強siRNA的抑制活性， 可將核苷酸"u"添加到靶序列的反義鏈的3，端。要添加的"u"的數(shù)目為至少約 2個，通常為約2-約10個，優(yōu)選為約2-約5個。添加的"u"在siRNA的反 義鏈的3'端形成單鏈。此外，含有本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA的表達抑制劑，在其可以用于抑制本發(fā)明多肽的生物學(xué)活性這一點上是有用的。因此，含有本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA的組合物可用于治療細胞增殖性疾病，如乳腺癌。 此外，本發(fā)明提供抑制本發(fā)明B7330N多肽表達的核酶。 通常，核酶分為大核酶和小核酶。大核酶已知是切割核酸的磷酸酯鍵 的酶。與大核酶反應(yīng)后，反應(yīng)位點由5，-磷酸基團和3，-羥基基團組成。大核 酶進一步分為(l)催化鳥苷在5，-剪接位點的轉(zhuǎn)酯作用的第I組內(nèi)含子RNA; (2)催化經(jīng)由套索樣(lariat-like)結(jié)構(gòu)經(jīng)過兩步反應(yīng)自我剪接的第II組內(nèi)含子 RNA;和(3)通過水解在5'位點切割tRNA前體的核糖核酸酶P的RNA組分。 另一方面，小核酶與大核酶相比大小更小(約40bp)，其切割RNA產(chǎn)生5，-羥基和2，-3，環(huán)磷酸酯。錘頭型(Hammerhead type)核酶(Koizumi & a/.， FEBS Lett 228: 228-30 (1988))和發(fā)夾型核酶(Buzayan, Nature 323: 349-53 (1986); Kikuchi and Sasaki, Nucleic Acids Res 19: 6751-5 (1991))都包括在小核酶中。 設(shè)計和構(gòu)建核酶的方法是本領(lǐng)域中已知的(參見Koizumi & a/., FEBS Lett 228: 228-30 (1988); Koizumi W a/" Nucleic Acids Res 17: 7059-71 (1989); Kikuchi and Sasaki, Nucleic Acids Res 19: 6751-5 (1991))。因而，抑制本發(fā)明 多肽表達的核酶也可以根據(jù)其序列信息(SEQ ID NO:24或26)和這些常規(guī)方 法來構(gòu)建。針對S7B0iV基因的核酶抑制過高表達的B7330N蛋白的表達，因此有 用于抑制這些蛋白的生物活性。因此，這些核酶可以用于乳腺癌的治療或 預(yù)防。乳腺癌的診斷本發(fā)明提供以本發(fā)明基因的表達水平作為診斷標志，來診斷乳腺癌等 細胞增殖性疾病的方法。此外，本發(fā)明還提供通過確定來源于患者的生物 樣品，例如組織樣品中本發(fā)明的基因的表達水平，來確定受試者的乳腺癌 傾向性(predisposition)的方法。某基因的表達水平與該基因正常對照水平 相比發(fā)生變化，例如上升，說明受試者患有乳腺癌或存在罹患乳腺癌的風 險。在本發(fā)明的上下文中，"乳腺癌傾向性"包括受試者的下述狀態(tài)易 患(predisposed to)乳腺癌，具有乳腺癌的傾向(tendency )、患病率 (prevalence)、趨勢(inclination)或易感性(susceptibility)。此夕卜，該術(shù)語還包括受試者具有罹患乳腺癌的風險。該診斷方法包括下述步驟(a)檢測本發(fā)明的B7330iV基因的表達水平； 和(b)將表達水平的上升與乳腺癌相關(guān)聯(lián)。同樣地，在確定乳腺癌傾向性的 方法中適用與上述步驟相同的步驟。生物樣品中B7330N基因的表達水平可以通過定量B7330N基因?qū)?yīng)的 mRNA或由B7330N基因編碼的蛋白來加以評估。mRNA的定量方法是本 領(lǐng)域技術(shù)人員7>知的。例如，可以通過Northern印跡分析或RT-PCR來評 估對應(yīng)于"733(W基因的mRNA的水平。B7330N基因的全長核苷酸序列示 于SEQ ID NO: 24或26，因此任何本領(lǐng)域技術(shù)人員均能夠設(shè)計出用于定量 B7330N基因的探針或引物的核苷酸序列。此外，基于由B7330N基因編碼的蛋白的活性或量(quantity),也可以分 析該基因的表達水平。下面示出了一種測定B7330N蛋白量的方法。例如， 免疫測定法對于測定生物材料中的蛋白是十分有效的。只要乳腺癌患者的 樣品中表達標志基因(S733(W基因)，可以將任何生物材料用作測定蛋白或 其活性的生物樣品。例如，作為這樣的生物樣品，可以舉出乳房導(dǎo)管上皮。 而體液，如血液及尿液同樣可以用于分析。另一方面，可根據(jù)待分析的蛋 白的活性選擇適當?shù)姆椒▉頊y定由B7330N基因編碼的蛋白的活性。對生物樣品中的B733^V基因的表達水平進行評估，并與正常樣品(例 如來源于非患病受試者的樣品)中的表達水平相比較。當這樣的比較顯示靶 基因的表達水平比正常樣品中的表達水平高，則判定該受試者患有乳腺癌。 可以同時測定來自正常受試者和待i貪斷受試者的生物樣品中57W0iV基因 的表達水平。或者，可以采用統(tǒng)計學(xué)方法，基于分析從對照組預(yù)先采集的 樣品中基因表達水平獲得的結(jié)果，確定出表達水平的正常范圍。將由受試 者樣品獲得的結(jié)果與正常范圍進行比較而獲得結(jié)果，當該結(jié)果未落入正常 范圍時，即判定受試者患有乳腺癌或處于罹患乳腺癌的危險中。在本發(fā)明中，還提供診斷細胞增殖性疾病如乳腺癌的診斷試劑。本發(fā) 明的診斷試劑包含與本發(fā)明的多核苷酸或多肽結(jié)合的化合物。優(yōu)選地，與 本發(fā)明的多核苷酸雜交的寡核苷酸，或者與本發(fā)明多肽結(jié)合的抗體可用作 這樣的化合物。此外，可以-使用適體，例如RNA、 DNA或肽適體。本發(fā)明的乳腺癌診斷方法還可以用于評價受試者中乳腺癌治療的有效 性。根據(jù)本方法，從接受乳腺癌治療的受試者獲取生物樣品，例如受試細胞群體。評價方法可以按照公知的乳腺癌診斷方法進行。必要時，在治療前、治療中或治療后的不同時間點由受試者獲取生物樣品。然后確定生物樣品中573WiV基因的表達水平，并與對照水平相比較， 所述對照水平來自例如包含乳腺癌狀態(tài)(即癌性細胞或非癌性細胞)已知 的細胞的參照細胞群體。對照水平在未接受所述治療的生物樣品中確定。如果對照水平來源于不含癌性細胞的生物樣品，那么受試者來源的生 物樣品中的表達水平與對照水平之間的相似性表示所述的治療是有效的。 S7B0iV基因在受試者來源的生物樣品中的表達水平與對照水平之間的差 異，表示臨床效果或預(yù)后不理想。術(shù)語"有效的"表示治療引起受試者體內(nèi)病理性上調(diào)的基因(B7330iV 基因)的表達下降，或乳腺癌細胞的大小、患病率(prevalence)或增殖潛力 降低。當預(yù)防性施用所述的治療時，術(shù)語"有效的，，表明治療延遲或防止 乳腺癌的發(fā)生。乳腺癌的評價可以使用標準的臨床規(guī)程進行。此外，與任 何已知的診斷或治療乳腺癌的方法相結(jié)合來確定治療的有效性。此外，通過將來源于患者的生物樣品，如受試細胞群中57B^V基因的 表達水平與對照水平進行比較，診斷乳腺癌的本方法還可用于評價乳腺癌患者的預(yù)后。或者，可在一系列疾病階段中測定來源于患者的生物樣品中 B733^V基因的表達水平，以評價患者的預(yù)后。與正常對照水平相比，37B0iV基因的表達水平上升，則表示預(yù)后不理 想；而B7330N基因的表達水平與正常對照水平相似，則表示患者預(yù)后良好?；衔锏暮Y選可以利用573^W基因、該基因編碼的蛋白或該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，來 篩選改變該基因表達或該基因編碼多肽的生物活性的化合物。這樣的化合 物可以用作治療或預(yù)防乳腺癌的藥物。因此，本發(fā)明提供使用本發(fā)明多肽來篩選用于治療或預(yù)防乳腺癌的化 合物的方法。本篩選方法的一個實施方案包括下述步驟(a)使受試化合物 與本發(fā)明多肽接觸；(b)檢測受試化合物與本發(fā)明多肽之間的結(jié)合活性；和 (c)選擇與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物。本說明書中記載關(guān)于本發(fā)明多肽、多 核苷酸、載體和/或宿主細胞的所有實施方案，在進行必要改變后，同樣適 用于采用所述多肽、多核苷酸、載體和/或宿主細胞的本說明書所披露的篩選方法。用于篩選的本發(fā)明多肽可以是重組多肽，也可以是來源于天然的蛋白， 或它們的部分肽。與受試化合物相接觸的本發(fā)明多肽例如可以是純化的多 肽、可溶性蛋白、與載體結(jié)合的形態(tài)或與其它多肽融合的融合蛋白。作為蛋白的篩選方法，例如使用本發(fā)明多肽篩選與本發(fā)明多肽結(jié)合的 蛋白的方法，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的許多方法。這樣的篩選可通過， 例如免疫沉淀法，具體地以下述方式進行。通過將編碼本發(fā)明多肽的基因插入外源基因表達載體，如pSV2neo， pcDNA I, pcDNA3.1， pCAGGS和 pCD8，使之在宿主(例如動物)細胞等中表達。用于表達的啟動子可以是通 常使用的任何啟動子，包括例如SV40早期啟動子(Rigby in Williamson (ed.)， Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141 (1982》、EF國a啟 動子(Kim"a/"Gene91: 217-23 (1990》、CAG啟動子(Niwa "a/.， Gene 108: 193-9 (1991))、 RSV LTR啟動子(Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704 (1987))、 SRa啟動子(Takebe " a/" Mol Cell Biol 8: 466-72 (1988))、 CMV立 即早其月啟動子(CMV immediate early promoter) (Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9 (1987))、 SV40晚期啟動子(Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94 (1982))、腺病毒晚期啟動子(Adenovirus late promoter) (Kaufmans a/" Mol Cell Biol 9: 946-58 (1989))、 HSVTK啟動子等?？梢愿?據(jù)任何方法將基因?qū)胗磉_外源基因的宿主細胞，這些方法例如電穿孔 法(Chu d a/., Nucleic Acids Res 15: 1311-26 (1987))、磷酸鈣法(Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52 (1987》、DEAE葡聚糖法(Lopata "/ ， Nucleic Acids Res 12: 5707-17(1984); Sussman and Milman， Mol Cell Biol 4: 1641-3 (1984》、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(Lipofectin)法(Derijard B, " a/" Cell 76: 1025-37 (1994); Lamb & a/.， Nature Genetics 5: 22-30 (1993); Rabindran d a/., Science 259: 230-4 (1993))等。通過將特異性已知的單克隆抗體的表位導(dǎo)入本發(fā)明多 肽的N末端或C末端，可以以包含單克隆抗體的識別位點的融合蛋白的形 式表達本發(fā)明多肽。可以使用可商購的表位國抗體系統(tǒng)(Experimental Medicine 13: 85-90 (1995))?？梢岳闷涠嗫寺∥稽c表達與例如P-半乳糖苷 酶、麥芽糖-結(jié)合蛋白、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、綠色熒光蛋白(GFP)等的融合 蛋白的載體是可商購的。還報道了這樣的融合蛋白，其通過僅引入由幾個到十幾個氨基酸組成的小表位而制備，以免因融合而改變本發(fā)明用于篩選的多肽的特性。表位如聚組氨酸(His標簽)、流感病毒聚集體(influenza aggregate) HA、人c-myc、 FLAG 、 ？J^泡'l"生口膜炎病毒斗唐蛋白(Vesicular stomatitis virus glycoprotein) (VSV-GP)、 T7基因10蛋白(T7標簽)、人單純皰滲病毒糖蛋白(human simple herpes virus glycoprotein) (HSV標簽)、E標簽(單克隆噬菌體上的表位)等， 以及識別它們的單克隆抗體都可以用作表位-抗體系統(tǒng)來篩選能結(jié)合本發(fā)明 多肽的蛋白(Experimental Medicine 13: 85-90(1995))。在免疫沉淀法中，向用合適的表面活性劑(detergent)制備的細胞裂解物 中添加這些抗體，形成免疫復(fù)合物。所述免疫復(fù)合物由本發(fā)明多肽、包含 與該多肽結(jié)合之能力的多肽，以及抗體組成。除使用抗上述表位的抗體之 外，還可以使用抗本發(fā)明多肽的抗體進行免疫沉淀，所述抗體可以如上所 述制備。當所述抗體是小鼠IgG抗體時，可以通過例如蛋白A Sepharose或蛋白 GSepharose沉淀免疫復(fù)合物。如果將本發(fā)明多肽制備成帶有表位，如GST 的融合蛋白，可使用與這些表位特異性結(jié)合的物質(zhì)，例如谷胱甘肽-Sepharose 4B，按照與使用抗本發(fā)明多肽的抗體時相同的方式形成免疫復(fù)合物。