專利名稱：應(yīng)用雙親性多孔中空碳微球制備固定化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用雙親性多孔中空碳微球制備固定化酶的方法。
背景技術(shù)：
酶是一類具有催化活性的蛋白質(zhì)，能夠在溫和的反應(yīng)條件下高效、高選擇性的催化復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)。但是天然酶穩(wěn)定性差、易失活、以及難回收再利用的缺陷阻礙了酶催化的發(fā)展和應(yīng)用，而且在反應(yīng)體系中分離和提純酶也增加了其作為催化劑的成本。如果能夠?qū)崿F(xiàn)酶的固定化，將水溶性酶蛋白變?yōu)椴蝗苄怨腆w催化劑，不僅可以在一定程度上提高酶的穩(wěn)定性、活性和專一性等性能，更重要的是能夠輕易實(shí)現(xiàn)酶的回收再利用以及產(chǎn)物的分離提純，保證酶催化在工業(yè)應(yīng)用中的經(jīng)濟(jì)可行。酶固定化方法一般可粗分為4大類吸附法、共價結(jié)合法、交聯(lián)法和包埋法。包埋法固定化酶是在載體制備過程中將酶包埋在里面，適用于小分子量的酶的固定化，存在酶易泄漏，傳質(zhì)阻力等缺陷。共價結(jié)合法固定化酶使得酶與載體的結(jié)合很牢固，穩(wěn)定性好，但是固定化成本高，操作過程繁瑣復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)用雙親性多孔中空碳微球制備固定化酶的方法。本發(fā)明提供的制備固定化酶的方法，包括如下步驟將雙親性中空碳微球和待固定酶的溶液混合，4-45°C (如 4°C -25 °C >25 °C -30 °C >30 °C -45 °C )反應(yīng) 0.5-Mh(如 0. ^i-2h、ai-6h、Mi-iai、iai-24h)，得到固定化酶；所述雙親性中空碳微球按照如下方法制備在恒溫條件下，將酵母在水溶液或水中進(jìn)行碳化，得到雙親性中空碳微球；所述恒溫的溫度為 180-240°c之間的任一溫度(如 180°C _200°C或 200°C -240°C )。所述恒溫的時間可為8-14小時(8小時-10小時或10小時-14小時)。所述酵母可為啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，具體可為安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)的耐高溫高活性啤酒酵母。所述水溶液可為己二醛水溶液、NaOH水溶液或HNO3水溶液。所述酵母與所述水溶液的配比可為10-200g酵母IL水溶液，優(yōu)選為200g酵母IL水溶液。所述己二醛水溶液具體可為0. 01mol/L己二醛水溶液。所述NaOH水溶液具體可為lg/lOOmLNaOH水溶液。 所述HNO3水溶液具體可為lg/100mL HNOyK溶液。所述待固定酶可為水解酶、氧化還原酶、脫氫酶或異構(gòu)酶等；所述水解酶可為脂肪酶、β -葡萄糖苷酶、蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等；所述氧化還原酶可為過氧化氫酶、葡萄糖氧化酶等；所述脫氫酶可為乙醇脫氫酶等。所述異構(gòu)酶可為葡萄糖異構(gòu)酶等。所述固定化酶具體可為固定化脂肪酶；所述待固定酶的溶液由游離脂肪酶和 0. 02mol/L pH6. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液組成，脂肪酶濃度為％ig/mL ；所述雙親性中空碳微球與所述待固定酶的溶液的配比為0.05g 2mL;所述反應(yīng)的參數(shù)為4-25°C，振蕩 (IOOrpm)反應(yīng) 12h。
