專利名稱：一種針對(duì)液相非純化復(fù)合靶標(biāo)的電泳凝膠阻滯-selex技術(shù)方法
一種針對(duì)液相非純化復(fù)合靶標(biāo)的電泳凝膠阻滯-SELEX技
術(shù)方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種針對(duì)液相非純化靶標(biāo)的電泳凝膠阻滯-SELEX技術(shù)方法的建立和應(yīng)用，具體是將非純化的靶標(biāo)與文庫(kù)在液相中孵育，利用凝膠阻滯(EMSA)的原理，通過(guò)消減篩選，獲得針對(duì)篩選樣品與消減樣品中差異成分的寡核苷酸適配子，用于靶標(biāo)的檢測(cè)與功能抑制等，例如特定疾病包括腫瘤的檢測(cè)、輔助診斷、治療等。獲得的寡核苷酸配基還可用于鑒定疾病狀態(tài)相關(guān)的分子標(biāo)志物，如腫瘤標(biāo)志物。
背景技術(shù)：
指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，簡(jiǎn)稱SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技術(shù)，是近十幾年興起并迅速得到發(fā)展的高通量生物文庫(kù)篩選技術(shù)。其原理是利用單鏈隨機(jī)寡核苷酸(包括單鏈DNA和RNA)三維結(jié)構(gòu)靈活易變并易與各種靶標(biāo)分子結(jié)合，形成具有很強(qiáng)結(jié)合力復(fù)合物的特點(diǎn)，將人工構(gòu)建合成的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)與靶分子相互作用，保留特異結(jié)合的寡核苷酸并經(jīng)PCR擴(kuò)增、富集、然后制備成富集的單鏈文庫(kù)再與靶分子重新相互作用，如此經(jīng)反復(fù)數(shù)個(gè)循環(huán)，即可篩選獲得與該靶子特異結(jié)合的寡核苷酸配基(aptamer) (Tuerk C，et al. Science 1990 ；249 :505_510)。aptamer 具有精確識(shí)別、親和力高、易體外合成與修飾等特性，因此在抗體涉及的領(lǐng)域幾乎均可用 aptamer代替，在分析化學(xué)、基因調(diào)控、蛋白質(zhì)組研究、疾病治療與新藥研發(fā)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景(邵寧生等，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展2006 ；33 :329-335)。從最初的單一靶標(biāo)的篩選到后來(lái)的從混合體系中篩選某一類已知或未知靶分子的寡核苷酸配基，SELEX顯示出了其獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。尤其是近年來(lái)興起的復(fù)合靶子的SELEX技術(shù)，使得人們?cè)谀軌蛟诓恢腊蟹肿拥男再|(zhì)的情況下而對(duì)其進(jìn)行識(shí)別成為可能。這種可以不需要完全研究了解靶物質(zhì)的完整結(jié)構(gòu)，就可以篩選任何狀態(tài)下的靶物質(zhì)，甚至可以通過(guò)篩選獲得的配基來(lái)研究復(fù)合靶標(biāo)的分子標(biāo)志，為生物標(biāo)志物的鑒定提供了新的思路。隨著SELEX技術(shù)方法和研究進(jìn)展的突飛猛進(jìn)，涌現(xiàn)出了多種改良SELEX技術(shù)。我們實(shí)驗(yàn)室一直致力于改良SELEX方法的建立與應(yīng)用方面的研究，在建立以完整細(xì)胞為靶子的消減SELEX基礎(chǔ)上(Wang C，et al. J Biotechnol ；2003 102 :15_22)，繼續(xù)建立了組織切片SELEX技術(shù)(Li S et al. J Pathol ；2009, 218 :327_36)。這些方法的建立為生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、鑒定以及疾病的診斷、靶向治療提供了基礎(chǔ)。但對(duì)于多數(shù)疾病，早期、敏感的血清學(xué)診斷方法是臨床迫切需求的，要發(fā)展血清學(xué)生物標(biāo)志物及分子探針的研究，除了利用蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)方法，針對(duì)液相標(biāo)本的消減SELEX技術(shù)方法將提供有效的技術(shù)補(bǔ)充。因此，本實(shí)驗(yàn)將以大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)的含目的蛋白及多種大 桿菌蛋白的超聲上清為靶標(biāo)模型，利用凝膠阻滯(EMSA)原理分離結(jié)合和游離的單鏈寡核苷酸，建立一種新的液相非純化靶標(biāo)的消減SELEX技術(shù)方法，即EMSA-SELEX技術(shù)方法。