專利名稱：一種t載體介導的測定3′端側(cè)翼未知序列的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種利用限制性內(nèi)切酶(Restriction Endonuclease)酶切、pUCm-T 載體連接和巢式 PCR(Nest Polymerase Chain Reaction)擴 增等技術(shù)，基于部分已知DNA(Deoxyribonucleic Acid)序列確定其3'端側(cè)翼未知DNA序 列的方法。
背景技術(shù)：
隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，越來越多的功能性蛋白質(zhì)逐步地被報道出來。為了使 功能性蛋白質(zhì)實現(xiàn)高水平表達以便于后期的分離純化和工業(yè)化生產(chǎn)，人們開始研究它們的 基因序列和異源表達，從而推動基因組學的發(fā)展。但現(xiàn)在報道的許多新基因僅獲取了部分 DNA序列，而不了解某個基因完整的DNA序列時，就無法深入研究其結(jié)構(gòu)和功能，因此需要 從它的部分已知DNA序列獲得完整序列。隨機測序法是通過大量的隨機測定DNA序列，借 助計算機進行排序的方法來獲取所需要的DNA序列，而該方法存在很大的偶然性，通常會 耗費很大的人力和物力。3'-和 5' -RACE(3‘ and 5' Rapid Amplification of cDNA Ends)法是在已知部分mRNA序列的情況下，獲取目的基因完整的mRNA序列，但不能確定基 因的上下游調(diào)控元件序列。另外，RACE法較繁瑣，mRNA又極其不穩(wěn)定，反轉(zhuǎn)錄還特別容易受 到豐度低和高級結(jié)構(gòu)的影響，因此效果也不是很理想。利用同位素或生物素標記探針對基 因組文庫進行雜交篩選的方法，更是費時費力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、應用范圍廣、成本低廉、高效準確、pUCm-T載 體介導的PCR擴增方法，能夠基于已知DNA序列確定其3'端側(cè)翼未知DNA序列。本發(fā)明的內(nèi)容包括①選用限制性內(nèi)切酶雙酶切基因組DNA ；②純化的酶切產(chǎn)物 用Taq酶或Ex Taq酶進行補齊和3 ‘端加A (Adenine)反應，與pUCm_T載體連接；③利用 引物設(shè)計軟件選定T載體上的一段特異性互補序列作為3'端引物、兩條靠近未知序列端 的已知DNA序列上的序列作為5'端引物；④以pUCm-T載體連接物為模板，用設(shè)計的引物 進行二輪的PCR(巢式PCR)擴增，并對其擴增片段進行克隆和測序。具體步驟如下(I)PCR引物的設(shè)計根據(jù)已知DNA序列設(shè)計兩條5'端特異性引物，命名為 Primer-Fl和Primer_F2 (18_22bp) ；Primer_F2的3'端距待測序列要保留30bp以上長度， 比ft~imer-Fl接近待測的未知序列(圖1和圖4)；針對本發(fā)明引入的pUCm-T載體，在其T/ A克隆位點的下游選定一條3'端特異性引物OObp，Tm值58°C )，命名為T-PrimerR(圖 2和圖5)。(2)限制性內(nèi)切酶的選擇分析已知DNA序列上的限制性內(nèi)切酶位點，選用從 I^imer-Fl到待測的未知序列之間沒有酶切位點的兩種限制性內(nèi)切酶。本發(fā)明可供選擇常 用的產(chǎn)生 5'粘性末端的內(nèi)切酶有 EcoR I ,Hind IILBgl IKSal I ,BamH I、Nco I、Xba I 和Xho I等；產(chǎn)生平齊末端的有EcoR V、SnaB I和^^ I等；產(chǎn)生3'粘性末端的有tot I、Pst I , Sac I 禾口 Kpn I 等。(3)PCR模板的構(gòu)建運用步驟(2)選擇的兩種內(nèi)切酶對基因組DNA進行雙酶切，純化的酶切產(chǎn)物用Taq酶或Ex Taq酶進行補齊和3'端加A反應，與pUCm-T載體連接，即 可作為PCR模板。此步驟若選用的兩種內(nèi)切酶都是5'粘性或平齊末端，只需選用普通Taq 酶；否則需要選用帶有3' -5'外切酶活性的Ex Taq酶。(4)巢式PCR擴增以步驟(3)的pUCm-T連接物為模板，采用Primer-Fl和 T-PrimerR為引物進行第一輪PCR擴增；再以首輪PCR擴增產(chǎn)物為模板，采用Primer-F2和 T-PrimerR為引物進行第二輪PCR擴增。將兩輪PCR(巢式PCR)擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠 電泳檢測，根據(jù)巢式PCR原理可以快速驗證其擴增的產(chǎn)物是否為目的片段。