專利名稱：一種生物轉(zhuǎn)化沙棘葉黃酮制備高活性苯并吡喃-4-酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種沙棘提取技術(shù)，具體地說是涉及一種沙棘葉中提取沙棘黃酮的生物轉(zhuǎn)化沙棘葉黃酮制備高活性苯并吡喃-4-酮的方法。
背景技術(shù)：
沙棘是一種集醫(yī)療保健功能和生態(tài)環(huán)境改善功能為一體的具有極高使用價(jià)值的樹種，其果實(shí)、葉和莖皮中含有280多種化學(xué)成份，在綠色食品開發(fā)、醫(yī)療保健、疾病防治以及環(huán)境保護(hù)等方面都有良好的應(yīng)用前景。黃酮類化合物是沙棘最重要的功能活性成分之一。對于黃酮類物質(zhì)，在沙棘的果實(shí)和葉中都存在，但是葉中的黃酮要多得多，而且活性更好的苷元型黃酮的量要更多。黃酮類物質(zhì)是色原酮或色原烷的衍生物，以C6-C3-C6結(jié)構(gòu)為基本母核的天然產(chǎn)物，即兩個(gè)苯環(huán)通過3個(gè)碳原子結(jié)合而成。其中C3部分可以是脂鏈，或與C6部分形成六元或五元氧雜環(huán)。 黃酮類物質(zhì)主要由花色素、黃酮醇、黃酮、兒茶酚和黃烷酮組成，其中以黃酮醇類最為常見， 其次是黃酮類，其余則較少見。多具有顏色。這些黃酮糖苷類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)又包括苷和苷元兩類，植物界中的黃酮類化合物大部分以糖苷的形式存在，一部分以游離苷元形式存在。由沙棘果和葉中提取的沙棘黃酮(酚類化合物)是許多化合物的總稱，其中包括主要三羥基苯并吡喃-4-酮，山柰黃酮醇，五羥基-2-苯基苯并-4-吡喃酮，六羥基2，3雙氫黃酮醇和三羥基黃酮等，構(gòu)成苷類的糖有葡萄糖、異鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖，其存在形式為上述配基的糖苷。這些物質(zhì)對減少器質(zhì)性病變，諸如癌癥、動(dòng)脈硬化的發(fā)病率起到了重要作用。通過系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)沙棘的葉子和果實(shí)中，幾乎所有的沙棘黃酮都是由三羥基苯并吡喃-4-酮、 山柰黃酮醇，五羥基-2-苯基苯并-4-吡喃酮，六羥基2，3雙氫黃酮醇和三羥基黃酮這四種主要的苷元物質(zhì)和各種糖組成的糖苷型黃酮類化合物，游離的黃酮苷元很少。這種糖苷型的結(jié)構(gòu)使黃酮類化合物很穩(wěn)定，不易受環(huán)境影響而降解。自然界很多植物中的黃酮類化合物如大豆異黃酮，銀杏葉黃酮，竹葉黃酮等都是以這種糖苷型存在的。從動(dòng)物體對黃酮的吸收率來看，黃酮在動(dòng)物體內(nèi)的代謝途徑不相同，黃酮苷元可以直接被吸收進(jìn)入動(dòng)物血液中， 黃酮苷元比黃酮糖苷具有更高的生物利用率。目前對于沙棘黃酮的需求逐漸增加，特別是沙棘黃酮中的主要成分三羥基苯并吡喃-4-酮，但是普通沙棘黃酮不能完全滿足醫(yī)藥中間體方面需要，特別是活性方面還存在很大的不足，因此利用生物轉(zhuǎn)化方法，提升沙棘黃酮中主要有效成分三羥基苯并吡喃-4-酮的含量成為十分迫切需要解決的問題。目前黃酮在醫(yī)藥上應(yīng)用日益廣泛，尤其是沙棘黃酮的功效越來越受到重視。很多研究機(jī)構(gòu)和公司紛紛開始投入資金進(jìn)行沙棘黃酮深入開發(fā)研究。但是到目前為止大部分工作僅僅限于沙棘黃酮的常規(guī)提取，利用生物轉(zhuǎn)化的方法，提升沙棘黃酮的功效及生產(chǎn)研究未見報(bào)道。國內(nèi)其他類似提取制備沙棘黃酮的項(xiàng)目多采用普通的溶劑直接提取，傳統(tǒng)的提取制備方法提取率不高，環(huán)境污染嚴(yán)重，制備的黃酮活性也比較低，國內(nèi)生物轉(zhuǎn)化普遍使用酶直接反應(yīng)，這樣不但造成酶的大量浪費(fèi)，而且給后期分離純化帶來了很大問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種生物轉(zhuǎn)化沙棘葉黃酮制備高活性苯并吡喃-4-酮的方法。