本技術(shù)方法是利用凝膠阻滯的方法，將液相標(biāo)本與單鏈核酸文庫(kù)孵育，通過(guò)將孵育后的復(fù)合物經(jīng)過(guò)天然聚丙烯酰胺凝膠電泳達(dá)到分離結(jié)合核酸與游離核酸的目的，通過(guò)消減靶標(biāo)的陰性篩選，最終獲得與目的靶子結(jié)合的適配子。該發(fā)明所述方法可以在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，包括篩選獲得特定疾病的體液標(biāo)本或血液標(biāo)本的分子識(shí)別探針一 aptamer,以及利用aptamer釣取相應(yīng)的分子標(biāo)志物，獲得的疾病特異aptamer還可以用于靶標(biāo)分子的檢測(cè)，以及作為靶標(biāo)分子或靶標(biāo)分子特定結(jié)構(gòu)域的功能抑制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的 在于建立一種基于凝膠阻滯的分離技術(shù)，以液相的復(fù)合靶子標(biāo)本為靶的消減SELEX方法，并提出該技術(shù)方法在臨床疾病輔助診斷和鑒定疾病相關(guān)分子標(biāo)志物等方面的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案建立首先建立篩選靶與消減靶的模型，以某一融合蛋白的基因工程大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)后超聲上清為篩選靶，以標(biāo)簽蛋白的基因工程大腸桿菌誘導(dǎo)后超聲上清未消減靶；人工合成的單鏈DNA寡核苷酸文庫(kù)；利用凝膠阻滯的原理，對(duì)樣品進(jìn)行消減SELEX篩選；經(jīng)過(guò)數(shù)十輪篩選，篩選靶標(biāo)與消減靶標(biāo)之間的差異成分的寡核苷酸適配子得到富集，對(duì)富集的寡核苷酸文庫(kù)進(jìn)行鑒定；對(duì)富集的文庫(kù)進(jìn)行隨機(jī)測(cè)序；挑取數(shù)條序列，經(jīng)化學(xué)合成，然后鑒定與靶標(biāo)結(jié)合的特異性，獲得單個(gè)的特異適配子；對(duì)于差異成分未知的樣品，通過(guò)特異寡核苷酸適配子親和釣取其結(jié)合的靶分子，聯(lián)合生物質(zhì)譜鑒定，即可鑒定樣品中的差異成分，為生物標(biāo)志物的鑒定提供新的思路。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)1)本發(fā)明以液相的復(fù)合靶子為靶進(jìn)行消減SELEX篩選，適合篩選難以純化的靶標(biāo)、要求靶標(biāo)保持空間構(gòu)像的樣品、以及未知靶標(biāo)的液相標(biāo)本的篩選，如血液、唾液、尿液等臨床標(biāo)本的篩選。2)通過(guò)凝膠阻滯分離，可以將結(jié)合的寡核苷酸與游離的寡核苷酸有效分離，縮短了篩選輪次。3)通過(guò)引進(jìn)消減篩選，可以獲得針對(duì)兩類不同來(lái)源標(biāo)本中未知的差異成分的特異適配子，也可以獲得針對(duì)靶標(biāo)分子異構(gòu)體或特定結(jié)構(gòu)域的適配子。4)利用獲得的特異寡核苷酸適配子，可以親和釣取鑒定未知的靶分子，為生物標(biāo)志物的鑒定提供了新的思路。也可以利用獲得的特異寡核苷酸適配子檢測(cè)靶分子，或阻斷靶標(biāo)的生物功能。因此，本發(fā)明所建立的方法在基礎(chǔ)研究、臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。


圖1 本發(fā)明所用的篩選靶標(biāo)與消減靶標(biāo)的10% SDS-PAGE分析。其中，1、含消減靶標(biāo)的未純化大腸桿菌表達(dá)后超聲上清；2、含篩選靶標(biāo)的未純化大腸桿菌表達(dá)后超聲上清； 3、低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；圖2 篩選后文庫(kù)的鑒定。其中，a.文庫(kù)與未純化靶標(biāo)及消減靶標(biāo)的結(jié)合；b.第10 輪富集文庫(kù)與純化后消減靶蛋白及不同量的靶蛋白的結(jié)合。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)以大腸桿菌表達(dá)的含目的融合蛋白的未純化超聲上清為靶標(biāo)，以含標(biāo)簽蛋白的未純化超聲上清為消減靶標(biāo)，進(jìn)行消減SELEX篩選，以及對(duì)獲得的富集文庫(kù)的鑒定來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明。