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明使用特異性引物進行巢式PCR擴增，可以確定出已知DNA序列3'端側(cè)翼的 未知序列。它與現(xiàn)行的方法相比，具有如下的優(yōu)點1、操作簡便。與隨機測序法相比，避免了對基因組進行大規(guī)模的測序，也無需進行 繁瑣的計算和排序工作，從而節(jié)省了大量的人力、時間和財力。2、應用范圍廣。在已知部分DNA序列的基礎(chǔ)上，pUCm-T載體介導的PCR擴增可應 用于各種不同基因的3'端側(cè)翼未知序列的測定。3、操作限制少。只要有90bp左右的已知DNA序列就足夠操作，而且可供選擇的限 制性內(nèi)切酶較多。4、引物特異性強。本發(fā)明通過利用T載體介導的PCR方法，把隨機引物的擴增轉(zhuǎn) 變成特異性引物的擴增，大幅度提高了 PCR擴增的特異性和效率。5、結(jié)果驗證簡捷。巢式PCR擴增可快速驗證其擴增的產(chǎn)物是否為目標DNA片段， 具有簡捷、準確和實用性強等特點。6、未知序列長度不限。由于基因組DNA的酶切位點是隨機分布的，本發(fā)明可獲取 未知序列長達幾Kb的片段，而且序列的準確性和真實性不會因長度的增加而影響。7、成本低廉。本發(fā)明的核心還是簡單的PCR擴增，所以無需昂貴的儀器和試劑盒。


圖1 3 ‘和5 ‘粘性末端的PCR模板構(gòu)建圖宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl基因組DNA經(jīng)產(chǎn)生3'和5'粘性末端的 限制性內(nèi)切酶雙酶切后，用Ex Taq酶補齊和3'端加A反應，與pUCm_T載體連接構(gòu)建PCR 模板。圖2 引物Cel5A-Fl、Cel5A-F2和Τ-PrimerR在3，和5'粘性末端的PCR模板上 的位置圖3:宇佐美曲霉EOOl第5家族葡聚糖酶基因(cel5A)3'端側(cè)翼的測序結(jié)果圖4:5'粘性末端的PCR模板構(gòu)建圖宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl基因組DNA經(jīng)產(chǎn)生5‘粘性末端的限制性 內(nèi)切酶雙酶切后，用Taq酶補齊和3'端加A反應，與pUCm_T載體連接構(gòu)建PCR模板。圖5 引物Cell2A-Fl、Cell2A-F2和Τ-PrimerR在5，粘性末端的PCR模板上的位
置
圖6:宇佐美 曲霉EOOl第12家族葡聚糖酶基因(cell2A)3'端側(cè)翼的測序結(jié)果
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳 細說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001 cel5A 3'端側(cè)翼序列的測定。(I)DNA雙酶切產(chǎn)物的制備選用Pst I和Bgl II對宇佐美曲霉基因組DNA進行雙 酶切。構(gòu)建如下雙酶切體系10XH Buffer 2 μ 1，Pst I 1 μ 1，Bgl II 1 μ 1，基因組DNA 10 μ 1，無菌水6 μ 1 ；將該體系在37°C水浴中反應4h后。純化回收雙酶切產(chǎn)物并溶于20 μ 1 無菌水中。(2)酶切產(chǎn)物的補齊和3'端加A反應雙酶切產(chǎn)物20μ1，IOXEx Taq Buffer 2. 5 μ l，dNTP0. 5μ l，Ex Taq 酶 0· 25 μ 1，無菌水 1. 75 μ 1 ；72°C反應 IOmin0 目的產(chǎn)物命名 為 cel5A3UT。(3)。615八3肌與口肌111-11的連接50% PEG4000 1 μ 1,10ΧΤ4 DNA Ligase Buffer 1μ 1，pUCm-T 1μ 1，T4 DNA Ligase 1μ 1，cel5A3UT 6 μ 1 ； 16°C連接過夜。目的產(chǎn)物命名 為 pUCm-T-cel5A3UT。(4)cel5A 3 ‘端側(cè)翼第一輪 PCR: 10 X PCR Buffer 5 μ 1, dNTP 3μ 1, pUCm-T-cel5A3UT 5 μ 1，Cel5A_Fl 1 μ 1，T-PrimerR 1 μ 1，無菌水 34. 5 μ 1，Taq 酶 0· 5 μ 1 ； 94°C 4min，30 個循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin0 目的產(chǎn)物命名為 cel5A3UT-0uto(5)cel5A 3 ‘端側(cè)翼第二 輪 PCR: 10 X PCR Buffer 5 μ 1, dNTP 3μ 1, cel5A3UT-0ut 1 μ 1，Cel5A_F21 μ 1，T-PrimerR 1 μ 1，無菌水 38. 