免疫沉淀可以才莫仿或遵照例如文獻(Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988))中的方 法進行。通常使用SDS-PAGE對免疫沉淀的蛋白進行分析，可以使用合適濃度 的凝膠通過蛋白的分子量來分析結(jié)合的蛋白。由于采用常規(guī)染色法例如考 馬斯(Coomassie)染色或銀染色難以檢測與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白，因而可 以通過下述方法改進所述蛋白的檢測靈敏度在含有放射性同位素"S-曱硫 氨酸或"S-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，在細胞中標記蛋白，并檢測蛋白。 在已知蛋白的分子量時，可以從SDS -聚丙烯酰胺凝膠直接純化目標蛋白并 測定其序列。作為使用本發(fā)明多肽來篩選與該多肽結(jié)合的蛋白的方法，可以采用例 如West-Western印跡分析(Skolnik"a/, Cell 65: 83-90(1991))。具體地說， 可以通過下述方法獲得與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白使用噬菌體載體(例如 ZAP),由細胞、組織、器官(例如，乳腺癌細胞系以及正常人的胎盤、胰臟、 胃、氣管、乳腺和骨髓等組織)或者期望表達與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的培養(yǎng)細胞(例如HBC4, HBC5, MCF-7, MDA-MB-231, YMB1， SKBR3, T47D)制 備cDNA文庫；使該蛋白在LB-瓊脂糖(LB-agarose)上表達，將表達的蛋白 固定在濾膜(filter)上，再使經(jīng)純化和標記的本發(fā)明多肽與上述濾膜反應(yīng)，然 后根據(jù)標記來檢測表達與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的噬菌斑。利用生物素與 抗生物素蛋白之間的結(jié)合，或者利用與本發(fā)明多肽或融合于本發(fā)明多肽的 肽或多肽(例如GST)特異性結(jié)合的抗體，均可以對本發(fā)明多肽進行標記。也 可以采用使用放射性同位素或熒光等的方法?；蛘?，在本發(fā)明的篩選方法的另一實施方案中，可以使用利用細胞的 雙雜合系統(tǒng)(two-hybrid system) ("MATCHMAKER雙雜合系統(tǒng)"、"哺乳動物 MATCHMAKER雙雜合測定試劑盒"、"MATCHMAKER單雜合系統(tǒng)" (Clontech); "HybriZAP雙雜合載體系統(tǒng),，(Stratagene);參照"Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612(1992)，，， "Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)")。在雙雜合系統(tǒng)中，將本發(fā)明多肽與SRF-結(jié)合區(qū)或GAL4-結(jié)合區(qū)融合， 并在酵母細胞中表達。由預(yù)期表達與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的細胞制備 cDNA文庫，使該文庫在表達時與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域 (transcriptional activation region)融合。然后3奪cDNA文庫導(dǎo)入上述酵母細月包， 并從檢測為陽性的克隆分離出來源于所述文庫的cDNA (當在酵母細胞中表 達可與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白時，兩者的結(jié)合能夠激活報道基因，使陽性 克隆能夠被檢測)。通過將上述分離的cDNA導(dǎo)入大腸桿菌并表達蛋白，可 以制備由該cDNA編碼的蛋白。報道基因除HIS3基因外，還可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT 基因、螢光素酶基因等。采用親和層析法同樣可以篩選可與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物。例如， 可以將本發(fā)明多肽固定于親和層析柱的載體上，并將包含能與本發(fā)明多肽 結(jié)合的蛋白的受試化合物施加于該層析柱上。本說明書中的受試化合物可 以是例如細胞提取物、細胞裂解物等。在將所述受試化合物上樣后，對層 析柱進行洗滌，并可制備出已與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物。當受試化合物是蛋白時，分析獲得的蛋白的氨基酸序列，基于該序列合 成寡聚DNA,以該寡聚DNA為探針篩選cDNA文庫，從而獲得編碼所述 蛋白的DNA。在本發(fā)明中，可以將利用表面等離子體共振現(xiàn)象(surface plasmon resonance phenomenon)的生物傳感器(biosensor)用作對結(jié)合狀態(tài)的化合物進 行檢測或定量的手段。當使用這類生物傳感器時，只使用極少量的多肽且 不需標記(例如BIAcore， Pharmacia),即通過表面等離子體共振信號實時觀 察本發(fā)明多肽和受試化合物之間的相互作用。因此，可以使用生物傳感器 諸如BIAcore來評價本發(fā)明多肽和受試化合物之間的結(jié)合。當使固定化的本發(fā)明多肽暴露于合成化合物或天然物質(zhì)庫(natural substance banks)或隨機謹菌體肽展示文庫(random phage peptide display library)時，篩選結(jié)合分子的方法，以及使用基于組合化學(xué)技術(shù)的高通量來 分離與TOM34蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)乃至化合物(包括激動劑和拮抗劑)的篩 選方法(Wrighton et al.， Science 273: 458-64 (1996); Verdine， Nature 384: 11-13 (1996); Hogan, Nature 384: 17-9 (1996))，是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。或者，本發(fā)明提供使用本發(fā)明多肽來篩選用于治療或預(yù)防乳腺癌的化 合物的方法，該方法包括以下步驟(a) 使受試化合物與本發(fā)明多肽接觸；(b) 檢測步驟(a)的多肽的生物活性；和(c) 選擇這樣的化合物與不存在受試化合物時檢出的生物活性相比， 該化合物抑制所述多肽的生物活性。本發(fā)明的B7330N蛋白具有促進乳腺癌細胞的細胞增殖的活性，因而可 以使用所述活性為指標，篩選抑制本發(fā)明的該蛋白的所述活性的化合物。只要具有B7330N蛋白的生物活性，任何多肽均可用于篩選。所述生物 活性包括人B7330N蛋白的細胞增殖活性。例如，可以使用人B7330N蛋白， 也可以使用與這些蛋白功能上等價的多肽。所述多肽可以由細胞內(nèi)源性或 外源性表達。如下面詳細描述的，本發(fā)明部分基于與癌細胞增殖相關(guān)的B7330N蛋白 新型糖基化的發(fā)現(xiàn)。B7330N通過活化細胞增殖相關(guān)的信號傳導(dǎo)，在細胞生 長的自分泌調(diào)節(jié)中起作用(圖5a和5b )。在476N (天冬酰胺)被A (丙 氨酸)取代的N476A突變體中，未觀察到糖基化(圖3b)。外源野生型 B7330N分泌到培養(yǎng)基中，但在培養(yǎng)基中卻不能檢測到N476A蛋白。這提 示B7330N蛋白在Asn-476處的糖基化對分泌而言是必要的(圖3c )。此 外，與轉(zhuǎn)染了 N476A的細胞相比，表達野生型B7330N的細胞的生長快得多(圖8b)。因此，通過阻礙B7330N的糖基化有望抑制乳腺癌的細胞生 長。這樣，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)B7330N的糖基化水平的、用于治療或預(yù)防乳腺 癌的化合物的篩選方法，該方法包括下述步驟(a) 使表達B7330N多肽或其功能等價物的細胞與受試化合物接觸；(b) 檢測所述多肽的糖基化水平；和(c) 選擇這樣的化合物與不存在受試化合物時檢出的糖基化水平相比， 所述化合物抑制所述多肽的糖基化水平?；蛘撸景l(fā)明提供使用本發(fā)明的多肽來篩選用于治療或預(yù)防乳腺癌的 化合物的方法，包括下列步驟(a) 使受試化合物與B7330N多肽或者包含B7330N多肽的糖基化位點 的部分多肽在能夠糖基化所述肽的條件下接觸；(b) 檢測所述多肽的糖基化水平；和(c) 選擇這樣的化合物與不存在受試化合物時檢測到的糖基化水平相 比，其抑制所述多肽的糖基化水平。其中，在篩選用于治療或預(yù)防乳腺癌的化合物的前述方法(其包括檢 測本發(fā)明多肽的糖基化水平及其它)的優(yōu)選方案中，所述糖基化水平為本 發(fā)明多肽的天冬酰胺476的糖基化水平，特別是SEQIDNO:25所示氨基酸 序列或其同源部分中的天冬酰胺476的糖基化水平。如前述，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以容易地在本發(fā)明多肽中確定與SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的 476位相應(yīng)的位置。這些方法通過下述步驟實行使表達B7330N多肽或其具有糖基化位點 的功能等價物的細胞，或者多肽本身，與一種或多種候選化合物接觸；并 檢測發(fā)生了接觸的B7330N或其功能等價物的糖基化水平。通過這些方法來鑒定調(diào)節(jié)B7330N或其功能等價物的糖基化水平的化 合物。在本發(fā)明中，術(shù)語"功能(上)等價"還意味著對象蛋白具有與B7330N 相同或基本上相同的糖基化水平。具體地，包含糖基化位點的蛋白或該蛋 白的部分氨基酸被催化糖基化。根據(jù)本發(fā)明，可以確定對象蛋白是否具有 目標活性。即，可以采用下述方法檢測B7330N蛋白的糖基化水平在適于 所述蛋白糖基化的條件下，使多肽與受試化合物接觸。在本發(fā)明中，可以采用本4支術(shù)領(lǐng)域公知的方法確定B7330N多肽的糖基 化水平。例如，可以通過比較分子量來檢測多肽的糖基化。因為添加了糖 苷鏈，糖基化蛋白的分子量比由多肽的氨基酸序列計算出的預(yù)計尺寸的分 子量大。此外，如果通過糖苷酶處理可以降低糖基化蛋白的分子量，則可 以確認分子量的差異是由于附加糖香鏈所引起的。推測蛋白質(zhì)的分子量的 方法是公知的。此外，為了檢測多肽的糖苷鏈附加，可以使用糖基化用放射性標記供 體?？梢酝ㄟ^SDS-PAGE電泳和熒光自顯影來4企測放射性標記向B7330N 蛋白的轉(zhuǎn)移。此外，可以在反應(yīng)后，通過過濾將B7330N肽從糖基化供體中 分離，采用閃爍計數(shù)法測定保留在濾膜上的放射性標記的量?？梢越Y(jié)合于 糖基化供體的其它適宜標記例如生色性標記和熒光標記、以及4企測這些標 記向B7330N蛋白的轉(zhuǎn)移的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。此外，B7330N 的糖基化水平可以通過選擇性識別多肽糖基化水平的試劑來測定。例如， 可以將B7330N多肽和候選化合物在可將該多肽糖基化的條件下溫育，然后 通過免疫學(xué)方法檢測該多肽的糖基化水平。使用識別糖基化多肽的抗體的 任何免疫學(xué)技術(shù)，均可用于片會測。例如，抗糖基化多肽的抗體已經(jīng)商品化。 使用識別糖基化多肽的抗體的ELISA或免疫印跡，可以用于本發(fā)明。除使用抗體外，還可以使用以高親和性選擇性結(jié)合糖苷鏈的試劑來檢 測糖基化蛋白。這樣的試劑是本技術(shù)領(lǐng)域公知的，或者可以采用本技術(shù)領(lǐng) 域公知的篩選測定進行測定。例如，公知凝集素是糖苷鏈特異性探針。偶 聯(lián)有堿性磷酸酶等可檢測標記的凝集素試劑也已經(jīng)商品化。細胞中多肽的糖基化水平可以通過對細胞裂解物進行分離來推測。例 如，SDS-聚丙烯酰胺凝膠可以用于多肽的分離。將在凝膠上分離的多肽轉(zhuǎn) 移到硝酸纖維素膜上，以進行免疫印跡分析。通過這種篩選分離的化合物是本發(fā)明多肽的激動劑或拮抗劑的候選 物。術(shù)語"激動劑"指通過與本發(fā)明多肽結(jié)合而活化其功能的分子。同樣 地，術(shù)語"拮抗劑，，指通過與本發(fā)明多肽結(jié)合而抑制其功能的分子。而且， 通過這種篩選分離的化合物是抑制本發(fā)明多肽與分子(包括DNA和蛋白)在 體內(nèi)的相互作用的候選化合物。當本發(fā)明的方法中檢測的生物活性為細胞增殖時，可以如實施例所述， 通過例如如下方法來檢測生物活性制備表達本發(fā)明多肽的細胞，在存在受試化合物的條件下培養(yǎng)所述細胞，然后測定細胞增殖速度、測定細胞周 期、測定集落形成活性等。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供篩選用于治療或預(yù)防乳腺癌的化合物的方法。如上詳細描述，通過控制B7330N的表達水平，可以控制乳腺癌 的發(fā)病和進展。因而，通過以B7330N的表達水平為指標進行篩選，可以鑒 定能夠用于治療或預(yù)防乳腺癌的化合物。在本發(fā)明的上下文中，這樣的篩 選可包括例如以下步驟(a) 使受試化合物與表達B7330N的細胞接觸；和(b) 選擇這樣的化合物與不存在受試化合物時檢出的表達水平相比， 所述化合物降低B7330N表達水平。表達B7330N的至少 一個的細胞，包括例如由乳腺癌建立的細胞系；這 樣的細胞可以用于本發(fā)明的上述篩選(例如HBC4， HBC5， MCF-7, MDA-MB-231, YMB1, SKBR3, T47D, BT-20, HCC1500或MDA畫MB陽453 等)。