專(zhuān)利名稱(chēng)：一種體外人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的試驗(yàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胚胎干細(xì)胞定向分化技術(shù)，特別涉及一種體外人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的試驗(yàn)方法。
背景技術(shù)：
人胚胎干細(xì)胞(human Embnyonic Stem Cell, ES細(xì)胞)是屬于全能肝細(xì)胞，具有分化三個(gè)胚層的各種人體組織細(xì)胞的潛能。如何能誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為單一的，特定的細(xì)胞是目前研究的焦點(diǎn)，它將為組織工程和器官的替代治療帶來(lái)新的希望。目前，體外可誘導(dǎo)璞玉動(dòng)物(小鼠、大鼠、豚鼠等)ES細(xì)胞分化為神經(jīng)元、造血細(xì)胞、成肯細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管肉皮等多種類(lèi)型的細(xì)胞。由于人ES細(xì)胞建系成功率低，知道1998年美國(guó)的 Thomson才首次建立人的ES細(xì)胞系，所以有關(guān)人ES細(xì)胞的定向分化研究，目前仍很少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種方法，具體為一種將體外人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的試驗(yàn)方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所提供的技術(shù)方案是一種體外人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的試驗(yàn)方法，其特征在于，具體步驟為A)將0. 25%胰酶和0. lmg/mL的膠原酶iv配制在含有ImM CaCl2和20% KSR的 PBS溶液中，用其消化ES克隆，使其成為5-10個(gè)細(xì)胞的ES細(xì)胞團(tuán)。消化后懸浮在含有WNT 抑制劑DKKl (100ng/mL)和NODAL抑制劑LEFTY-A (500ng/mL)的無(wú)血清培養(yǎng)基中。B)將ES克隆短期孵育在明膠包被的培養(yǎng)皿中以去除飼養(yǎng)層細(xì)胞C)ES細(xì)胞團(tuán)在非粘附細(xì)菌培養(yǎng)皿中以每毫升6. 7X IO2個(gè)細(xì)胞團(tuán)的濃度在連續(xù)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，步驟C中所述連續(xù)分化培養(yǎng)基包括(1)DMEM/F12,20% KSR, 0. ImM NMAA, 2mM L-glutamine 培養(yǎng)基；(2)G-MEM,20% KSR，0. ImM NMAA, ImM pyruvate, 0. ImM BME 培養(yǎng)基；(3)G-MEM, 15% KSR，0. ImM NMAA, ImM pyruvate,0. ImM BME 培養(yǎng)基；作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，ES細(xì)胞團(tuán)在所述(1)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天；在所述(2)培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天；在所述(3)培養(yǎng)基中培養(yǎng)8天；在所述(4)培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天；接著，添力口 WNT 的抑制劑 DKK-I (100ng/mL)和 NODAL 的抑制劑 LEFTY-A (500ng/mL)。進(jìn)一步的，每平方厘米10-15個(gè)ES細(xì)胞簇重新鋪在含有多聚賴(lài)氨酸、層粘連蛋白和纖維連接蛋白的8孔培養(yǎng)玻片上，在含有10% KSR的ES分化培養(yǎng)基(G-MEM，0. ImM NMAA, ImM pyruvate,0. ImM BME)中培養(yǎng)。本發(fā)明的有益效果是具有方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、成功率高，全性好，來(lái)源豐富經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖
對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特征能更易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，從而對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍做出更為清楚明確的界定。一種體外人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的試驗(yàn)方法，具體步驟為A)將0. 25%胰酶和0. lmg/mL的膠原酶iv配制在含有ImM CaCl2和20% KSR的PBS 溶液中，用其消化ES克隆，使其成為5-10個(gè)細(xì)胞的ES細(xì)胞團(tuán)。消化后懸浮在含有WNT抑制劑DKKl (100ng/mL)和NODAL抑制劑LEFTY-A (500ng/mL)的無(wú)血清培養(yǎng)基中；B)將ES克隆短期孵育在明膠包被的培養(yǎng)皿中以去除飼養(yǎng)層細(xì)胞；C)ES細(xì)胞團(tuán)在非粘附細(xì)菌培養(yǎng)皿中以每毫升6. 