5 μ 1，Taq 酶 0· 5 μ 1 ； 94°C 4min，30 個循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin0 目的產(chǎn)物命名為 cel5A3UT-In。(6) cel5A3UT-In的克隆及測序?qū)el5A3UT-In按照割膠回收試劑盒說明書的操 作步驟進行割膠回收，將純化的產(chǎn)物克隆到PUCm-T載體上進行測序，結(jié)果如圖3所示。實施例2宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001 cell2A 3'端側(cè)翼序列的測定。(I)DNA酶切產(chǎn)物的制備選用Sal I和BamH I對宇佐美曲霉基因組DNA進行雙酶 切。構(gòu)建如下酶切體系10XT Buffer 3 μ 1，Sal I 1μ l,BamH I 1 μ 1，基因組DNAlO μ 1， 無菌水5 μ 1 ；將該體系在37°C水浴中反應4h。純化回收雙酶切產(chǎn)物并溶于20 μ 1無菌水中。(2)酶切產(chǎn)物的補齊和3'端加A反應雙酶切產(chǎn)物20μ1，10XPCR Buffer 2. 5 μ l，dNTP 0. 5 μ 1，Taq 酶 0. 25 μ 1，無菌水 1. 75 μ 1 ；72°C反應 IOmin0 目的產(chǎn)物命名為 cell2A3UT。(3)。6112六3肌與口。011-11的連接50% PEG4000 1 μ 1,10ΧΤ4 DNA Ligase Buffer 1 μ 1，pUCm-T 1μ1，Τ4 DNA Ligase 1 μ 1，cell2A3UT 6 μ 1 ; 16°C連接過夜。目的產(chǎn)物命名 為 pUCm-T-cell2A3UT。
(4)cell2A 3 ‘端側(cè) 翼第一輪 PCR: 10XPCR Buffer 5μ 1, dNTP 3μ 1, pUCm-T-cell2A3UT5y 1，Cell2A_Fl 1 μ 1, T-PrimerR 1 μ 1,無菌水 34. 5 μ 1，Taq 酶 0. 5μ 1 -M0C 4min，30 個循環(huán)(94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C lmin)，72°C lOmin。目的產(chǎn)物命 名為 cell2A3UT-0ut。(5)cell2A 3 ‘端側(cè)翼第二 輪 PCR:10XPCR Buffer 5μ 1, dNTP 3μ 1, eel 12A3UT-0ut 1 μ 1，Cel 12A-F2 1 μ 1，T-PrimerR 1 μ 1，無菌水 38. 5 μ 1，Taq 酶 0. 5 μ 1 ； 940C 4min，30 個循環(huán)(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin0 目的產(chǎn)物命名為 cell2A3UT-In。(6)cell2A3UT-In的克隆和測序?qū)ell2A3UT-In按照割膠回收試劑盒說明書上 的操作步驟進行割膠回收，將純化的產(chǎn)物克隆到PUCm-T載體上進行測序，結(jié)果如圖6所示。
權(quán)利要求
1.一種PUCm-T載體介導的PCR擴增已知DNA序列3'端側(cè)翼未知序列的方法，其特征 在于對基因組DNA用限制性內(nèi)切酶進行雙酶切；純化的酶切產(chǎn)物采用Taq酶或Ex Taq酶 補齊和3'端加A，與pUCm-T載體連接；利用引物設(shè)計軟件選定T載體T/A克隆位點下游的 一段序列的互補序列作為3'端引物、兩條靠近未知序列端的已知DNA上的兩段序列作為 5'端引物；以pUCm-T載體連接物為模板，采用設(shè)計的引物進行巢式PCR擴增；(1)PCR引物的設(shè)計根據(jù)已知DNA序列設(shè)計兩條5'端特異性引物，命名為I^rimer-Fl 和Primer-F2 (18_22bp) ；Primer-F2的3 ‘端距待測序列要保留30bp以上長度，它比 Primer-Fl接近待測的未知序列；針對本發(fā)明引入的pUCm-T載體，在其T/A克隆位點的下 游選定一條3'端特異性引物，命名為T-PrimerR(20bp, Tm值58°C )；(2)限制性內(nèi)切酶的選擇根據(jù)對已知DNA序列上限制性內(nèi)切酶位點的分析，選用從 Primer-Fl到待測的未知序列之間沒有酶切位點的兩種內(nèi)切酶；本發(fā)明可供選擇的常用的 產(chǎn)生5'粘性末端的限制性內(nèi)切酶有EcoR I、Hind III、Bgl II, Sal I、BamH I、Nco I、 Xba I和Bio I等，產(chǎn)生平齊末端的有EcoR V、SnaB I和ka