表達水平可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進行評估。在本篩選方癌的候選物質(zhì)?；蛘?，本發(fā)明的篩選方法可以包括以下步驟(a) 使受試化合物與導(dǎo)入了載體的細胞接觸，其中所述載體含有標志基 因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)及在該轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的調(diào)控下表達的報道基因，其中所述標 記基因為B7330N;(b) 測定該報道基因的表達水平或活性；和(c) 選擇這樣的化合物與不存在受試化合物時檢出的對照水平相比， 所述化合物降低該報道基因的表達水平或活性。合適的報道基因和宿主細胞是本領(lǐng)域公知的?？梢允褂脴酥净虻霓D(zhuǎn) 錄調(diào)控區(qū)制備篩選所需的報道分子構(gòu)建體。當本領(lǐng)域技術(shù)人員已經(jīng)知道標 志基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)時，可以使用先前的序列信息來制備報道分子構(gòu)建體。 當標志基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)仍未鑒定時，可以基于標志基因的核苷酸序列信 息從基因組文庫中分離含有轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的核苦酸區(qū)段?？捎糜诮Y(jié)合蛋白的支持物(support)的實例包括不溶性多糖，如瓊脂糖、 纖維素和葡聚糖；及合成樹脂，如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅(silicon);優(yōu) 選地，可使用由上述材料制備的可商購的珠子和板(例如多孔板，生物傳感器芯片等)。使用珠子時，可以將其填入柱子。蛋白與支持物的結(jié)合可根據(jù)常規(guī)方法進行，這些方法例如化學(xué)鍵合或 物理吸附?；蛘?，蛋白可通過特異性識別它的抗體而與支持物結(jié)合。此外， 還可以利用抗生物素蛋白和生物素來進行蛋白與支持物的結(jié)合。蛋白之間的結(jié)合在緩沖液中進行，緩沖液例如但不限于磷酸鹽緩沖液和Tris緩沖液，只要所述緩沖液不抑制蛋白之間的結(jié)合即可。本發(fā)明中，利用表面等離子體共振現(xiàn)象的生物傳感器可用作^r測或定 量已結(jié)合的蛋白的裝置。當使用這樣的生物傳感器(例如BIAcore, Pharmacia) 時，僅使用少量的多肽，而且無需標記，即可通過表面等離子體共振信號 實時觀察蛋白之間的相互作用?；蛘撸梢詫7330N多肽進行標記，結(jié)合蛋白的標記可用于檢測或測 定已結(jié)合的蛋白。具體地，對一種蛋白進行預(yù)標記之后，在受試化合物存 在的條件下使標記的蛋白與其它蛋白接觸，然后在洗滌之后根據(jù)標記檢測 或測定已結(jié)合的蛋白。本發(fā)明的方法中，可以使用標記物質(zhì)來標記蛋白，所述標記物質(zhì)如放 射性同位素(例如311、 14C、 32P、 33P、 35S、 125I、 131I)、酶(例如堿性磷酸酶、 辣根過氧化物酶、卩-半乳糖苷酶、卩-葡糖苷酶)、熒光物質(zhì)(例如，異硫氰酸 熒光素(FITC)、羅丹明)和生物素/抗生物素蛋白。當用放射性同位素標記蛋 白時，可通過液體閃爍法(liquid scintillation)進行;險測或測定?；蛘?，可以 通過加入酶的底物，用吸收光度計(absorptiometer》險測底物的酶促變化，如 產(chǎn)生顏色，來檢測或測定酶標記的蛋白。此外，將熒光物質(zhì)用作標記的情 況中，可利用熒光光度計檢測或測定已結(jié)合的蛋白。在本發(fā)明的篩選中使用抗體的情況下，所述抗體優(yōu)選利用上述標記物 質(zhì)之一進行標記，并基于標記物質(zhì)進行纟企測或測定?；蛘撸部梢詫⒖?B7330N多肽或肌動蛋白的抗體用作第一抗體，使用以標記物質(zhì)標記的第二 抗體對其進行檢測。此外，本發(fā)明的篩選中與蛋白結(jié)合的抗體，可使用蛋白G或蛋白A柱加以;險測或測定。在本發(fā)明的篩選方法中可以使用任何受試化合物，這些化合物例如細 胞提取物、細胞培養(yǎng)物上清、發(fā)酵微生物的產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物 提取物、純化或粗制蛋白、肽、非肽化合物、合成的小分子化合物以及天 然化合物。本發(fā)明的受試化合物可以使用本領(lǐng)域已知的組合文庫法中多種方法中的任一種獲得，所述方法包括(l)生物學(xué)文庫，(2)空間可尋址平行固 相或溶液相文庫(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), (3)需要解巻積(deconvolution)的合成文庫法，(4)"一珠一化合物 (one bead one compound)，，文庫法和(5)使用親和層析選擇的合成文庫法。使 用親和層析選擇的生物學(xué)文庫法僅限于肽文庫，而其它四種方法適用于肽、 非肽寡聚體或化合物小分子文庫(Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145)。 合成分子文庫的方法的舉例可見于本技術(shù)領(lǐng)域(DeWitt " (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13; Erb & a/. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-6; Zuckermann d a/. (1994) J, Med. Chem. 37: 2678-85; Cho " a/.(1993) Science 261: 1303-5; Carell "a/. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell d a/. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; Gallop " a/.(1994) J. Med. Chem. 37: 1233-51)?；衔镂膸炜纱嬖谟谌芤褐?參見 Houghten (1992) Bio/Techniques 13:412-21)，或珠子(Lam (1991) Nature 354: 82-4),芯片(Fodor (1993) Nature 364: 555-6)，細菌(美國專利5,223,409),孢 子(美國專利5,571,698; 5，403，484和5,223,409)，質(zhì)粒(Cull等(1992) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 89: 1865-9)或嗟菌體(Scott and Smith (1990) Science 249: 386-90; Delvin (1990) Science 249: 404-6; Cwirla等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-82; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-10;美國專利申請 2002103360)。通過本發(fā)明的篩選方法分離的化合物可作為藥物的候選物，所述藥物 抑制本發(fā)明多肽的活性，用于治療或預(yù)防例如乳腺癌等起因于細胞增殖性 疾病的疾病。此外，通過本發(fā)明的篩選方法獲得的化合物還包括通過本發(fā) 明的篩選方法獲得的化合物中部分結(jié)構(gòu)發(fā)生添加、缺失和/或取代而得的化 合物。用于治療或預(yù)防乳腺癌的藥物組合物本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防乳腺癌的組合物，其含有通過本發(fā)明的篩 選方法選擇的任意化合物。當通過本發(fā)明的篩選方法分離的化合物作為藥物施用于人或其它哺乳 動物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、貓、犬、綿羊、豬、牛、猴、 狒狒、黑猩猩，以治療細胞增殖性疾病(例如乳腺癌)時，該分離的化合物可以直接施用，或者可以利用已知的藥物制備方法配制成各種劑型。例如，根據(jù)需要，所述藥物可以作為糖衣片劑、膠嚢劑、酏劑和微膠嚢口服施用； 或者用水或任何其它藥物可接受的液體配制成無菌溶液或懸浮液，以注射 劑的形式非口服施用。例如，可以將化合物在一般接受的藥物施用方式所 需的單位劑型(unitdose)中與藥理學(xué)可接受的載體或介質(zhì)混合在一起，所 述載體或介質(zhì)包括但不限于無菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、 表面活性劑、穩(wěn)定劑、調(diào)味劑、賦形劑(excipient)、溶媒(vehicle)、防腐劑、 粘合劑等。這些制劑中有效成分的含量使得指定范圍內(nèi)合適的給藥量能夠 構(gòu)達到。能夠混合到片劑和膠嚢中的添加劑的例子包括但不限于粘合劑如明 膠、玉米淀粉、黃蓍膠(tragacanthgum)和阿拉伯膠，賦形劑例如結(jié)晶纖維素， 溶脹劑例如玉米淀粉、明膠和海藻酸(alginic acid)，潤滑劑例如硬脂酸鎂， 增甜劑例如蔗糖、乳糖或糖精，和調(diào)味劑例如薄荷(peppermint)、紅珠樹 (G^M/Aeh" a&"oAWx)油和櫻桃。當單位劑型為膠嚢劑時，上述成分中 還可以包括液體載體，例如油。注射用無菌組合物可以使用溶i某例如注射 用蒸餾水，按照標準的藥物配制方式進行配制。生理鹽水、葡萄糖以及包含輔料，如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇 和氯化鈉的其它等滲液體，可用作注射用水溶液。這些可以與合適的增溶 劑組合使用，所述增溶劑例如醇，具體有乙醇，多元醇例如丙二醇和聚乙 二醇，非離子表面活性劑例如Polysorbate 80 (TM)和HCO-50。芝麻油或大豆油是油質(zhì)液體的實例，所述油質(zhì)液體可以與苯曱酸節(jié)酯 或苯曱醇組合使用作為增溶劑，還可與緩沖液如磷酸鹽緩沖液和乙酸鈉緩 沖液、鎮(zhèn)痛劑如鹽酸普魯卡因、穩(wěn)定劑如苯曱醇和苯酚和抗氧化劑一起配 制。制備的注射劑可以裝入到合適的安瓿(ampoule)中。可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法給患者施用本發(fā)明的藥物組合 物，例如通過動脈內(nèi)、靜脈內(nèi)或經(jīng)皮注射，以及鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、肌內(nèi)或口 服給藥施用于患者。施用劑量和方法根據(jù)患者的體重和年齡以及施用方法 而變化；不過，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠按常規(guī)對其進行選擇。如果所述化合 物由DNA編碼，可將該DNA插入到基因治療載體中，并給患者施用該載 體以進行治療。施用的劑量和方法因患者的體重、年齡和癥狀而異，但是 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠合適地選擇它們。舉例來說，當向普通成年人(體重60 kg)口服給藥時，雖然根據(jù)其癥狀 存在一些差異，但與本發(fā)明的多肽結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性的化合物的劑量為約 O.lmg-約100mg每天，優(yōu)選為約l.Omg-約50mg每天，更優(yōu)選為約1.0 mg-約20 mg每天。當以注射劑形式向普通成年人(體重60 kg)非消化道施用時，雖然根據(jù) 患者、靶器官、癥狀和施用方法存在一些差異，但方便的做法是靜脈內(nèi)注 射約0.01 mg-約30mg每天，優(yōu)選約0.1 mg-約20mg每天，更優(yōu)選約0.1 mg-約10mg每天的劑量。而且，在其它動物的情況下，可以按60kg體重的標 準常規(guī)換算出合適的施用量。此外，本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防乳腺癌的藥物組合物，其包含抑制 B73^W基因表達的有效成分。這樣的有效成分包括針對S73^W基因的反 義多核普酸、siRNA或核酶，或者所述反義多核苷酸、siRNA或核酶的書亍 生物，例如表達載體。通過與合適的基質(zhì)混合，可以將這些活性成分制成外用制劑，如搽劑 或罨劑，其中所述合適的基質(zhì)對衍生物(derivative)是無活性的。并且根據(jù)需 要，通過添加賦形劑、等滲劑(isotonic agents)、增溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、 鎮(zhèn)痛劑等，可以將這些活性成分配制成例如片劑、粉末、顆粒、膠嚢、脂 質(zhì)體膠嚢、注射劑、溶液、滴鼻劑和冷凍干燥劑。這些劑型可以按常規(guī)方 法制備。通過直接將活性成分施于患處(ailing site),或通過將其輸入血管以使其 到達患處而將活性成分給予患者。也可使用封固劑(mounting medium)來提 高持久性和膜通透性。封固劑的例子包括脂質(zhì)體、聚-L-賴氨酸、脂質(zhì)、膽 固醇、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(lipofectamine)或它們的書f生物。本發(fā)明的這種組合物的劑量可以根據(jù)患者的狀況(condition)適當調(diào)整， 并按所需的量使用。例如，可以施用的劑量范圍為0.1 -100 mg/kg，優(yōu)選0.1 -50 mg/kg。