7X102個(gè)細(xì)胞團(tuán)的濃度在以下連續(xù)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)(1)在DMEM/F12， 20% KSR, 0. ImM NMAA,2mM L-glutamine 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 2 天；(2)在 G-MEM，20% KSR，0. ImM NMAA, ImM pyruvate, 0. ImM BME 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 4 天；(3)在 G-MEM，15 % KSR，0. ImM NMAA, ImM pyruvate, 0. ImM BME 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 8 天；(4)在 G-MEM，10 % KSR, 0. ImM NMAA, ImM pyruvate，0. ImM BME培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天；20天后，添加WNT的抑制劑DKK-1 (100ng/mL)禾口 NODAL的抑制劑LEFTY-A (500ng/mL)。每平方厘米10-15個(gè)ES細(xì)胞簇重新鋪在含有多聚賴(lài)氨酸、層粘連蛋白和纖維連接蛋白的8孔培養(yǎng)玻片上，在含有10% KSR的ES分化培養(yǎng)基 (G-MEM, 0. ImM NMAA，ImM pyruvat e，0. ImMBME)中培養(yǎng)。在第25天，能夠觀察到Rx (神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞標(biāo)記)陽(yáng)性克??；在第50天，將出現(xiàn)豐富的Mitf (RPE祖細(xì)胞標(biāo)記)和1^x6陽(yáng)性克隆(30. 6士4. 7% )；在第60天，有鱗片狀和六角形樣的色素細(xì)胞出現(xiàn)；在第120天，抗Z0-1抗體顯示來(lái)源于人ES細(xì)胞的色素細(xì)胞形成緊密的連接。以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明所揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可不經(jīng)過(guò)創(chuàng)造性勞動(dòng)想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所限定的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種體外人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的試驗(yàn)方法，其特征在于， 具體步驟為A)將0.25%胰酶和0. lmg/mL的膠原酶iv配制在含有ImM CaCl2和20% KSR的PBS 溶液中，用其消化ES克隆，使其成為5-10個(gè)細(xì)胞的ES細(xì)胞團(tuán)。消化后懸浮在含有WNT抑制劑DKKl (100ng/mL)和NODAL抑制劑LEFTY-A (500ng/mL)的無(wú)血清培養(yǎng)基中；B)將ES克隆短期孵育在明膠包被的培養(yǎng)皿中以去除飼養(yǎng)層細(xì)胞；OES細(xì)胞團(tuán)在非粘附細(xì)菌培養(yǎng)皿中以每毫升6. 7X IO2個(gè)細(xì)胞團(tuán)的濃度在連續(xù)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的試驗(yàn)方法，其特征在于，步驟C中所述連續(xù)分化培養(yǎng)基包括(1)DMEM/F12,20%KSR, 0. ImM NMAA,2mM L-glutamine 培養(yǎng)基；(2)G-MEM,20%KSR，0. ImM NMAA, ImM pyruvate, 0. ImM BME 培養(yǎng)基；(3)G-MEM,15% KSR，0. ImM NMAA, ImM pyruvate,0. ImM BME 培養(yǎng)基；
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種體外人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的試驗(yàn)方法，其特征在于，在所述(1)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天；在所述( 培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天；在所述C3)培養(yǎng)基中培養(yǎng)8天；在所述(4)培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天；接著，添加 WNT 的抑制劑 DKK-I (100ng/mL)和 NODAL 的抑制劑 LEFTY-A (500ng/mL)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種體外人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的試驗(yàn)方法，其特征在于，每平方厘米10-15個(gè)ES細(xì)胞簇重新鋪在含有多聚賴(lài)氨酸、層粘連蛋白和纖維連接蛋白的8孔培養(yǎng)玻片上，在含有10% KSR的ES分化培養(yǎng)基(G-MEM，0. ImM NMAA, ImM pyruvate, 0. ImM BME)中培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種體外人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的試驗(yàn)方法，其步驟為A)將0.25％胰酶和0.1mg/mL的膠原酶iv配制在含有1mM CaCl2和20％KSR的PBS溶液中，用其消化ES克隆，使其成為5-10個(gè)細(xì)胞的ES細(xì)胞團(tuán)；B)將ES克隆短期孵育在明膠包被的培養(yǎng)皿中以去除飼養(yǎng)層細(xì)胞；C)ES細(xì)胞團(tuán)在非粘附細(xì)菌培養(yǎng)皿中以每毫升6.7×102個(gè)細(xì)胞團(tuán)的濃度在連續(xù)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本發(fā)明具有方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、成功率高，全性好，來(lái)源豐富經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N5/073GK102465111SQ20101055048
公開(kāi)日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月19日
發(fā)明者范國(guó)平, 薛志剛 申請(qǐng)人:范國(guó)平, 薛志剛