本發(fā)明一種生物轉(zhuǎn)化沙棘葉黃酮制備高活性苯并吡喃-4-酮的方法通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明一種生物轉(zhuǎn)化沙棘葉黃酮制備高活性苯并吡喃-4-酮的方法，其特征在于所述的方法包括如下步驟1)酶法生物轉(zhuǎn)化精提沙棘總黃酮步驟選用合適的微生物對沙棘葉進(jìn)行發(fā)酵處理；用半纖維素酶的生產(chǎn)菌株，生產(chǎn)所需要的專一性分離轉(zhuǎn)化三羥基苯并吡喃-4-酮的酶，對沙棘總黃酮進(jìn)行精提；利用微生物產(chǎn)生的各種酶充分分解沙棘葉細(xì)胞壁，提高沙棘總黃酮的提取率；對沙棘葉總黃酮的微生物轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行優(yōu)化組合，獲得最大產(chǎn)率；2)酶法轉(zhuǎn)化沙棘總?cè)~黃酮制備三羥基苯并吡喃-4-酮步驟(a)L2001 β -木聚糖酶液體發(fā)酵鏈霉菌L2001發(fā)酵條件農(nóng)業(yè)廢棄物復(fù)合碳源 3 %，酵母浸膏0.5%，蛋白胨1.0%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0. 60 %，磷酸氫二鉀0.15， 40°C條件下140r/min培養(yǎng)，產(chǎn)生的耐熱β -木聚糖酶2000U/ml以上；菌株產(chǎn)酶周期6d ；(b)LM-9i3-葡萄糖苷酶固體發(fā)酵米曲霉LM-9發(fā)酵條件麩皮與農(nóng)業(yè)廢棄物復(fù)合碳源組分比為2 3，蛋白胨添加量為培養(yǎng)基干料的1%。營養(yǎng)鹽溶液(％):硫酸鎂0.13%， 磷酸氫二鉀6.5%，硫酸亞鐵0.001 %，硝酸鈉0.2%，自然pH;料水比1 4，30°C條件下培養(yǎng)，生產(chǎn)的β -葡萄糖苷酶2000U以上；菌株產(chǎn)酶周期6d ；(c)酶的固定化酶轉(zhuǎn)化條件①、L2001木聚糖酶20U，料水比1 10，溫度65°C，pH值5. 8，作用時(shí)間lh，酶得率68%以上；②、LM-9葡萄糖苷酶10U，料水比1 8，溫度60°C，pH值5. 2，作用時(shí)間濁，酶得率68%以上；③、將L2001木聚糖酶和LM-9葡萄糖苷酶共同作用，料水比1 8，溫度60°C，pH 值5. 2，作用時(shí)間2h，沙棘葉黃酮轉(zhuǎn)化率達(dá)65%以上；3)三羥基苯并吡喃-4-酮分離純化步驟沙棘總黃酮經(jīng)過L2001木聚糖酶和LM-9葡萄糖苷酶固定化酶處理后得到三羥基苯并吡喃-4-酮，并對其進(jìn)行分離純化，過濾獲得澄清液體，進(jìn)行大孔樹脂吸附解吸，然后進(jìn)行凝縮噴霧干燥獲得成品。本發(fā)明一種生物轉(zhuǎn)化沙棘葉黃酮制備高活性苯并吡喃-4-酮的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比較有如下有益效果本發(fā)明選用的半纖維素酶是通過鏈霉菌L2001液體發(fā)酵產(chǎn)生， 其中β-木聚糖酶2000U/ml以上；而目前國內(nèi)外研究者報(bào)道的鏈霉菌產(chǎn)酶發(fā)酵水平在 1500U/ml左右，本發(fā)明方法發(fā)酵鏈霉菌產(chǎn)酶的生產(chǎn)技術(shù)處于領(lǐng)先地位。本方法提高了黃酮的得率，同時(shí)對沙棘粗黃酮進(jìn)行酶處理，利用葡萄糖苷酶使糖苷型黃酮轉(zhuǎn)化為活性高的苷元型物質(zhì)。本發(fā)明方法采用沙棘葉作為提取原料，生產(chǎn)原料為沙棘葉，原料充足、價(jià)廉，同時(shí)符合國家資源節(jié)約和環(huán)境保護(hù)要求。因此比沙棘果和種子提取黃酮能大幅度降低成本，提高生產(chǎn)效率，具有明顯的市場競爭力。本項(xiàng)目利用自主開發(fā)的高效固定化技術(shù)對酶進(jìn)行固定化處理，可以連續(xù)生產(chǎn)，節(jié)約成本，使后期的活性黃酮回收成本低，純度增加，所以能夠保證高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，減少了溶劑的用量。利用生物轉(zhuǎn)化方法來制備沙棘三羥基苯并吡喃-4-酮，可以滿足不斷增長的市場需求，加快我國利用生物轉(zhuǎn)化來制備植物活性成分的工業(yè)化進(jìn)程。