I等，產(chǎn)生3'粘性末端的有 Bmt I ,Pst I、Sac I 禾口 Kpn I 等；(3)PCR模板的構(gòu)建運用步驟(2)選擇的兩種內(nèi)切酶對基因組DNA進行酶切，純化的 酶切產(chǎn)物用Taq酶或Ex Taq酶進行補齊和3'端加A反應，與pUCm-T載體連接，即可作為 PCR模板；此步驟若選用的兩種內(nèi)切酶都是5'粘性或平齊末端，只需選用普通Taq酶，否則 需要選用帶有3' -5'外切酶活性的Ex Taq酶；(4)巢式PCR擴增以步驟(3)的pUCm-T連接物為模板，采用I^rimer-Fl和T-PrimerR 為引物進行第一輪PCR擴增；再以首輪PCR擴增產(chǎn)物為模板，采用ft~imer-F2和T-PrimerR 為引物進行第二輪PCR擴增；將兩輪PCR(巢式PCR)擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根 據(jù)巢式PCR原理可以快速驗證其擴增的產(chǎn)物是否為目的片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，操作過程中所使用的反應體系和條件如下(1)按如下的體系和條件雙酶切宇佐美曲霉EOOl基因組DNA(以Ml I和BamH I為代 表)10XT Buffer 3μ 1，Sal I 1 μ 1，BamH I 1 μ 1，基因組 DNA 10 μ 1，無菌水 5 μ 1 ；將 該體系在37°C水浴中反應4h ；純化回收雙酶切產(chǎn)物并溶于20 μ 1無菌水中；(2)按如下的體系和條件對酶切產(chǎn)物進行補齊和3'端加Α(以宇佐美曲霉EOOl的 cell2A 基因為代表)酶切產(chǎn)物 20μ 1，IOXPCR Buffer 2. 5 μ 1, dNTP 0. 5 μ 1，Taq 酶 0. 25 μ 1，無菌水1. 75 μ 1 ；72°C反應IOmin ；目的產(chǎn)物命名為cell2A3UT ；(3)按如下的體系和條件連接cell2A3UT與pUCm-T:50 % PEG40001 y 1, 10XT4DNALigase Buffer 1 μ 1, pUCm-T 1 μ 1, T4 DNA Ligase 1 μ 1，cell2A3UT 6μ 1 ； 16°C連接過夜；目的產(chǎn)物命名為pUCm-T-ce112A3UT ；(4)按如下的PCR體系和條件進行第一輪的PCR擴增10XPCRBuffer 5 μ 1, dNTP 3 μ 1, pUCm-T-cell2A3UT 5 μ 1，Cell2A_Fl 1 μ 1, T-PrimerR 1 μ 1,水 34.5 μ 1，Taq 酶 0. 5μ 1 -M0C 4min，30 個循環(huán)(94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C lmin)，72°C IOmin ；首輪 PCR 產(chǎn) 物命名為Cell2A3UT-0ut ；按如下的體系和條件進行第二輪的PCR擴增10XPCR Buffer 5 μ 1, dNTP 3μ 1，cell2A3UT-0utlμ 1，Cell2A-F2 1 μ 1, T-PrimerR 1 μ 1，水 38. 5 μ 1，Taq 酶 0. 5yl;94°C 4min，30 個循環(huán)(94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C lmin)，72°C IOmin ；第二輪 PCR 產(chǎn)物命名為 cell2A3UT-In。
全文摘要
本發(fā)明是一種利用限制性內(nèi)切酶酶切、pUCm-T載體和巢式PCR擴增等技術(shù)，基于已知DNA序列確定其3′端側(cè)翼未知DNA序列的方法。該方法通過選用限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA，純化的酶切產(chǎn)物用Taq酶或Ex Taq酶進行補齊和3′端加A反應，與pUCm-T載體連接；利用引物設(shè)計軟件選定T載體上T/A克隆位點下游的一段序列作為3′端引物；選定兩條靠近未知序列端的已知DNA上的序列作為5′端引物。以pUCm-T載體連接物為模板，用設(shè)計的引物進行巢式PCR擴增，并對其擴增片段進行克隆和測序。本發(fā)明具有操作簡便、應用范圍廣、操作限制少、結(jié)果驗證簡捷、未知序列長度不限和成本低廉等特點。
文檔編號C12Q1/68GK102140501SQ20101055086
公開日2011年8月3日 申請日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月19日
發(fā)明者史紅玲, 吳靜, 李劍芳, 汪俊卿, 譚中標, 鄔敏辰, 高金湖 申請人:江南大學