所述固定化酶具體可為固定化過氧化氫酶；所述待固定酶的溶液由游離過氧化氫酶和0. 05mol/L pH7. 0的NaH2PO3-Na2HPO3緩沖液組成，過氧化氫酶濃度為20-50mg/mL ；所述雙親性中空碳微球與所述待固定酶的溶液的配比為0.05g 4mL;所述反應(yīng)的參數(shù)為 4-25°C，振蕩(IOOrpm)反應(yīng) 0. 5-24h0所述固定化酶具體可為固定化葡萄糖氧化酶；所述待固定酶的溶液由游離葡萄糖氧化酶和0. 05mol/L pH5. 5的NaH2PO3-Na2HPO3緩沖液組成；葡萄糖氧化酶濃度為20mg/mL ； 所述雙親性中空碳微球與所述待固定酶的溶液的配比為0.05g 2mL ；所述反應(yīng)的參數(shù)為 30°C，振蕩(IOOrpm)反應(yīng) 6h。所述固定化酶具體可為固定化β-葡萄糖苷酶；所述待固定酶的溶液由游離 β -葡萄糖苷酶和0. 05mol/L pH4. 8的HAc-NaAC緩沖液組成，β -葡萄糖苷酶濃度為Img/ mL ；所述雙親性中空碳微球與所述待固定酶的溶液的配比為0.05g ImL;所述反應(yīng)的參數(shù)為45°C，振蕩(IOOrpm)反應(yīng)濁。以上任一所述方法制備得到的固定化酶也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明利用由酵母碳化得到的中空碳微球?yàn)楣潭ɑd體，利用吸附法將不同大小和類型的酶封裝包埋在中空碳微球的空腔里，實(shí)現(xiàn)酶的固定化。將中空碳微球作為固定化載體，具有如下優(yōu)點(diǎn)原料來源廣泛、成本低廉；表面具有大量的羥基、醛基和羧基等親水官能團(tuán)，同時也存在著呋喃環(huán)、芳香族和脂肪族碳鏈等疏水性基團(tuán)，利用載體表面的基團(tuán)與酶分子基團(tuán)之間的鍵合實(shí)現(xiàn)酶的固定化。該中空碳微球具有高比表面積、大的內(nèi)部空腔、豐富的表面官能團(tuán)、以及良好的生物相容性和雙親性(能夠均勻地分散在極性及非極性溶劑中)等優(yōu)點(diǎn)，可以獲得高載酶量、高酶活和高操作穩(wěn)定性的固定化酶，并且可以適用于水相和有機(jī)相的酶催化體系，具有一定的普適性。與常規(guī)的固定化方法相比，本發(fā)明提供的制備固定化酶的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)① 酶的封裝包埋和載體制備過程是分開進(jìn)行的，避免了酶的失活；②酶與載體之間為非共價作用，無需對載體表面基團(tuán)進(jìn)行修飾，方法簡單；③載體對酶蛋白起到保護(hù)作用，能有效防止強(qiáng)烈攪拌等外界因素對酶的損害，提高固定化酶的操作穩(wěn)定性；④殼壁上的孔道可以輕易讓底物和產(chǎn)物進(jìn)出，傳質(zhì)阻力??；⑤中空碳微球的雙親性為其用于有機(jī)介質(zhì)體系提供了可能；⑥大多數(shù)的酶都可以采用這種固定化方法，具有一定的普適性；⑦載酶量高，穩(wěn)定性強(qiáng)。


圖1為雙親性多孔中空碳微球的掃描電鏡(SEM)形貌照片。圖2為熒光脂肪酶示蹤的激光聚焦照片。圖3為固定化脂肪酶和等蛋白量游離脂肪酶催化轉(zhuǎn)酯化曲線圖4為固定化脂肪酶的重復(fù)操作穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。下述實(shí)施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。蛋白載量(mg/g)=(原溶液中的蛋白量-固定化后溶液中的蛋白量)/雙親性中空碳微球的質(zhì)量；蛋白含量利用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)測定，以mg計；雙親性中空碳微球的質(zhì)量為加入的質(zhì)量，以g計。實(shí)施例1應(yīng)用雙親性中空碳微球固定脂肪酶(1)雙親性中空碳微球的制備稱20g啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(商品名稱為耐高溫高活性啤酒酵母，購自安琪酵母股份有限公司，商品目錄號80000012)，分散于IOOml的0. 01mol/L己二醛水溶液中，然后轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜置于恒溫箱中在180°C下加熱14h，反應(yīng)結(jié)束后，收集沉淀，將得到的沉淀用去離子水洗滌，然后在20°C下干燥Mh，即得到雙親性中空碳微球。雙親性中空碳微球的掃描電鏡(SEM)形貌照片見圖1，粒徑為2-4微米，孔徑> 50nm。(2)固定化脂肪酶的制備游離脂肪酶(蛋白)商品名稱為Lipozyme TL，購自Sigma公司，型號為L0777。