圖1為本發(fā)明一種生物轉(zhuǎn)化沙棘葉黃酮高活性苯并吡喃4酮的方法工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明一種生物轉(zhuǎn)化沙棘葉黃酮高活性苯并吡喃4酮的方法技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。如圖1所示，本發(fā)明一種生物轉(zhuǎn)化沙棘葉黃酮制備高活性苯并吡喃-4-酮的方法包括如下步驟1)酶法生物轉(zhuǎn)化精提沙棘總黃酮步驟選用合適的微生物對沙棘葉進(jìn)行發(fā)酵處理；用半纖維素酶的生產(chǎn)菌株，生產(chǎn)所需要的專一性分離轉(zhuǎn)化三羥基苯并吡喃-4-酮的酶，對沙棘總黃酮進(jìn)行精提；利用微生物產(chǎn)生的各種酶充分分解沙棘葉細(xì)胞壁，提高沙棘總黃酮的提取率；對沙棘葉總黃酮的微生物轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行優(yōu)化組合，獲得最大產(chǎn)率；2)酶法轉(zhuǎn)化沙棘總?cè)~黃酮制備三羥基苯并吡喃-4-酮步驟(a)L2001 i3-木聚糖酶液體發(fā)酵鏈霉菌L2001發(fā)酵條件農(nóng)業(yè)廢棄物復(fù)合碳源 3 %，酵母浸膏0. 5 %，蛋白胨1. 0 %，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0. 60 %，磷酸氫二鉀0.15， 40°C條件下140r/min培養(yǎng)，產(chǎn)生的耐熱β -木聚糖酶2000U/ml以上；菌株產(chǎn)酶周期6d ；(b)LM-9i3-葡萄糖苷酶固體發(fā)酵米曲霉LM_9發(fā)酵條件麩皮與農(nóng)業(yè)廢棄物復(fù)合碳源組分比為2 3，蛋白胨添加量為培養(yǎng)基干料的1%。營養(yǎng)鹽溶液(％):硫酸鎂0.13%， 磷酸氫二鉀6.5%，硫酸亞鐵0.001 %，硝酸鈉0.2%，自然pH;料水比1 4，30°C條件下培養(yǎng)，生產(chǎn)的β -葡萄糖苷酶2000U以上；菌株產(chǎn)酶周期6d ；(c)酶的固定化酶轉(zhuǎn)化條件①、L2001木聚糖酶20U，料水比1 10，溫度65°C，pH值5. 8，作用時(shí)間lh，酶得率68%以上；②、LM-9葡萄糖苷酶10U，料水比1 8，溫度60°C，pH值5. 2，作用時(shí)間濁，酶得率68%以上；③、將L2001木聚糖酶和LM-9葡萄糖苷酶共同作用，料水比1 8，溫度60°C，pH 值5. 2，作用時(shí)間2h，沙棘葉黃酮轉(zhuǎn)化率達(dá)65%以上；3)三羥基苯并吡喃-4-酮分離純化步驟沙棘總黃酮經(jīng)過L2001木聚糖酶和LM-9葡萄糖苷酶固定化酶處理后得到三羥基苯并吡喃-4-酮，并對其進(jìn)行分離純化，過濾獲得澄清液體，進(jìn)行大孔樹脂吸附解吸，然后進(jìn)行凝縮噴霧干燥獲得成品。所述的農(nóng)業(yè)廢棄物碳源為玉米芯。所述的選用合適的微生物是指酵母菌。所述的利用微生物產(chǎn)生的各種酶指β -木聚糖酶和β -葡萄糖苷酶。所述的農(nóng)業(yè)廢棄物碳源是指玉米芯、玉米秸稈、稻麩皮、麥麩皮中的任一種。實(shí)施例1。本發(fā)明一種生物轉(zhuǎn)化沙棘葉黃酮制備高活性苯并吡喃-4-酮的方法包括如下步驟1)酶法生物轉(zhuǎn)化精提沙棘總黃酮步驟選用合適的微生物對沙棘葉進(jìn)行發(fā)酵處理；用半纖維素酶的生產(chǎn)菌株，生產(chǎn)所需要的專一性分離轉(zhuǎn)化三羥基苯并吡喃-4-酮的酶，對沙棘總黃酮進(jìn)行精提；利用微生物產(chǎn)生的各種酶充分分解沙棘葉細(xì)胞壁，提高沙棘總黃酮的提取率；對沙棘葉總黃酮的微生物轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行優(yōu)化組合，獲得最大產(chǎn)率；2)酶法轉(zhuǎn)化沙棘總?cè)~黃酮制備三羥基苯并吡喃-4-酮步驟(a)L2001 i3-木聚糖酶液體發(fā)酵鏈霉菌L2001發(fā)酵條件農(nóng)業(yè)廢棄物復(fù)合碳源 3 %，酵母浸膏0. 