本發(fā)明的另 一 實施方式為用于治療和預(yù)防乳腺癌的組合物，該組合物 含有針對S73^W基因編碼多肽的抗體、或所述抗體與該多肽結(jié)合的片段。當向普通成年人(體重60kg)口服給藥時，雖然根據(jù)癥狀存在一些差別， 但用于治療或預(yù)防乳腺癌的抗體或其片段的劑量為約0.1 mg-約100 mg每 天，優(yōu)選為約1.0mg-約50mg每天，更優(yōu)選為約1.0 mg-約20 mg每天。當以注射劑形式向普通成年人(體重60 kg)非消化道給藥時，雖然根據(jù) 患者的狀況、疾病癥狀和給藥方法而存在一些差別，但方便的做法是靜脈 內(nèi)注射約0.01 mg-約30 mg每天，優(yōu)選約0.1 mg-約20 mg每天，更優(yōu)選約 0.1 mg-約10mg每天的劑量。同樣地，在其它動物的情況下，可以按60kg 體重的標準常規(guī)換算出合適的施用量。用于治療或預(yù)防乳腺癌的方法本發(fā)明提供治療或預(yù)防受試者中的乳腺癌的方法。預(yù)防性或治療性地 對患有乳腺癌或存在患乳腺癌的風險(或易感性)的受試者施用治療用化 合物。采用標準臨床方法、或者通過^r測B7330N的異常表達水平或活性， 來鑒定這樣的受試者。預(yù)防性給藥在出現(xiàn)疾病的明顯臨床癥狀之前進行， 以阻止疾病或病癥或者延遲其進程。本發(fā)明的治療方法包括降低B73307V基因的表達或功能的步驟。在這些 方法中使用有效量的化合物對受試者進行治療，所述化合物降低受試者中 過高表達的基因(5733(W基因)。給藥可以是全身給藥或局部給藥。治療化 合物包括降低乳腺癌細胞內(nèi)源性基因之表達水平的化合物(即，下調(diào)過高表 達基因之表達的化合物)。施用這樣的治療化合物可以對抗受試者細胞中異 常過高表達基因的影響，并預(yù)期改善受試者的臨床狀況。所述化合物可以 通過上述的本發(fā)明的篩選方法獲得。此外，萬733(W基因表達的抑制可以采用本領(lǐng)域已知的幾種方法中的任 何一種，這些方法中包括給受試者施用抑制或拮抗基因表達的核酸。也可 將破壞基因表達的反義寡核苦酸、siRNA或核酶用于抑制基因表達?？捎?于破壞基因表達的反義寡核芬酸、siRNA或核酶如本說明書中前面的描述。如上所述，可以使用對應(yīng)于S733(W基因核苷酸序列的反義寡核苷酸來 降低S7330W基因的表達水平。具體地說，本發(fā)明的反義寡核苷酸可以通過 與由萬73307V基因編碼的多肽或與之對應(yīng)的mRNA中的任何一個結(jié)合而發(fā) 揮作用，從而抑制該基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進mRNA降解和/或抑制該基因 所編碼的蛋白的表達，最終抑制B7330N蛋白的功能。通過與合適的基質(zhì)(base material)混合，可以將反義寡核苷酸及其衍生物 制成外用制劑，如搽劑(liniment)或罨劑(poultice),并用于本發(fā)明的治療或此外，抑制過高表達基因的基因產(chǎn)物的核酸還包括小干擾RNA (siRNA),所述siRNA含有編碼57B(W基因之核苦酸序列的有義鏈核酸與 反義鏈核酸的組合。本發(fā)明所述的治療或預(yù)防可以使用siRNA導(dǎo)入細胞的 標準技術(shù)，包括以DNA為RNA轉(zhuǎn)錄的模板的技術(shù)。構(gòu)建siRNA以使單一 轉(zhuǎn)錄物(single transcript)具有來自輩巴基因的有義序列和互補的反義序列，例 》口為發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpin)。使用本方法抑制B733(W基因表達上調(diào)的細胞的基因表達。siRNA在靶 細胞內(nèi)與B7330N基因的轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，導(dǎo)致該細胞B7330N蛋白產(chǎn)生減少。此外，抑制過高表達基因的基因產(chǎn)物的核酸還包括針對過高表達基因 (S7330iV基因)的核酶。此外，本發(fā)明提供使用針對本發(fā)明多肽的抗體治療或預(yù)防乳腺癌等細 胞增殖疾病的方法。根據(jù)本方法，施用藥物有效量的針對本發(fā)明多肽的抗 體。B7330N蛋白的表達在乳腺癌細胞中上調(diào)，并且抑制這些蛋白的表達降 低細胞增殖活性，因而預(yù)計通過抗體與這些蛋白的結(jié)合可以治療或預(yù)防細 胞增殖性疾病。因此，以足以降低本發(fā)明蛋白活性的量施用針對本發(fā)明多 肽的抗體，該施用量為0.1-約250mg/kg每天的范圍。成人的劑量范圍通常 為約5 mg-約17.5 g/天，優(yōu)選為約5 mg-約10 g/天，更優(yōu)選為約100 mg-約3 g/天?；蛘撸c腫瘤細胞特異性細胞表面標志結(jié)合的抗體可以用作藥物遞送 的工具。例如，以足以殺傷腫瘤細胞的量施用與細胞毒劑偶聯(lián)的抗體。本發(fā)明的另 一方面為治療或預(yù)防乳腺癌的方法，該方法包括施用藥物 有效量的下述物質(zhì)的步驟該物質(zhì)抑制本發(fā)明多肽之氨基酸序列中天冬氨 酸476的糖基化，特別是SEQ ID NO:25所示多肽的氨基酸序列中天冬氨酸 476的^唐基化。本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，該方法包括下述步驟施用 B7330N蛋白或其免疫活性片段、或者編碼所述蛋白的多核苷酸或其片段。 B7330N蛋白或其免疫活性片段作為針對乳腺癌等細胞增殖性疾病的疫苗 是有用的。在一些情況下，該蛋白或其片段可以以結(jié)合于T細胞受體(TCR) 的形式施用，或者以;故抗原呈遞細胞(APC),如巨謹細胞、樹突細胞(DC) 或B細胞呈遞的形式施用。由于DC具有強抗原呈遞能力，所以在APC中 最優(yōu)選使用DC。在本發(fā)明中，針對細胞增殖性疾病的疫苗，是指具有接種于動物時誘 導(dǎo)抗肺瘤免疫之功能的物質(zhì)。
一般而言，抗腫瘤免疫包括諸如以下的免疫應(yīng)答-誘導(dǎo)抗胂瘤的細胞毒性淋巴細胞， -誘導(dǎo)識別腫瘤的抗體，和 -誘導(dǎo)抗腫瘤細胞因子的產(chǎn)生。因此，當某蛋白接種于動物時誘導(dǎo)任一種上述免疫反應(yīng)時，確定該蛋 白具有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的效果。由蛋白誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫可以通過在體內(nèi) 或體外觀察宿主中免疫系統(tǒng)針對該蛋白的應(yīng)答而加以檢測。例如，檢測細胞毒性T淋巴細胞的誘導(dǎo)的方法是公知的。進入活體的 外來物質(zhì)通過抗原呈遞細胞(APC)的作用而凈皮呈遞于T細胞和B細胞。以抗 原特異性方式應(yīng)答于APC所呈遞抗原的T細胞由于該抗原的刺激而分化為 細胞毒性T細胞(或細胞毒性T淋巴細胞；CTL),然后增殖(這稱為T細胞 活化)。因此，肽對于CTL的誘導(dǎo)，可以通過將該肽經(jīng)由APC呈遞于T細 胞和檢測CTL的誘導(dǎo)來進行評估。此外，APC具有激活CD4+ T細胞，CD8+ T細胞，巨噬細胞，嗜酸粒細胞(eosinophil)和NK細胞的功效。由于CD4+ T 細胞和CD8+T細胞在抗腫瘤免疫中也是重要的，可使用這些細胞的激活效 應(yīng)作為指標來評價肽的抗腫瘤免疫誘導(dǎo)作用。使用樹突細胞(DC)作為APC評價CTL誘導(dǎo)作用的方法在本領(lǐng)域中是眾 所周知的。在APC中，DC是具有最強CTL誘導(dǎo)作用的代表性APC。在該 方法中，首先使受試多肽與DC接觸，然后使該DC與T細胞接觸。在與 DC接觸后，如果檢測出具有針對目標細胞的細胞毒性作用的T細胞，則表 示該受試多肽具有誘導(dǎo)細胞毒性T細胞的活性。CTL的抗腫瘤活性可以例 如采用"Cr標記的腫瘤細胞的裂解(lysis)作為指標來進行檢測?；蛘撸捎?311-胸香攝取活性或LDH (乳糖脫氫酶)釋放作為指標來評價腫瘤細胞損傷程 度的方法也是眾所周知的。除DC外，外周血單核細胞(PBMC)也可用作APC。已報道通過在存在 GM-CSF和IL-4的情況下培養(yǎng)PBMC可增強CTL的誘導(dǎo)。相似地，已顯示 在存在鑰孔血藍蛋白(KLH)和IL-7的條件下培養(yǎng)PBMC誘導(dǎo)了 CTL。通過這些方法確定為具有CTL誘導(dǎo)活性的受試多肽，是具有DC激活 效應(yīng)和隨后的CTL誘導(dǎo)活性的多肽。因此，誘導(dǎo)針對腫瘤細胞的CTL的多肽可用作抗腫瘤的疫苗。此外，通過與所述多肽接觸而獲得誘導(dǎo)針對腫瘤的CTL的能力的APC也可用作抗腫瘤的疫苗。此外，通過APC呈遞多肽 抗原而獲得細胞毒性的CTL也可用作抗肺瘤的疫苗。利用由APC和CTL 所致的抗腫瘤免疫的這些肺瘤治療方法稱為細胞免疫療法。一般來說，當細胞免疫療法使用多肽時，已知組合多種具有不同結(jié)構(gòu) 的多肽并使其與DC接觸將增加CTL誘導(dǎo)的效率。因此，當用蛋白片段刺 激DC時，使用多種類型的片段的混合物是有利的。或者，多肽對抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)可以通過觀察針對腫瘤的抗體產(chǎn)生的 誘導(dǎo)來確認。例如，當用多肽免疫的實驗動物中誘導(dǎo)產(chǎn)生抗該多肽的抗體 并且這些抗體抑制腫瘤細胞生長時，所述多肽可視為具有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫 的能力。施用本發(fā)明的疫苗誘導(dǎo)抗胂瘤免疫，而該抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)使治療和預(yù)防乳腺癌等細胞增殖性疾病成為可能?？拱┲委熁?qū)Π┌Y發(fā)病的預(yù)防可以包括任何下述步驟諸如癌性細胞生長的抑制，癌癥的退縮(involution)以及癌發(fā)生的抑制。癌癥的治療或預(yù)防的效果還包括患癌癥個體的死亡率降低、血液中肺瘤標志減少、癌癥伴發(fā)的可檢測癥狀的緩解等。所述治療性和預(yù)防性效果優(yōu)選是統(tǒng)計學(xué)上顯著的。例如，在觀察中顯著性水平為5%或更低，在所述觀察中將疫苗針對細胞增殖性疾病的治療性或預(yù)防性效果與未施用疫苗的對照進行比較。例如，可將Student's t4企-驗，Mann-WhitneyU-檢驗或ANOVA用于統(tǒng)計學(xué)分析。具有免疫活性的上述蛋白或編碼該蛋白的載體可與佐劑組合。佐劑是 指當與具有免疫活性的蛋白共同(或相繼)施用時增強針對該蛋白的免疫應(yīng)答的化合物。例示性的佐劑包括但不限于霍亂毒素(choleratoxin)、沙門氏菌 毒素(salmonellatoxin)、明鞏(alum)等。此外，本發(fā)明的疫苗可適宜地與藥物 可接受的載體組合。這樣的載體的例子包括但不限于無菌水、生理鹽水、 磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)液等。此外，疫苗可根據(jù)需要包含穩(wěn)定劑，懸浮劑 (suspensions),防腐劑，表面活性劑等。疫苗全身或局部地進4亍施用。疫苗 施用可以通過單次給藥進行，或者通過多次給藥來強化(boost)。當使用APC或CTL作為本發(fā)明的疫苗時，可以例如通過離體(ex Wvo ) 方法治療或預(yù)防腫瘤。更具體地，可以收集接受治療或預(yù)防療法的受試者 的PBMC,使細胞與多肽在離體條件下接觸，誘導(dǎo)APC或CTL，然后將該細胞施用于受試者。也可通過將編碼多肽的載體在離體條件下導(dǎo)入PBMC 中來誘導(dǎo)APC。體外誘導(dǎo)的APC或CTL可以在施用前進行克隆。通過克 隆和培養(yǎng)具有高耙細胞破壞活性的細胞，可以更有效地實施細胞免疫治療。此外，以該方式分離的APC和CTL不僅可以用于針對提供細胞的受試者進 行細胞免疫治療，還可以用于針對來自其它個體的相似類型的腫瘤進行細 胞免疫治療。此外，本發(fā)明提供治療或預(yù)防乳腺癌等細胞增殖性疾病的藥物組合物， 其包含藥物有效量的B7330N多肽。該藥物組合物可以用于激起抗腫瘤免 疫。B7330N的正常表達限于胎盤、胰臟、胃、氣管、乳腺和骨髓。因而， 對這些基因的抑制不會給其它器官造成不良影響。因此，B7330N多肽優(yōu)選 用于治療細胞增殖性疾病，特別是乳腺癌。而且，由于已揭示在癌細胞中 特異性表達的蛋白的肽片段誘導(dǎo)抗癌免疫應(yīng)答，因此也可以將B7330N的肽 片段用于治療或預(yù)防細胞增殖性疾病如乳腺癌的藥物組合物中。本發(fā)明中， 以足夠誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的劑量施用多肽或其片段，劑量范圍為0.1 mg-10 mg，優(yōu)選0.3mg-5mg,更優(yōu)選0.8mg-1.5 mg。反復(fù)進行施用。為誘導(dǎo)抗腫瘤 免疫，例如可以每2周施用lmg肽或其片段4次。此外，編碼B7330N的多核苦酸或者它們的片段可以用于激發(fā)抗腫瘤免 疫?？梢詫⑦@樣的多核苷酸納入表達載體以在待治療的受試者中表達 B7330N或者它們的片段。因此，本發(fā)明包含誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，其中 給患有細胞增殖性疾病如乳腺癌或處于發(fā)生此類疾病的危險中的受試者施 用編碼B7330N的多核苷酸或者它們的片段。當然，本說明書中記載的乳腺癌的治療或預(yù)防方法或抗腫瘤免疫的誘 導(dǎo)方法的實施方式，在稍加必要改變后，也適用于上述乳腺癌治療或預(yù)防 方法或者抗腫瘤免疫誘導(dǎo)方法中所應(yīng)用的任何化合物在制備藥物組合物方 面的用途，其中所述藥物組合物用于在受試者中治療或預(yù)防乳腺癌或者誘 導(dǎo)抗腫瘤免疫，尤其是抗乳腺腫瘤免疫。