取50mg步驟⑴制備的雙親性中空碳微球，均勻分散到2mL脂肪酶溶液(由游離脂肪酶和0. 02mol/L pH6. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液組成；脂肪酶濃度為％ig/mL)中，25°C、 IOOrpm振蕩12h，離心分離，用IOmL 0. 02mol/L pH6. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液沖洗負(fù)載有脂肪酶的碳微球2-3次，即得蛋白載量為8. 22mg/g的固定化脂肪酶。(3)催化性能將200mg硝基苯棕櫚酸酯(p-NPP)溶于8mL lg/100mL正丁醇的正庚烷溶液中，然后加入50mg步驟(2)制備的固定化脂肪酶(或與固定化脂肪酶等蛋白量的游離脂肪酶)， 于40°C，150rpm水浴震蕩反應(yīng)，分別于反應(yīng)后0. 5h、lh、1. 5h、2h、3h、5h、7h取樣，通過氣相色譜測定反應(yīng)前后正丁醇濃度的變化，計算轉(zhuǎn)酯化率。氣相色譜相關(guān)參數(shù)氣相色譜儀為GC-2000 ；色譜柱柱長1. 5m、內(nèi)徑2mm，不銹鋼柱；填充物為5% SE-30 chromsorbm, AW. DMCS擔(dān)體，60-80目；載氣為高純氮?dú)?，流速?30mL/min ；柱箱溫度90°C，進(jìn)樣器溫度150°C，檢測器溫度150°C，進(jìn)樣量3 μ L。轉(zhuǎn)酯化率=(反應(yīng)前反應(yīng)體系中正丁醇的含量-反應(yīng)后反應(yīng)體系中正丁醇的含量)/反應(yīng)前反應(yīng)體系中正丁醇的含量χιοο%。固定化脂肪酶和游離脂肪酶的轉(zhuǎn)酯化率如圖3所示。當(dāng)反應(yīng)0. 5h時，固定化脂肪酶的催化的轉(zhuǎn)酯化率為27%，是等量游離酶的4. 3倍。反應(yīng)后，固定化酶的轉(zhuǎn)酯化率達(dá)到64. 4%，而游離酶的轉(zhuǎn)酯化率在反應(yīng)池后基本上趨于平衡，維持在41.3%。(4)操作穩(wěn)定性操作穩(wěn)定性用反應(yīng)周期的次數(shù)對固定化脂肪酶催化性能的影響來表征。將IOOmg硝基苯棕櫚酸酯(p_NPP)溶于8mL 0. 5g/100mL正丁醇的正庚烷溶液中， 然后加入50mg步驟( 制備的固定化脂肪酶，于40°C，150rpm水浴震蕩反應(yīng)lh，即為一個反應(yīng)周期；每個反應(yīng)周期結(jié)束后取樣通過氣相色譜測定反應(yīng)前后正丁醇濃度的變化，計算轉(zhuǎn)酯化率，并將固定化脂肪酶從反應(yīng)液中離心分離，用正庚烷清洗兩次，然后進(jìn)行下一個反應(yīng)周期的操作；共進(jìn)行30個反應(yīng)周期。將第一個周期固定化脂肪酶的轉(zhuǎn)酯化率定義為100%，其余每個周期的轉(zhuǎn)酯化率與第一個周期的轉(zhuǎn)酯化率的比值作為活力保留率。結(jié)果見圖4。固定化酶連續(xù)使用30次后，轉(zhuǎn)酯化率未出現(xiàn)明顯下降，具有良好的操作穩(wěn)定性。
(5)儲藏穩(wěn)定性取步驟( 制備的固定化脂肪酶室溫干燥儲藏130天，分別于儲藏前和儲藏后檢測的轉(zhuǎn)酯化率，轉(zhuǎn)酯化率的測定方法同步驟中的第一個反應(yīng)周期。將儲藏前固定化脂肪酶的轉(zhuǎn)酯化率定義為100%，儲藏后的轉(zhuǎn)酯化率與儲藏前的轉(zhuǎn)酯化率的比值作為活力保留率。室溫干燥儲藏130d后，活力保留率為94%，結(jié)果表明，固定化脂肪酶具有良好的儲藏穩(wěn)定性。(6)脂肪酶在載體中的封裝效果用熒光脂肪酶(異硫氰酸熒光素標(biāo)記的Lipozyme TL)代替步驟(2)中的脂肪酶， 其它同步驟O)，得到熒光標(biāo)記的固定化脂肪酶(裝載了熒光脂肪酶的兩親性多孔中空碳微球)。使用激光共聚焦顯微鏡對固定化脂肪酶進(jìn)行觀察，熒光脂肪酶示蹤的激光共聚焦照片見圖2。通過照片可以直觀地觀察到脂肪酶富集在兩親性多孔中空碳微球的內(nèi)部空腔，即實(shí)現(xiàn)了酶的封裝固定化。實(shí)施例2應(yīng)用雙親性中空碳微球固定脂肪酶(1)雙親性中空碳微球的制備同實(shí)施例1的步驟(1)。