5 %，蛋白胨1. 0 %，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0. 60 %，磷酸氫二鉀0.15， 40°C條件下140r/min培養(yǎng)，產(chǎn)生的耐熱β -木聚糖酶2000U/ml以上；菌株產(chǎn)酶周期6d ；(b)LM-9i3-葡萄糖苷酶固體發(fā)酵米曲霉LM_9發(fā)酵條件麩皮與農(nóng)業(yè)廢棄物復(fù)合碳源組分比為2 3，蛋白胨添加量為培養(yǎng)基干料的1%。營養(yǎng)鹽溶液(％):硫酸鎂0.13%， 磷酸氫二鉀6.5%，硫酸亞鐵0.001 %，硝酸鈉0.2%，自然pH;料水比1 4，30°C條件下培養(yǎng)，生產(chǎn)的β -葡萄糖苷酶2000U以上；菌株產(chǎn)酶周期6d ；(c)酶的固定化酶轉(zhuǎn)化條件1、L2001木聚糖酶20U，料水比1 10，溫度65°C，pH值5. 8，作用時(shí)間lh，酶得率 68%以上；2、LM-9葡萄糖苷酶10U，料水比1 8，溫度60°C，pH值5. 2，作用時(shí)間2h，酶得率 68%以上；3、將L2001木聚糖酶和LM-9葡萄糖苷酶共同作用，料水比1 8，溫度60°〇，？!1值 5. 2，作用時(shí)間2h，沙棘葉黃酮轉(zhuǎn)化率達(dá)65%以上；3)三羥基苯并吡喃-4-酮分離純化步驟沙棘總黃酮經(jīng)過L2001木聚糖酶和LM-9葡萄糖苷酶固定化酶處理后得到三羥基苯并吡喃-4-酮，并對其進(jìn)行分離純化，過濾獲得澄清液體，進(jìn)行大孔樹脂吸附解吸，然后進(jìn)行凝縮噴霧干燥獲得成品。所述的農(nóng)業(yè)廢棄物碳源為玉米芯、玉米秸稈、稻麩皮、麥麩皮等。本發(fā)明方法采用生物轉(zhuǎn)化法制備高活性沙棘黃酮，選擇合適的菌種發(fā)酵沙棘葉， 提高沙棘葉中黃酮的提取率，第二步利用自主產(chǎn)權(quán)的酶轉(zhuǎn)化粗提黃酮，使之轉(zhuǎn)化為三羥基苯并吡喃-4-酮。本發(fā)明方法選擇鏈霉菌L2001產(chǎn)生的耐熱β-木聚糖酶及米曲霉LM-9生產(chǎn)的 β-葡萄糖苷酶，在沙棘葉黃酮提取工藝的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)糖苷型的沙棘黃酮向苷元型的三羥基苯并吡喃-4-酮的高效轉(zhuǎn)化，且其轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同類產(chǎn)品。本發(fā)明方法利用廉價(jià)的沙棘葉作為提取制備的原料，替代了以前通常以沙棘果為原料的做法，突破了沙棘三羥基苯并吡喃-4-酮工業(yè)化成本過高的瓶頸，提高了沙棘黃酮的質(zhì)量，降低了沙棘黃酮的價(jià)格，必將為沙棘三羥基苯并吡喃-4-酮的應(yīng)用開辟廣闊的空間。本發(fā)明方法采用固定化酶技術(shù)，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)自動(dòng)化、連續(xù)化，大大降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，在后期的分析純化過程中節(jié)約了大量的能源。
權(quán)利要求