以下的實施例是為例示本發(fā)明以及幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員實施和使用本 發(fā)明而提供的。在任何情況下，這些實施例都不意味著對本發(fā)明范圍的限 定。除非另外限定，本說明書中使用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語均與本發(fā) 明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 一般理解的含義相同。盡管與本說明書中的所述類似或等價的方法和材料均可用于實施或檢驗本發(fā)明，但以下描述 了合適的方法和材料。本說明書中引用的任何專利、專利申請和出版物均 并入作為參考。本說明書中的任何記載均不應(yīng)解釋為承認本發(fā)明不具有通 過在先發(fā)明而處于上述公開之前的權(quán)利。實施本發(fā)明的最佳方式通過下面的實施例詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實施例的 限制。材料和方法乳腺癌細胞系及腫瘤標本人乳腺癌細胞系HBL-100、 HCC1937、 MCF-7、 MDA-MB-435s、 YMB1、 SKBR3、 T47D、 BT-20、 BT畫474、 BT-549、 HCC1143、 HCC1500、 HCC1599、 MDA-MB-157、 MDA-MB453、 OUCB-F、 ZR-75-l及COS-7細胞系購自美 國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC )，并按它 們各自保藏人的建議進行培養(yǎng)。HBC4、 HBC5和MDA-MB-231細胞系由曰 本財團法人癌研究會癌化學(xué)療法中心分子藥理部(Molecular Pharmacology,矢守博士惠贈。所有的細胞均在合適的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，即對于HBC4、 HBC5、 T47D、 YMB1、 OUCB-F、 ZR畫75-1、 BT-549、 HCC1143、 HCC1500、 HCC1599和HCC1937使用RPMI-1640 (Sigma， St. Louis, MO)(添加2mM 的L-谷氨酰胺)；對于BT474、 HBL100和COS7使用Dulbecco改進的Eagle 培養(yǎng)基(Invitrogen, Carlsbad, CA);對于BT-20和MCF-7使用含O.lmM必需 氨基酸(Roche)、 lmM丙酮酸鈉(Roche)、 0.01mg/ml胰島素(Sigma)的EMEM (Sigma);對于SKBR3使用McCoy (Sigma)(添加1.5mM的L-谷氨酰胺)； 對于MDA-MB-231 、 MDA-MB-157、 MDA-MB453和MDA-MB-435s使用 L-l5 (Roche)。每種培養(yǎng)基都添加有10。/。胎牛血清(Cansera)和1%抗生素/抗 真菌溶液(antibiotic/antimycotic solution) (Sigma)。于3 7°C ，在不含C02的濕 潤空氣的氣氛中維持MDA-MB-231和MDA-MB-435s細胞。于37°C,在含 5% C02的濕潤空氣的氣氛中維持其它細胞系。經(jīng)每位患者書面知情同意 (informed consent)后，由手術(shù)標本獲取了臨床樣品(乳腺癌和正常乳房導(dǎo) 管)。發(fā)明人的cDNA微陣列上編號B7330N的點表示的新人類基因的分離 cDNA微陣列載玻片的制作另有描述(Ono K, & (2000) Cancer Res., 60， 5007-11 )。關(guān)于表達模式的各項分析，準備了一式兩組含27648個cDNA 點的載玻片，以減少實驗性波動。簡單地說，由各個激光顯微解剖的細胞 樣品純化總RNA，進行基于T7的RNA擴增，獲得了充分量的RNA以進 行微陣列實驗。對于等份的由乳腺癌細胞和正常乳房導(dǎo)管細胞擴增獲得的 RNA ， 分別4吏用了 Cy5國dCTP和Cy3-dCTP (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)通過逆轉(zhuǎn)錄進行了標記。按以前描述的方法(Ono K，" a/.， (2000) Cancer Res., 60， 5007-1 l)進行雜交、清洗和檢測。為了檢測在乳腺 癌中普遍上調(diào)的基因，對微陣列上的27648個基因的全面表達圖式進行篩 選，選擇了下述基因這些基因在超過50%的i)所有77例閉經(jīng)前乳腺癌病 例、ii)69例浸潤性導(dǎo)管癌、iii)31例高度分化型病變、iv)14例中度分化型 病變或v) 24例低度分化型病變中，表達比均大于3.0。在腫瘤細胞中表現(xiàn) 上調(diào)的493個基因中，本發(fā)明人著眼于機構(gòu)內(nèi)部編號為B7330N的基因，因 為其在超過30%的乳腺癌信息病例中表達比大于3.0。半定量RT-PCR分析本發(fā)明人從激光捕獲細胞的各群體中提取總RNA,然后按以前描述的 方法進4亍基于T7的擴增和逆4爭錄(Kitahara 0, " a/.， (2001) Cancer Res.， 61, 3544-9 )。本發(fā)明人通過監(jiān)測作為定量內(nèi)部對照的甘油醛-3-璘酸脫氫酶 (C^PD//),制備了用于后續(xù)PCR的各單鏈cDNA的適宜的稀釋物。PCR 引物序列如下用于GAPDH : 5'陽CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3'(SEQ ID NO: 1)和 5'-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT國3' (SEQ ID NO: 2);以及用于B7330N: 5，-GAGTCCAGGTAAGTGAATCTGTCC-3， (SEQ ID NO: 3)和5'誦ATTTCCACCGAGACCTCTCATC國3， (SEQ ID NO: 4)。Northern印跡分析按生產(chǎn)商的說明書，使用RNeasy kit(QIAGEN)從全部的乳腺癌細胞系 中提取了總RNA。在用DNA酶I (Nippon Gene, Osaka, Japan)處理后，使用mRNA純化試劑盒(AmershamBiosciences)按生產(chǎn)商的說明書分離了 mRNA。 將1嗎等份的各種mRNA以及從正常成人的乳房(BioChain)、肺、心、 肝、腎、骨髓(BD,Clontech,Palo Alto，CA)分離的polyA(+)RNA，在1% 變性瓊脂糖凝膠上分離并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(乳腺癌Northern印跡)。使乳 腺癌Northern印跡及人類多組織Northern印跡(Human multiple-tissue Northern blots, Clontech, Palo Alto, CA )與通過RT-PCR制備(參考下述) 的[a"P]-dCTP標記B7330N PCR產(chǎn)物進行雜交。按供應(yīng)商的推薦進行預(yù)雜 交、雜交和洗滌。印跡使用增感屏(intensifying screen)在-80。C放射自顯影 14天。通過RT-PCR制備針對B7330N ( 502bp)的特異性探針，并采用 megaprime DNA才示i己系統(tǒng)(Amersham Bioscience)進4亍了》文射性才示"i己，所 述RT-PCR使用以下引物組5 ，-GAGTCCAGGTAAGTGAATCTGTCC-3 ， (SEQ ID NO: 3)和5，-ATTTCCACCGAGACCTCTCATC-3， (SEQ ID NO:4)。B7330N表達載體的構(gòu)建為了構(gòu)建B7330N表達載體，使用KOD-Plus DNA聚合酶(Toyobo, Osaka, Japan)和以下引物通過PCR擴增了 B7330NcDNA的完整編碼序列正向5，-CGGAATTCATGAGGCTCCTCCGCAG-3' (SEQ ID NO; 5)，(下 劃線為EcoRI位點)，反向5，-CCGCTCGAGGACAAAGAGCCACAACTGATG-3' (SEQ ID NO; 6)(下劃線為Xho I位點)。將PCR產(chǎn)物插入pCAGGS-HA表達載體的EcoRI位點和Xhol位點。 為了構(gòu)建B7330N變體，本發(fā)明人使用PCR定點突變試劑盒(PCR site-direct mutagenesis kit, Invitrogen)和以下引物，將B7330N蛋白中兩個被預(yù)測為 潛在N-糖基化位點的天冬酰胺殘基(Asn-476和Asn-611 )替換為丙氨酸殘 基，所使用的引物如下N476A-F: 5，-ACAACTGCACTGTCACGCCTTTTCCTGGTACCTGC—3' (SEQ IDNO;7)和N476A-R : 5，-GCAGGTACCAGGAAAAGGCGTGACAGTGCAGTTGT—3' (SEQ ID NO; 8);N611A-F: 5，-CATGGCCCCCTGCGCACCCAGTGACCCCC-3' (SEQ ID NO; 9)和N611 A-R: 5，-GGGGGTCACTGGGTGCGCAGGGGGCCATG-3' (SEQ ID NO; 10)。通過DNA序列測定確認了這些構(gòu)建體(pCAGGS-B7330N-HA, pCAGGS-N476A-HA和pCAGGS-N611A-HA)。為了制備用于二聚體化實 驗的構(gòu)建體，將B7330N的完整編碼序列克隆到了 pcDNA3.1-myc-his載體 (Invitrogen )中。免疫細胞化學(xué)染色首先，為考察外源性B7330N的亞細胞定位，本發(fā)明人以lxl()S個細胞 每孔接種了COS7細胞，用于外源性表達。72小時后，使用FuGENE6轉(zhuǎn) 染試劑(Roche)按生產(chǎn)商的說明書分別用l嗎的pCAGGS-B7330N-HA瞬時 轉(zhuǎn)染COS7細胞。然后，使用含4%多聚曱醛的PBS固定細胞15分鐘，并 用含0.1% Triton X-100的PBS于4°C處理2.5分鐘以使細胞可通透。接下 來，用含3。/。BSA的PBS于4。C覆蓋細胞12小時，以封閉非特異性雜交。 接著，將用B7330N-HA轉(zhuǎn)染的COS7細胞與1:1000稀釋的大鼠抗HA抗體 (Roche)—起溫育。用PBS(-)清洗后，將轉(zhuǎn)染細胞用1:1000稀釋的Alexa488-偶聯(lián)抗大鼠第二抗體(Molecular Probe)進行了染色。用4', 6'-二脒基-2'-苯基 。引咮二鹽酸(DAPI)對細胞核進行了復(fù)染。在TCS SP2 AOBS顯孩i鏡(Leica， Tokyo, Japan)下獲取了熒光影像?？笲7330N的特異性多克隆抗體的制備使用pET28載體(Novagen, Madison， WI)制備了設(shè)計成表達N末端和C 末端帶His標簽表位的兩個B7330N片段(35-239 a.a.)的載體。在大腸桿 菌BL21 codon-plus菌株(Stratagene, La Jolla, CA)中表達重組肽，按供應(yīng)商的 規(guī)程使用Ni-NTA樹脂瓊脂糖(Qiagen)對其進行了純化。將純化的重組蛋 白接種于兔。按標準方法使用重組蛋白(35-239 a.a.)在親和柱上純化了免 疫血清。親和純化的抗B7330N抗體用于下面的Western印跡、免疫細胞染 色和免疫組織化學(xué)染色。乳腺癌細胞系中內(nèi)源性B7330N的表達為了在乳腺癌細胞系(HBC5, MDA-MB-231, SKBR3和T47D)和HMEC(人乳腺上皮細胞)中檢測內(nèi)源性B7330N蛋白，按前述在裂解緩沖液中裂 解了細胞。使用蛋白測試試劑盒(Bio-Rad,Hercules，CA)估計了總蛋白量， 其后與SDS-樣品緩沖液混合，煮沸，上樣于前述的10。/。SDS-PAGE凝膠。 電泳后，將蛋白印跡在硝酸纖維素膜(GE Healthcare )上。用封閉液(blocking solution)封閉含蛋白的膜，將其與抗B7330N多克隆抗體一起溫育，來檢 測內(nèi)源性B7330N蛋白。最后，將膜與HRP偶聯(lián)第二抗體一起溫育，使用 ECL檢測試劑(GE Healthcare)使蛋白條帶可視化。還考察了 (3-肌動蛋白 作為上樣對照(loading control)。為了進一步考察乳腺癌細胞系T47D中內(nèi)源性B7330N蛋白的亞細胞定 位，本發(fā)明人以lx105個細胞每孔(Lab-Tek II腔式載玻片，Nalgen Nunc International, Naperville,IL)接種了細胞。溫育24小時后，使用含4%多聚 甲醛的PBS(-)固定細胞15分鐘，并用含0.1°/。 Triton X-100的PBS(-)于4°C 處理2.5分鐘以使細胞可通透。接下來，用3。/。BSA的PBS(-)于4。C覆蓋細 胞12小時，以封閉非特異性雜交，接著，與1:1000稀釋的兔抗B7330N多 克隆抗體一起溫育。用PBS(-)清洗后，將細胞用1:1000稀釋的Alexa488-偶聯(lián)抗兔第二抗體(Molecular Probe， Eugene, OR)進行了染色。用4'， 6'-二脒 基-2'-苯基p引咮二鹽酸(DAPI)對細胞核進行了復(fù)染。在TCS SP2 AOBS顯微 鏡(Leica, Tokyo, Japan)下獲取了熒光影像。免疫組織化學(xué)染色按以前描述的方法(Kitahara O, et al. Cancer Res 61， 3544-3549 (2001).)， 使用親和純化的抗B7330N多克隆抗體考察了乳腺癌及正常組織中的 B7330N蛋白表達圖式。為了考察正常器官，本發(fā)明人購買了心臟、肺、肝 臟、腎臟及胰臟的商品化組織切片(Biochain)。簡單地說，用二曱苯和乙 醇處理石蠟包埋的標本，用蛋白封閉試劑(Dako Cytomation, Carpinteria, CA ) 進行了封閉。