(2)固定化脂肪酶的制備游離脂肪酶(蛋白)購自Sigma公司，型號為L3126。取50mg步驟(1)制備的雙親性中空碳微球，均勻分散到2mL脂肪酶溶液(由游離脂肪酶和0. 02mol/L pH6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液組成；脂肪酶濃度為％ig/mL)中，4°C、 IOOrpm振蕩12h，離心分離，用IOmL 0. 02mol/L pH6. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液沖洗負(fù)載有脂肪酶的碳微球2-3次，即得蛋白載量為15. 89mg/g的固定化脂肪酶。(3)催化性能將200mg硝基苯棕櫚酸酯(p-NPP)溶于8mL lg/100mL正丁醇的正庚烷溶液中，然后加入50mg步驟(2)制備的固定化脂肪酶(或與固定化脂肪酶等蛋白量的游離脂肪酶)， 于40°C，150rpm水浴震蕩反應(yīng)，于反應(yīng)0. 5h取樣，通過氣相色譜測定反應(yīng)前后正丁醇濃度的變化，計算轉(zhuǎn)酯化率。固定化酶的轉(zhuǎn)酯化率為游離酶的3倍。實(shí)施例3、應(yīng)用雙親性中空碳微球固定過氧化氫酶(1)雙親性中空碳微球的制備稱20g啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(商品名稱為耐高溫高活性啤酒酵母，購自安琪酵母股份有限公司，商品目錄號80000012)，分散于IOOml的0. Olmol/L己二醛水溶液中，然后轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜置于恒溫箱中在240°C下加熱8h，反應(yīng)結(jié)束后，收集沉淀， 將得到的沉淀用去離子水洗滌，然后在20°C下干燥Mh，即得到雙親性中空碳微球(粒徑為 2-4微米，孔徑> 50nm)。(2)固定化過氧化氫酶的制備游離過氧化氫酶(蛋白)固體粉末，購于美國Sigma公司，產(chǎn)品號為C9322。取50mg步驟(1)制備的雙親性中空碳微球，均勻分散到4mL過氧化氫酶溶液(由游離過氧化氫酶和0. 05mol/L pH7. 0的NaH2PO3-Na2HPO3緩沖液組成；過氧化氫酶濃度為 20mg/mL)中，4 °C、100rpm 振蕩 0. 5h，離心分離，用 IOmL 0. 05mol/L pH7. 0 的
6NaH2PO3-Na2HPO3緩沖液沖洗負(fù)載有過氧化氫酶的碳微球2_3次，即得蛋白載量為3. 23mg/g 的固定化過氧化氫酶。(3)催化性能將50mg固定化過氧化氫酶(或與固定化過氧化氫酶等蛋白量的游離過氧化氫酶)分散在 ImL 0. 05mol/L ρΗ7· 0 的 NaH2PO3-Na2HPO3 緩沖液中，25 °C 預(yù)熱 5min,加入 5mL2. 87mol .Γ1過氧化氫水溶液(或0. 22mol .Γ1過氧化氫水溶液)，120rpm反應(yīng)IOh,離心終止反應(yīng)，過濾，在MOnm下測定上清液的吸光值，根據(jù)過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)曲線求得上清液中的過氧化氫的濃度，同時與不加過氧化氫酶的空白樣比較，計算過氧化氫的分解率。底物濃度對過氧化氫酶催化效率的影響見表1。表1底物濃度對過氧化氫酶催化效率的影響
權(quán)利要求
1.一種制備固定化酶的方法，包括如下步驟將雙親性中空碳微球和待固定酶的溶液混合，4-45°C反應(yīng)0. 514h，得到固定化酶；所述雙親性中空碳微球按照如下方法制備在恒溫條件下，將酵母在水溶液或水中進(jìn)行碳化，得到雙親性中空碳微球；所述恒溫的溫度為 180-240°C之間的任一溫度。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述恒溫的時間為8-14小時。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述酵母為啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；所述水溶液為己二醛水溶液、NaOH水溶液或HNO3水溶液；所述酵母與所述水溶液的配比為10-200g酵母IL水溶液，優(yōu)選為200g酵母IL水溶液。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述己二醛水溶液為0.01mol/L己二醛水溶液；所述NaOH水溶液為lg/100mL NaOH水溶液；所述HNO3水溶液為lg/100mL HNO3水溶液。