1.一種生物轉(zhuǎn)化沙棘葉黃酮制備高活性苯并吡喃-4-酮的方法，其特征在于所述的方法包括如下步驟1)酶法生物轉(zhuǎn)化精提沙棘總黃酮步驟選用合適的微生物對沙棘葉進(jìn)行發(fā)酵處理；用半纖維素酶的生產(chǎn)菌株，生產(chǎn)所需要的專一性分離轉(zhuǎn)化三羥基苯并吡喃-4-酮的酶，對沙棘總黃酮進(jìn)行精提；利用微生物產(chǎn)生的各種酶充分分解沙棘葉細(xì)胞壁，提高沙棘總黃酮的提取率；對沙棘葉總黃酮的微生物轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行優(yōu)化組合，獲得最大產(chǎn)率；2)酶法轉(zhuǎn)化沙棘總?cè)~黃酮制備三羥基苯并吡喃-4-酮步驟(a)L2001i3-木聚糖酶液體發(fā)酵鏈霉菌L2001發(fā)酵條件農(nóng)業(yè)廢棄物復(fù)合碳源3 %， 酵母浸膏0. 5%，蛋白胨1. 0%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0. 60%，磷酸氫二鉀0. 15，40°C 條件下140r/min培養(yǎng)，產(chǎn)生的耐熱β -木聚糖酶2000U/ml以上；菌株產(chǎn)酶周期6d ；(b)LM-9i3-葡萄糖苷酶固體發(fā)酵米曲霉LM-9發(fā)酵條件麩皮與農(nóng)業(yè)廢棄物復(fù)合碳源組分比為2 3，蛋白胨添加量為培養(yǎng)基干料的1%。營養(yǎng)鹽溶液(％)硫酸鎂0.13%，磷酸氫二鉀6.5%，硫酸亞鐵0. 001%，硝酸鈉0.2%，自然pH;料水比1 4，30°C條件下培養(yǎng)， 生產(chǎn)的β -葡萄糖苷酶2000U以上；菌株產(chǎn)酶周期6d ；(c)酶的固定化酶轉(zhuǎn)化條件①、L2001木聚糖酶20U，料水比1 10，溫度65°C，pH值5.8，作用時(shí)間111，酶得率68% 以上；②、LM-9葡萄糖苷酶10U，料水比1 8，溫度60°C，pH值5. 2，作用時(shí)間2h，酶得率68% 以上；③、將L2001木聚糖酶和LM-9葡萄糖苷酶共同作用，料水比1 8，溫度60°C，pH值 5. 2，作用時(shí)間2h，沙棘葉黃酮轉(zhuǎn)化率達(dá)65%以上；3)三羥基苯并吡喃-4-酮分離純化步驟沙棘總黃酮經(jīng)過L2001木聚糖酶和LM-9葡萄糖苷酶固定化酶處理后得到三羥基苯并吡喃-4-酮，并對其進(jìn)行分離純化，過濾獲得澄清液體，進(jìn)行大孔樹脂吸附解吸，然后進(jìn)行凝縮噴霧干燥獲得成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物轉(zhuǎn)化沙棘葉黃酮制備高活性苯并吡喃-4-酮的方法，其特征在于所述的農(nóng)業(yè)廢棄物碳源為玉米芯。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物轉(zhuǎn)化沙棘葉黃酮制備高活性苯并吡喃-4-酮的方法，其特征在于所述的選用合適的微生物是指酵母菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物轉(zhuǎn)化沙棘葉黃酮制備高活性苯并吡喃-4-酮的方法，其特征在于所述的利用微生物產(chǎn)生的各種酶指木聚糖酶和葡萄糖苷酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物轉(zhuǎn)化沙棘葉黃酮制備高活性苯并吡喃-4-酮的方法，其特征在于所述的農(nóng)業(yè)廢棄物碳源是指玉米芯、玉米秸稈、稻麩皮、麥麩皮中的任一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種沙棘提取技術(shù)，具體地說是涉及一種沙棘葉中提取沙棘黃酮的生物轉(zhuǎn)化沙棘葉黃酮制備高活性苯并吡喃-4-酮的方法。本發(fā)明一種生物轉(zhuǎn)化沙棘葉黃酮制備高活性苯并吡喃-4-酮的方法包括如下步驟1)酶法生物轉(zhuǎn)化精提沙棘總黃酮步驟；2)酶法轉(zhuǎn)化沙棘總?cè)~黃酮制備三羥基苯并吡喃-4-酮步驟；3)三羥基苯并吡喃-4-酮分離純化步驟。本方法提高了黃酮的得率，同時(shí)對沙棘粗黃酮進(jìn)行酶處理，利用葡萄糖苷酶使糖苷型黃酮轉(zhuǎn)化為活性高的苷元型物質(zhì)。
文檔編號C12R1/645GK102533892SQ201010266589
公開日2012年7月4日 申請日期2010年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月24日
發(fā)明者孫允武, 朱占軍, 李剛, 解芳, 馬正創(chuàng) 申請人:青?？灯丈锟萍脊煞萦邢薰?br>