加入含抗B7330N抗體的抗體稀釋溶液(1:50)，用基質(zhì)-色 原(substrate-chromogen ) (DAKO liquid DAB chromogen， DakoCytomation) 進行了染色。最后，用蘇木精染色組織標本，以將細胞核與細胞質(zhì)區(qū)分開 來。使用psiU6BX3.0構(gòu)建B7330N特異性的siRNA表達載體本發(fā)明人按照以前的報道(W02004076623),使用psiU6BX3.0 siRNA表 達載體建立了基于載體的RNAi系統(tǒng)。通過將表1中的雙鏈寡核苷酸克隆到 psiU6BX3.0載體中的B&I位點，制備了針對B7330N的siRNA表達載體 (psiU6BX-B7330N)。通過psiU6BX3.0載體的多克隆位點中的5w'I和///"d III，分別制備了對照質(zhì)粒psiU6BX-模擬。表1.插入siRNA表達載體的雙鏈寡核苦酸的序列psi-U6BX-模擬(對照)SEQ ID NO5'-CACCGTGTCTTCAAGCTTGAAGACTA-3'145'-AAAATAGTCTTCAAGCTTGAAGACAC-3'15ps,-"6S乂-sM5'-CACCGCACTGTTTCAATGCCTTTTTCAAGAG AAAAGGCATTGAAACAGTGC-3'165'-AAAAGCACTGTTTCAATGCCTTTTCTCTTGAA AAAGGCATTGAAACAGTGC-3'175'-CACCGAGAAATCCTTCGGTGACATTCAAGAG ATGTCACCGAAGGAI I I CTC-3'205'-AAAAGAGAAATCCTTCGGTGACATCTCTTGA ATGTCACCGAAGGATTTCTC-3'21下劃線表示B7330N特異性的siRNA序列。B7330N特異性siRNA的基因沉默效應(yīng)將人乳腺癌細胞系T47D或BT-20鋪在15-cm皿上(4xl06細胞/皿)，使 用FuGENE6 (Roche)試劑，按供應(yīng)商的推薦，轉(zhuǎn)染了 psiU6BX-B7330N和作 為陰性對照的psiU6BX-模擬各16嗎。轉(zhuǎn)染24小時后，再接種(re-seeded) 細胞以用于集落形成測定(2x106細胞/10 cm皿)、RT-PCR (2xl06細胞/10 cm 皿)和MTT測定(2乂106細胞/孔)。對于T47D或BT-20細胞，本發(fā)明人分別 使用含0.7 mg/ml或0.6mg/ml新霉素(Geneticin, Invitrogen)的培養(yǎng)基選擇了 B7330N導(dǎo)入細胞。其后，在三周內(nèi)，本發(fā)明人每2天更換一次培養(yǎng)基。為 了評價siRNA的功能，于新霉素選擇后的第7天從細胞中提取了總RNA, 然后，通過半定量RT-PCR確認了 siRNA的基因敲低(knockdown)效應(yīng)，所 述半定量RT-PCR使用以下針對B7330N和G^PD/Z的特異性引物組對于內(nèi)部對照GL4尸D7/: 5，-ATGGAAATCCCATCACCATCT畫3 ， (SEQ IDNO: ll)和5'國GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3，(SEQIDNO: 2);對于B7330N: 5，-GGATGAAACATACCCCATCA-3, (SEQ ID NO: 12) 和5'-ATGACACTAGTGCCCTTGG國3， (SEQ ID NO: 13)。而且，使用T47D 或BT-20細胞系表達siRNA的轉(zhuǎn)染子在含新霉素的選擇培養(yǎng)基中生長了 28 天。用4%多聚曱醛固定后，用Giemsa溶液(Giemsa solution)對轉(zhuǎn)染細胞進 行了染色以評價集落形成。進行了 MTT測定以定量細胞的生存力。在含有 新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天后，以0.5 mg/ml的濃度加入MTT溶液(3-(4，5-二 曱基-噻唑-2-基)-2,5- 二苯基溴化四唑) (3-(4，5-dimethylthiazol隱2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma)。 37°C 保溫2.5小時后，加入酸-SDS (0.01N HC1/10%SDS);劇烈混合懸浮液，然 后于37。C保溫過夜以溶解深藍色的晶體。用Microplate Reader 550 (BioRad) 測定了 570nm處的吸光度。為了評價siRNA的功能，在進行選擇7天后從 細胞中提取總RNA,在進行選擇10天后，使用Cell Counting Kit-8 (Dojindo)， 按照生產(chǎn)商的說明書進4亍了 MTT測定。用Microplate Reader 550 (BioRad) 測定570nm波長處的吸光度。對于集落形成測定，用4%多聚曱醛固定細胞 15分鐘，然后用Giemsa溶液(Merck)染色。各實—瞼一式三次進行。穩(wěn)定表達B7330N的NIH3T3細胞的建立使用FUGENE6，如上述那樣用全長B7330N及N476A突變表達載體轉(zhuǎn) 染NIH3T3細胞。轉(zhuǎn)染的細胞在含0.9 mg/ml遺傳霉素(G418) (Invitrogen)的 培養(yǎng)基中溫育。采用有限稀釋法對克隆的NIH3T3細胞進行亞克隆。使用抗 HA單克隆抗體，通過western印跡分析和免疫細胞化學(xué)分別檢查帶HA標 簽的B7330N的表達和亞細胞定位。最終建立了數(shù)個克隆，命名為野生型 -B7330N和N476A-B7330N。為了考察野生型B7330N或N476A-B7330N的 生長促進作用，我們?yōu)楸舜霜毩⒌膬闪忠吧?B7330N-NIH3T3 (野生型-l 和-2)、彼此獨立的兩林細胞N476A-B7330N-NIH3T3 (N476A-1和-2)以及彼 此獨立的兩抹模擬-NIH3T3 (模擬-l和-2)各接種了 5000個細胞，在6天中， 每天采用MTT測定對細胞進行計數(shù)。實驗一式三組。外源性B7330N的western印跡分析本發(fā)明人使用 pCAGGS-B7330N-HA 、 pCAGGS-N476A-HA或pCAGGS-N611A-HA轉(zhuǎn)染的COS7細胞，以及作為陰性對照的模擬，分別 考察了 COS7細胞中外源性B7330N蛋白的表達。在含50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、 150醒ol/L NaCl和0.1%蛋白酶抑制劑合劑III (protease cocktail inhibitor III) (Calbiochem, San Diego, CA)的0.1% NP-40裂解緩沖液中裂解 細胞。在8°/。 SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離細胞裂解物，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維 素膜上，然后與作為第一抗體的大鼠抗HApAb—起溫育。再與作為第二抗 體的綿羊抗大鼠IgG-HRP (Amersham Biosciences)—起溫育，然后用ECL試 劑盒(Amersham Biosciences)使信號可視化。為了檢測分泌的B7330N蛋白， 在轉(zhuǎn)染后，將用B7330N-、 N476A-、或N611A轉(zhuǎn)染的COS7細胞在無血清 培養(yǎng)基中維持48小時，然后培養(yǎng)4天。同樣地，利用大鼠抗HA-pAb和抗 大鼠IgG-HRP檢測了細胞裂解物和濃縮培養(yǎng)基中的B7330N蛋白。|3肌動蛋 白pAb (1:2000稀釋)用作蛋白上樣對照(克隆AC-15, Sigma-Aldrich， MO)。 為了確證B7330N蛋白的糖基化，最初亦按上述配制了細胞裂解物，只是其中不含蛋白酶抑制劑合劑III。將細胞裂解物各lO^ll與裂解緩沖液10 |Lll和1U的N-糖苷酶F (Calbiochem, San Diego, CA)混合，然后于37°C溫育1小時。 將反應(yīng)物與SDS樣品緩沖液一起煮沸。自分泌測定將B7330N轉(zhuǎn)染的COS7細胞于不含F(xiàn)CS的培養(yǎng)基中維持2天，然后 將親本COS7細胞在含有或不含B7330N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)了 4天，以確證細 胞生長的自分泌刺激。采用細胞計數(shù)監(jiān)測了 B7330N對細胞生長的效應(yīng)，所 述細胞計數(shù)通過血細胞計數(shù)器和如前述的MTT測定進行。在含0.1% FCS 的DMEM中培養(yǎng)細胞(5xl03細胞/孔)?？笲7330N抗體的中和效應(yīng)使用血細胞計數(shù)器，通過細胞計數(shù)監(jiān)測了抗B7330N抗體對細胞生長的 效應(yīng)。將乳腺癌細胞系T47D和HBL-100接種于12孔微量培養(yǎng)板(5x104細 胞/孔)，在McCoy's 5A培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天，所述McCoy's 5A培養(yǎng)基中含 1% FBS，并添加了 10.2 [ig/mL親和純化的抗B7330N pAb或者作為陰性對 照的PBS(-)。按上述方法測定了細胞數(shù)。結(jié)果作為乳腺癌細胞內(nèi)表達上調(diào)基因的、指稱為UDP-N-乙酰-a-D-半乳糖胺: 多肽N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶6的B7330W的鑒定本發(fā)明人使用展示27648種人類基因的cDNA微陣列分析了來自77例 閉經(jīng)前乳腺癌患者的癌細胞的基因表達模式，鑒定了在乳腺癌細胞中普遍 上調(diào)的493個基因。其中，本發(fā)明人著眼于被指稱為UDP-N-乙酰-a-D-半乳 糖胺:多肽N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶6 (0!LiVr6)的B7330N,該基因位于 染色體12ql3，其mRNA轉(zhuǎn)錄物由11個外顯子構(gòu)成，長度為4381或4556 個堿基。在77例可獲得表達數(shù)據(jù)的乳腺癌病例的27例(35% )中，B7330N 的表達是升高的。為了確認該基因在乳腺癌中的表達圖式，本發(fā)明人使用 乳腺癌細胞系及包含正常乳房細胞的正常人組織進行了半定量RT-PCR分 析。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)與正常乳房導(dǎo)管細胞及其它正常組織相比，B7330N 在12例臨床乳腺癌標本(低度分化型病變)的7例中顯示表達升高(圖la)， 并且在20例乳腺癌細胞系的7例中是過高表達的(圖lb)。為了進一步考 察該基因的表達圖式，本發(fā)明人以B7330N的cDNA片段為探針，對多種人 類組織和乳腺癌細胞系進行了 northern印跡分析。結(jié)果，本發(fā)明人確認了約 5kb的轉(zhuǎn)錄物的表達僅限于正常人的胎盤、胰臟、胃及氣管(圖lc)。本發(fā) 明人使用乳腺癌northern印跡進一步考察了這些轉(zhuǎn)錄物的表達圖式，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)，與包括乳腺和骨髓的正常人組織相比，其在乳腺癌細胞系中特異性過 高表達(圖ld)。04丄iVr6基因編碼可在體外糖基化纖連蛋白的622個氨基酸的蛋白，其 在成纖維細胞系中表達，表明其可能參與癌胚性纖連蛋白的合成。SMART 和PFAM計算機預(yù)測顯示GALNT6包含信號肽、處于180-370位殘基的 Glycos—transf—2基序，和處于496-622位殘基的RICIN基序。外源性B7330N的表達為了進一步考察B7330N的性質(zhì)，本發(fā)明人考察了這些基因產(chǎn)物在哺乳 動物細胞內(nèi)的亞細胞定位。首先，本發(fā)明人將表達B7330N蛋白的質(zhì)粒 (pCAGGS-B7330N-HA)瞬時轉(zhuǎn)染入COS7細胞中，使用抗HA標簽抗體的免 疫細胞化學(xué)分析顯示在轉(zhuǎn)染后72小時內(nèi)，外源性B7330N蛋白以分泌小 泡中的顆粒狀(granulous pattern)的形式呈現(xiàn)于所有被轉(zhuǎn)染的COS7細胞內(nèi)(圖2a)。接著，為了驗證B7330N的細胞外分泌，本發(fā)明人使用瞬時轉(zhuǎn)染了 設(shè)計為表達B7330N的質(zhì)粒(參照材料和方法部分)的COS7細胞的細胞裂 解物和培養(yǎng)基，進行了 western印跡分析，C末端HA標簽抗體4企測出了蛋 白質(zhì)向培養(yǎng)基中的分泌(圖2b)。我們發(fā)現(xiàn)通過western印跡分析估計的B7330N產(chǎn)物的分子量比由 cDNA序列計算出的預(yù)測分子量大(圖2b)。由于B7330N的一級氨基酸序列 包含兩個預(yù)測的N-連接糖基化共有序列，為了確認這兩個較大的B7330N 產(chǎn)物是否是糖基化的，本發(fā)明人首先用N-糖苷酶處理了蛋白。結(jié)果，最大 的B7330N蛋白從細胞裂解物中消失，這說明該蛋白在哺乳動物細胞內(nèi)是糖 基化的(圖3a)。接著，為了確定N-連接的糖基化位點，本發(fā)明人建立了 B7330N蛋白的潛在N-糖基化位點的突變構(gòu)建體(參照材料和方法部分)。 然后，本發(fā)明人分別用這些質(zhì)粒，野生型、N476A或N611A轉(zhuǎn)染了 COS7 細胞，使用抗HA-標簽抗體進行了免疫印跡。有趣的是，本發(fā)明人觀察到 N476A轉(zhuǎn)染細胞的最大的條帶消失，而野生型和N611A的細胞裂解物卻沒 有變化，這表示Asn-476是推測的糖基化位點(圖3b)。