5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述待固定酶為水解酶、氧化還原酶、脫氫酶或異構(gòu)酶；所述水解酶為脂肪酶、葡萄糖苷酶、蛋白酶、淀粉酶或纖維素酶；所述氧化還原酶為過氧化氫酶或葡萄糖氧化酶；所述脫氫酶為乙醇脫氫酶；所述異構(gòu)酶為葡萄糖異構(gòu)酶。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述固定化酶為固定化脂肪酶；所述待固定酶的溶液由游離脂肪酶和0. 02mol/L pH6. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液組成，脂肪酶濃度為 %ig/mL;所述雙親性中空碳微球與所述待固定酶的溶液的配比為0.05g 2mL;所述反應(yīng)的參數(shù)為4-25°C，振蕩反應(yīng)12h。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述固定化酶為固定化過氧化氫酶；所述待固定酶的溶液由游離過氧化氫酶和0. 05mol/L pH7. 0的NaH2PO3-Na2HPO3緩沖液組成， 過氧化氫酶濃度為20-50mg/mL ；所述雙親性中空碳微球與所述待固定酶的溶液的配比為 0. 05g 4mL;所述反應(yīng)的參數(shù)為4-25°C，振蕩反應(yīng)0.5-Mh。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述固定化酶為固定化葡萄糖氧化酶；所述待固定酶的溶液由游離葡萄糖氧化酶和0. 05mol/L pH5. 5的NaH2PO3-Na2HPO3緩沖液組成；葡萄糖氧化酶濃度為20mg/mL ；所述雙親性中空碳微球與所述待固定酶的溶液的配比為0.05g 2mL;所述反應(yīng)的參數(shù)為30°C，振蕩反應(yīng)他。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述固定化酶為固定化葡萄糖苷酶；所述待固定酶的溶液由游離β -葡萄糖苷酶和0. 05mol/L pH4. 8的HAc-NaAC緩沖液組成， β-葡萄糖苷酶濃度為lmg/mL;所述雙親性中空碳微球與所述待固定酶的溶液的配比為 0. 05g ImL;所述反應(yīng)的參數(shù)為45°C，振蕩反應(yīng)池。
10.權(quán)利要求1至9中任一所述方法制備得到的固定化酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種應(yīng)用雙親性多孔中空碳微球制備固定化酶的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟將雙親性中空碳微球和待固定酶的溶液混合，4-45℃反應(yīng)0.5-24h，得到固定化酶；雙親性中空碳微球按照如下方法制備180-240℃下，將酵母在水溶液或水中進(jìn)行碳化，得到雙親性中空碳微球。本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)①酶的封裝包埋和載體制備分開進(jìn)行，避免酶的失活；②酶與載體之間為非共價作用，無需對載體表面基團(tuán)進(jìn)行修飾，方法簡單；③能有效防止強(qiáng)烈攪拌等外界因素對酶的損害，提高固定化酶的操作穩(wěn)定性；④傳質(zhì)阻力??；⑤中空碳微球的雙親性為其用于有機(jī)介質(zhì)體系提供了可能；⑥具有普適性；⑦載酶量高，穩(wěn)定性強(qiáng)。
文檔編號C12N11/14GK102443579SQ20101051234
公開日2012年5月9日 申請日期2010年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月12日
發(fā)明者倪德志, 關(guān)政榮, 孫運(yùn)輝, 楊森 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)