進一步，為了確 定對于B7330N分泌而言糖基化是否是必要的，本發(fā)明人考察了 COS7細胞 中的外源性N476A和野生型B7330N蛋白是否分泌到培養(yǎng)基中。有趣的是， 外源性野生型B7330N分泌到培養(yǎng)基中，但在培養(yǎng)基中卻檢測不出N476A 蛋白，這提示B7330N蛋白在Asn-476處的糖基化是分泌所必需的(圖3c)。乳腺癌細胞中內(nèi)源性B73307V的表達本發(fā)明人制備了針對B7330N的多克隆抗體，采用Western印跡分析考 察了來源于乳腺癌細胞系SKBR3、 T47D以及作為實驗對照的HMEC(人哺 乳動物上皮細胞)的細胞裂解物中B7330N蛋白的內(nèi)源性表達(圖7a)。兩 個乳腺癌細胞系均顯示高水平的B7330N表達，而正常的乳腺上皮細胞系 HMEC細胞未顯示表達。接著，使用抗B7330N多克隆抗體進行了乳腺癌 細胞系T47D的免疫細胞化學(xué)分析，結(jié)果顯示，與外源性表達的B7330N蛋 白相同，內(nèi)源性B7330N蛋白的定位也是呈現(xiàn)乳腺癌細胞內(nèi)分泌小泡中的顆 粒狀物的形式(圖7b)。為了進一步考察乳腺癌及正常組織切片中的B7330N明人在乳腺癌的兩種不同的組織學(xué)亞型即乳頭管狀癌(571T)和導(dǎo)管內(nèi)癌(164T)的細胞質(zhì)中鑒定出了強染色，但這種表達在正常乳房組織(425N) 中基本上未檢出(圖7c)。此外，在心臟、肺、肝臟、腎臟和胰臟中均未 觀察到表達，這與Northern印跡分析結(jié)果相一致(圖7d)。設(shè)計為降低B7330N的表達的小干擾RNA(siRNA)的生長抑制效果 為評價B7330N的生長促進作用，本發(fā)明人通過基于哺乳動物載體的 RNA干擾(RNAi)技術(shù)(參見材料與方法)在顯示B7330N過高表達的乳腺癌 細胞系T47D和BT-20中敲低了內(nèi)源性B7330N的表達(圖4)。本發(fā)明人通 過半定量RT-PCR實驗考察了 B7330N的表達水平。如圖4a所示，在被考 察基因的兩個siRNA構(gòu)建體中，B7330N特異性siRNA(sil和si2)與對照 siRNA構(gòu)建體(psiU6BX-模擬)相比抑制了表達。為確認B7330N特異性 siRNA的細胞生長抑制，本發(fā)明人分別進行了 MTT測定和集落形成測定(圖 4b、 c)。結(jié)果，導(dǎo)入B7330NsiRNA.構(gòu)建體抑制了這些乳腺癌細胞的生長， 這與上述該基因表達下降的結(jié)果相一致。每個結(jié)果均得到了 3次獨立實驗 的驗證的。因而，本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)提示，B7330N在乳腺癌的細胞增殖中具 有重要功能。為了進一步確認B7330N的生長促進效果，本發(fā)明人建立了穩(wěn)定表達外 源性B7330N的NIH3T3衍生細胞(NIH3T3-野生型-B7330N-1, -2和 NIH3T3-N476A-B7330N-l,-2細胞)。Western印跡分析顯示兩個衍生克隆 中分別顯示高水平的外源性野生型B7330N蛋白和N476A-B7330N蛋白(圖 8a)。其后的MTT測定顯示三個衍生細胞系，NIH3T3-B7330N-1和-2的 生長明顯快于用模擬質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞(NIH3T3-模擬-l，-2和-3細胞)，而另一 方面，與野生型-B7330N-l， -2相比，N476A-B7330N蛋白細胞的生長是適 度的(圖8b)。這顯示B7330N表達可能表達依賴性地增強細胞生長。進一步，本發(fā)明人在野生型-B7330N細胞中觀察到了 N-糖基化形式， 但在N476A-B7330N中卻沒有觀察到N-糖基化(圖8a)。通過這些結(jié)果可以 確認在上述N-糖苦酶測定的處理后，較大的條帶消失(數(shù)據(jù)未示出)。B7330N生長增強的自分泌性本發(fā)明人從用于培養(yǎng)B7330N過高表達性COS7細胞的培養(yǎng)基制備了含 B7330N蛋白的培養(yǎng)基(圖5a)，并在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)了親本C0S7細胞。使用天然B7330N的這一實驗，揭示了 COS7細胞生長的增強(圖5)，該結(jié) 果強力支持了本發(fā)明人的以下結(jié)論B7330N這種分泌分子作為乳腺癌細胞 增殖中不可或缺的自分泌生長因子起作用。而且，當向支持乳腺癌細胞系 T47D細胞的培養(yǎng)基中加入抗B7330N pAb抗體時，與用PBS(-)處理相比， 該細胞系的生長受到顯著抑制(圖5b;左圖)，而不表達B7330N的HBL-100 細胞不受該pAb處理的影響(圖5b;右圖)。B7330N的二聚體化有報導(dǎo)指出 一些糖基轉(zhuǎn)移酶在細胞內(nèi)形成二聚體(E1-Battari A, W Glycobiology. 2003;13(12):941-53)，因此，本發(fā)明人通過免疫沉淀考察了 B7330N是否也可以寡聚化。當用抗HA抗體免疫沉淀了外源性pCAGGS-B7330N-HA蛋白時，使用 抗HA抗體的western印跡分析顯示，外源性B7330N蛋白呈現(xiàn)為與2倍于 預(yù)想分子量對應(yīng)的條帶。為了研究該假說，本發(fā)明人設(shè)計了兩種帶不同標簽的B7330N構(gòu)建體， 來考察同源寡聚化。用pCAGGS-B7330N-HA和pcDNA3.1-B7330N-myc共 轉(zhuǎn)染COS-7細胞，并分別使用抗HA或抗myc抗體進行共免疫沉淀。如圖 6所示，當使用抗myc抗體來沉降(pull down) pcDNA3.1-B7330N-myc時， 引起了 pCAGGS-B7330N-HA的共免疫沉淀；而當使用抗HA抗體來沉降 pCAGGS-B7330N-HA時，引起了 pcDNA3.1-B7330N-myc的共免疫沉淀。 這些發(fā)現(xiàn)顯示B7330N僅在活體細胞中可以構(gòu)建同源寡聚復(fù)合體。在本發(fā)明中，利用通過全基因組cDNA微陣列得到的乳腺癌精確表達 模式，本發(fā)明人分離了新基因B7330N,與正常人組織相比，該基因在乳腺 癌細胞中顯著過高表達。被指稱為UDP-N-乙酰-a-D-半乳糖胺:多肽N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶6 (04丄7Vr6)的B7330N在乳腺癌中的表達顯著提高，因此選擇該基因用于 研究。經(jīng)本發(fā)明人鑒定約5kb的轉(zhuǎn)錄物顯示癌特異性表達。本發(fā)明人證 實了用siRNA處理乳腺癌細胞可以有效抑制B7330N的表達，并可以顯著 抑制乳腺癌的細胞/腫瘤生長。這些發(fā)現(xiàn)提示B7330N可能在腫瘤細胞的生 長增殖中發(fā)揮重要作用，也可能是抗癌劑研發(fā)的有希望的靶標。討論在本文中，利用通過全基因組cDNA微陣列得到的乳腺癌精確表達模 式，本發(fā)明人分離了新基因B7330N，與正常人組織相比，該基因在乳腺癌 細胞中顯著過高表達。并且，本發(fā)明人進一步證實了用siRNA處理乳腺癌 細胞有效抑制了耙基因B7330N的表達，并顯著抑制了乳腺癌的細胞/肺瘤 生長。這些發(fā)現(xiàn)提示B7330N可能在腫瘤細胞的生長增殖中發(fā)揮重要作用， 可以成為抗癌劑研發(fā)的有希望的靶標。被指稱為UDP-N-乙酰-a-D-半乳糖胺:多肽N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶6 (GALNT6 )的B7330N在乳腺癌中的表達顯著提高，因此選擇該基因用于 研究。經(jīng)本發(fā)明人鑒定約5kb的轉(zhuǎn)錄物顯示癌特異性表達。本發(fā)明人證 實了用siRNA處理乳腺癌細胞可以有效抑制B7330N的表達，并可以顯著 抑制乳腺癌的細胞/腫瘤生長。這些發(fā)現(xiàn)提示B7330N可能在腫瘤細胞的生 長增殖中發(fā)揮重要作用，也可能是抗癌劑研發(fā)的有希望的靶標。工業(yè)實用性與非癌性的乳房導(dǎo)管上皮相比，人基因573^W的表達在乳腺癌中明顯 增強。因而，該基因作為乳腺癌的診斷標志是有用的，而其編碼的蛋白在 乳腺癌的診斷測定中是有用的。此外，本發(fā)明人還證明，新蛋白B7330N的表達促進細胞生長，而對應(yīng) 于57B(W基因的小干擾RNA抑制細胞生長。這些發(fā)現(xiàn)顯示B7330N蛋 白刺激致癌活性。因此，這些新癌蛋白中的每一個均是用于開發(fā)抗癌藥物 的有用的靶標。例如，阻斷B7330N表達或者抑制其活性的物質(zhì)具有作為抗 癌劑，特別是用于治療乳腺癌的抗癌劑的治療用途。這樣的物質(zhì)的例子包 括針對B733(W基因的反義寡核苷酸、小干擾RNA和核酶，以及識別B7330N 的抗體。盡管已經(jīng)詳細地并且參考本發(fā)明的具體實施方案描述了本發(fā)明，但本 領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地認識到，可對本發(fā)明進行各種變化和修改而不背離 本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1. 乳腺癌的診斷方法，該方法包括下述步驟(a)檢測生物樣品中編碼SEQ ID NO25所示氨基酸序列的基因的表達水平；和(b)將表達水平的上升與該疾病相關(guān)聯(lián)。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中，采用選自下組的任何一種方法檢測所述 表達水平(a) 檢測編碼SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的mRNA;(b) 檢測包含SEQIDNO:25所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和(c) 檢測包含SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的生物活性。
3. 用于治療或預(yù)防乳腺癌的化合物的篩選方法，該方法包括下述步驟(a) 使受試化合物與選自下組的多肽接觸(1) 包含SEQIDNO:25所示氨基酸序列的多肽；(2) 包含SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列或者包含與SEQ ID NO: 25具有至少約80%同源性的序列的多肽，(3) 由在嚴緊條件下與由SEQIDNO:24或26所示核苷酸序列構(gòu) 成的多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQID NO: 25所示氨基酸序列構(gòu)成的多肽等價的生物活性，(b) 檢測受試化合物與多肽之間的結(jié)合活性；和(c) 選擇與多肽結(jié)合的化合物。
4. 用于治療或預(yù)防乳腺癌的化合物的篩選方法，該方法包括下述步驟(a) 使受試化合物與選自下組的多肽接觸(1 )包含SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列的多肽，(2 )包含SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列或者包含與SEQ ID NO: 25 具有至少約80%同源性的序列的多肽，(3 )由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO: 24或26所示核苷酸序列構(gòu)成的 多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列構(gòu)成的多肽等價的生物活性；(b) 檢測步驟(a)的多肽的生物活性；和(c) 選擇與不存在該受試化合物時檢出的生物活性相比，抑制所述多肽的生物活性的化合物。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中，所述生物活性為細胞增殖活性。
6. 用于治療或預(yù)防乳腺癌的化合物的篩選方法，該方法包括下述步驟(a) 使受試化合物與選自下組的多肽接觸；(1 )包含SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列的多肽；(2 )包含SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列或包含與SEQ ID NO: 25具 有至少約80%同源性的序列的多肽;(3 )由在嚴緊條件與由SEQ ID NO: 24或26所示核苷酸序列構(gòu)成的多 核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQ ID NO: 25 所示氨基酸序列構(gòu)成的多肽等價的生物活性；(4 )包含SEQ ID NO:25的部分氨基酸序列的多肽，該多肽包含(1 ) (3)中任一多肽的糖基化位點，(b) 檢測所述多肽的糖基化水平；和(c) 選擇這樣的化合物與不存在該受試化合物時檢出的糖基化水平相 比，該化合物抑制多肽的糖基化水平。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述糖基化水平為SEQIDNO:25所示氨基 酸序列的天冬酰胺476或其同源位置的糖基化水平。
8. 用于治療或預(yù)防乳腺癌的化合物的篩選方法，該方法包括下述步驟(a) 使表達選自下組的多肽的細胞與受試化合物接觸 (1)包含SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列的多肽；(2 )包含SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列或包含與SEQ ID NO: 25具 有至少約80%同源性的序列的多肽；(3 )由在嚴緊條件與由SEQ ID NO: 24或26所示核苷酸序列構(gòu)成的多 核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQ ID NO: 25 所示氨基酸序列構(gòu)成的多肽等價的生物活性；(4)包含SEQIDNO:25的部分氨基酸序列的多肽，該多肽包含(l) ~(3)中任一多肽的糖基化位點，和(b) 選擇這樣的化合物與不存在該受試化合物時檢出的糖基化水平相 比，該化合物抑制多肽的糖基化水平。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中所述糖基化水平為SEQIDNO:25所示氨基 酸序列的天冬酰胺476或其同源位置的糖基化水平。
10. 用于治療或預(yù)防乳腺癌的化合物的篩選方法，該方法包括下述步驟(a) 使表達包含SEQ ID NO:24或26所示核苷酸序列的多核苷酸的細胞 與受試化合物接觸；和(b) 選擇這樣的化合物與不存在該受試化合物時檢出的表達水平相 比，所述化合物降低包含SEQ ID NO:24或26所示核苷酸序列的多核芬酸 的表達水平。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中所述細胞為乳腺癌細胞。
12. 用于治療或預(yù)防乳腺癌的化合物的篩選方法，該方法包括下述步驟(a) 使導(dǎo)入了載體的細胞與受試化合物接觸，其中所述載體含有標志基 因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和在該轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的調(diào)控下表達的報道基因，所述標記基 因包含SEQ ID NO:24或26所示核苷酸序列；(b) 測定所述報道基因的表達水平或活性；和(c) 選擇這樣的化合物與不存在該受試化合物時檢出的所述報道基因 的表達水平或活性相比，該化合物降低所述報道基因的表達水平或活性。
13. 用于治療或預(yù)防乳腺癌的組合物，所述組合物含有藥物有效量的針 對多核苷酸的反義多核苷酸或小干擾RNA，以及藥物可接受的載體，其中 所述多核苷酸編碼選自下組的多肽(a) 包含SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列的多肽；(b) 包含其中一個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入和/或添加的 SEQ ID NO:25所示氨基酸序列，并且具有與由SEQ ID NO: 25所示氨基酸 序列構(gòu)成的蛋白等價的生物活性的多肽；(c )由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO: 24或26所示核香酸序列構(gòu)成的 多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQ ID NO: 25 所示氨基酸序列構(gòu)成的多肽等價的生物活性； 作為活性成分，以及藥物可接受的載體。
14. 權(quán)利要求13的組合物，其中所述小干擾RNA含有SEQ ID NO:18 或22所示的核香酸序列作為靶序列。
15. 權(quán)利要求14的組合物，其中所述siRNA具有通式 5，-[A]-[B]-[A，]-3，，其中[A]為對應(yīng)于SEQIDNO:18或22所示核苦酸序列的核糖核香酸序列， [B]為由3-23個核苷酸構(gòu)成的核糖核香酸序列，且 [A，]為由[A]的互補序列構(gòu)成的核糖核苷酸序列。
16. 權(quán)利要求13的組合物，所述組合物包含轉(zhuǎn)染增強劑。
17. 用于治療或預(yù)防乳腺癌的組合物，所述組合物含有藥物有效量的針 對選自下組的多肽的抗體作為活性成分，并且含有藥物可接受的載體(a) 包含SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列的多肽；(b) 包含其中一個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入和/或添加的 SEQ ID NO:25所示氨基酸序列，并且具有與由SEQ ID NO: 25所示氨基酸 序列構(gòu)成的蛋白等價的生物活性的多肽；和(c )由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO: 24或26所示核苷酸序列構(gòu)成的 多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQ ID NO: 25 所示氨基酸序列構(gòu)成的多肽等價的生物活性。
18. 用于治療或預(yù)防乳腺癌的組合物，所述組合物含有藥物有效量的通 過權(quán)利要求3-12任一項的方法選擇的化合物作為活性成分，并含有藥物可 接受的載體。
19. 用于治療或預(yù)防乳腺癌的組合物，所述組合物含有藥物有效量的抑 制SEQ ID NO:25所示氨基酸序列中天冬酰胺476的糖基化的物質(zhì)作為活性 成分，并且含有藥物可接受的載體。
20. 用于治療或預(yù)防乳腺癌的方法，該方法包括施用藥物有效量的反義 多核苷酸或小干擾RNA的步驟，所述反義多核苷酸或小干擾RNA針對編 碼選自下組的多肽的多核苷酸(1 )包含SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列的多肽；(2)包含其中一個或多個氨棊酸發(fā)生取代、缺失、插入和/或添加的 SEQ ID NO:25所示氨基酸序列，并且具有與由SEQ ID NO: 25所示氨基酸 序列構(gòu)成的蛋白等價的生物活性的多肽；和(3 )由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO: 24或26所示核苷酸序列構(gòu)成的 多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQ ID NO: 25 所示氨基酸序列構(gòu)成的多肽等價的生物活性。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述siRNA含有SEQ ID NO:18或22所 示的核芬酸序列作為靶序列。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中所述siRNA具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3'， 其中[A] 為對應(yīng)于SEQ ID NO:18或22所示核苷酸序列的核糖核苷酸序列，[B] 為由3-23個核苷酸構(gòu)成的核糖核苷酸序列，且 [A，]為由[A]的互補序列構(gòu)成的核糖核苷酸序列。
23. 權(quán)利要求20的方法，其中所述組合物包含轉(zhuǎn)染增強劑。
24. 用于治療或預(yù)防乳腺癌的方法，該方法包括施用藥物有效量的抗體 的步驟，所述抗體針對選自下組的多肽(a) 包含SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列的多肽；(b) 包含其中一個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入和/或添加的 SEQ ID NO:25所示氨基酸序列，并且具有與由SEQ ID NO: 25所示氨基酸 序列構(gòu)成的蛋白等價的生物活性的多肽；和(c )由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO: 24或26所示核苷酸序列構(gòu)成的 多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQ ID NO: 25 所示氨基酸序列構(gòu)成的多肽等價的i物活性。
25. 用于治療或預(yù)防乳腺癌的方法，該方法包括施用藥物有效量的通過 權(quán)利要求3-12任一項的方法選擇的化合物的步驟。
26. 用于治療或預(yù)防乳腺癌的方法，該方法包括施用藥物有效量的抑制 SEQ IDNO:25所示氨基酸序列中天冬酰胺476之糖基化的物質(zhì)的步驟。
27. 用于治療或預(yù)防乳腺癌的方法，所述方法包括施用藥物有效量的選 自由(a)-(c)構(gòu)成的組的多肽或編碼該多肽的多核苷酸的步驟(a) 包含SEQ ID NO: 25所示氨基酸序列的多肽或其片段；(b) 如下所述的多肽其包含其中一個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、 插入和/或添加的SEQ IDNO:25所示氨基酸序列，并且具有與由其中一個或 多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入和/或增加的SEQ ID NO: 25所示氨基酸 序列構(gòu)成的蛋白等價的生物活性，并且具有與由SEQ ID NO: 25所示氨基酸 序列構(gòu)成的蛋白等價的生物活性；(c )由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO: 24或26所示核苷酸序列構(gòu)成的 多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中所述多肽與由SEQ ID NO: 25 所示氨基酸序列構(gòu)成的多肽具有等價的生物活性，或所述多肽的片段。
28. 用于誘導(dǎo)抗肺瘤免疫的方法，該方法包括使選自由(a)-(c)構(gòu)成的組的多肽與抗原呈遞細胞接觸，或者將編碼該多肽的多核苷酸或包含該多核苷酸的載體導(dǎo)入抗原呈遞細胞的步驟(a) 包含SEQIDNO:25所示氨基酸序列的多肽，或其片段；(b) 包含其中一個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入和/或添加的 SEQ ID NO:25所示氨基酸序列，并且具有與由SEQ ID NO: 25所示氨基酸 序列構(gòu)成的蛋白等價的生物活性的多肽；和(c )由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO: 24或26所示核苷酸序列構(gòu)成的 多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中所述多肽與由SEQ ID NO: 25 所示氨基酸序列構(gòu)成的多肽具有等價的生物活性，或所述多肽的片段。
29. 權(quán)利要求28的用于誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，其中該方法還包括給 受試者施用抗原呈遞細胞的步驟。
30. 用于治療或預(yù)防乳腺癌的藥物組合物，其包含藥物有效量的選自由 (a)-(c)構(gòu)成的組的多肽或編碼該多肽的多核苷酸作為有效成分，并且包含藥 物可接受的載體(a) 包含SEQIDNO:25所示氨基酸序列的多肽，或其片段；(b) 包含其中一個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入和/或添加的 SEQ ID NO:25所示氨基酸序列，并且具有與由SEQ ID NO: 25所示氨基酸 序列構(gòu)成的蛋白等價的生物活性的多肽；(c )由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO: 24或26所示核苷酸序列構(gòu)成的 多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中所述多肽與由SEQ ID NO: 25 所示氨基酸序列構(gòu)成的多肽具有等價的生物活性，或所述多肽的片段。
31. 權(quán)利要求30的藥物組合物，其中所述多核苷酸被納入表達載體中。
32. —種診斷試劑，其包含與編碼包含SEQIDNO:25所示氨基酸序 列的多肽的多核普酸雜交的寡核苷酸，或與包含SEQ ID NO:25所示氨基酸 序列的多肽結(jié)合的抗體。
33. —種雙鏈分子，包含有義鏈和反義鏈，其中所述有義鏈含有對應(yīng)于 SEQ IDNO:18或22的核糖核芬S吏序列，且其中反義鏈含有與所述有義鏈互 補的核糖核苷酸序列，其中所述有義鏈和所述反義鏈相互雜交形成所述雙 鏈分子；而且其中該雙鏈分子當^皮導(dǎo)入表達B7330N基因的細胞時，抑制所 述基因的表達。
34. 權(quán)利要求33的雙鏈分子，所述有義鏈含有來自SEQ ID NO: 24的約19-約25個連續(xù)的核苷酸。
35. 權(quán)利要求33的雙鏈分子，所述有義鏈由對應(yīng)于SEQ ID NO:18或22的核糖核苷酸序列構(gòu)成。
36. 權(quán)利要求33的雙鏈分子，其中單一核糖核苷酸轉(zhuǎn)錄物包含有義鏈 和反義鏈，雙鏈分子還包含連接所述有義鏈和所述反義鏈的單鏈核糖核苷 酸序列。
37. —種載體，其編碼權(quán)利要求33的雙鏈分子。
38. 權(quán)利要求37的載體，該載體編碼具有二級結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄物，其中所 述轉(zhuǎn)錄物包含有義鏈和反義鏈。
39. 權(quán)利要求37的載體，其中，所述轉(zhuǎn)錄物進一步包含連接所述有義 鏈和所述反義鏈的單鏈核糖核苷酸序列。
全文摘要
本申請?zhí)峁┬碌娜祟惢騁ALNT6，其在乳腺癌中表達明顯增加。該基因及由該基因編碼的多肽可以例如，在乳腺癌的診斷中用作開發(fā)針對該疾病的藥物的靶分子，例如siRNAs，以及用于減弱乳腺癌的細胞生長。
文檔編號C07K16/32GK101278060SQ20068003636
公開日2008年10月1日 申請日期2006年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月29日
發(fā)明者中村佑輔, 中鶴修一, 片桐豐雅 申請人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司