1.合成隨機(jī)單鏈DNA寡核苷酸文庫(kù)和相應(yīng)的引物GP35 文庫(kù)5，-GCAATGGTACGGTACTTCC (35N)CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3‘引物正義引物(Plong-I):5，-GCAATGGTACGGTACTTCC-3，反義引物(Pll):5，-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3反義引物(Pstem-Ioop)5’ -GCTAAGCGGGTGGGACTTCCTAGTCCCACCCGCTTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3’ 注N 代表A、Τ、G、C任意一種。Plong-I與Pll用于擴(kuò)增雙鏈產(chǎn)物，Plong-I與Pstem-loop用于擴(kuò)增單鏈產(chǎn)物。上述單鏈DNA(ssDNA)均由上海生工公司合成。2.利用大腸桿菌表達(dá)靶分子蛋白2. 1利用基因重組的方法，構(gòu)建含目的蛋白——葡糖基轉(zhuǎn)移酶 (Glucosyltransferase，GTF)催化區(qū)(Catalytic，CAT)基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，5，端融合 NusA標(biāo)簽蛋白基因以促進(jìn)蛋白可溶性表達(dá)。同樣的方法構(gòu)建僅表達(dá)NusA標(biāo)簽蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒。2. 2重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，常規(guī)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集表達(dá)菌體， 超聲破碎，離心后分別獲得含有目的蛋白NusA-CAT及NusA對(duì)照蛋白可溶性表達(dá)超聲上清； 該部分未純化上清作為篩選靶標(biāo)及消減靶標(biāo)。2. 3利用載體上含有的重組蛋白C端的His標(biāo)簽對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)后的超聲上清進(jìn)行純化，獲得純化的rNusA-CAT蛋白和NusA蛋白便于篩選后適配子的鑒定。3.基于EMSA分離的消減SELEX篩選3. 1將一定濃度的ssDNA文庫(kù)溶解于合適體積的三蒸水中，于100°C變性5min后立即置于冰上充分冷卻(第1輪篩選ssDNA文庫(kù)的用量為1，500pmol,以后每輪篩選的投入量遞減)；3. 2將ssDNA文庫(kù)與NusA蛋白的未純化上清在37°C共孵育2h，使ssDNA文庫(kù)與消減靶充分作用；3. 3ssDNA文庫(kù)與蛋白的共同孵育體系加入IOX上樣緩沖液，6%天然PAGE分離；3. 4卸膠，核酸染色后置于紫外燈下觀察。對(duì)照GP35的原庫(kù)的位置，將這一位置的膠回收，經(jīng)凝膠洗脫緩沖液洗脫6h以上后，乙醇沉淀回收。4.基于EMSA分離的陽(yáng)性篩選4. 1將消減文庫(kù)用篩選緩沖液溶解，于100°C變性5min后立即置于冰上充分冷卻； 4. 2文庫(kù)與含rNusA-CAT蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)菌體超聲上清在37°C共孵育2h (隨著篩選輪數(shù)的增加可適當(dāng)減少孵育時(shí)間，以增加篩選配基的親和力和特異性)，使消減文庫(kù)與篩選靶充分作用；4. 3將孵育體系進(jìn)行6 %的天然PAGE分離；
4. 4卸膠，核酸染色，置于紫外燈下觀察。對(duì)照GP35的原庫(kù)的位置，將高于這一位置以上的膠切膠(由于ssDNA與蛋白相結(jié)合后泳動(dòng)速度變慢，所以高于GP35的位置)，經(jīng)凝膠洗脫緩沖液洗脫他以上后，乙醇沉淀回收。5.結(jié)合文庫(kù)的擴(kuò)增5. 1將乙醇沉淀回收到ssDNA用適量的水溶解后，加入PCR反應(yīng)體系直接擴(kuò)增；5. 2PCR 反應(yīng)條件95°C 預(yù)變性 5min ；94°C 變性 lmin，37 °C 退火 80sec，58 °C 延伸 lmin，擴(kuò)增3個(gè)循環(huán)；最后58°C終延伸5min。5. 3再次PCR確定最終擴(kuò)增循環(huán)數(shù)取IOul上述PCR產(chǎn)物為模板，再次PCR擴(kuò)增， 從12個(gè)循環(huán)開(kāi)始，每3個(gè)循環(huán)取樣，8% 7M尿素膠分析。選擇目標(biāo)條帶PCR產(chǎn)量大、無(wú)雜帶的循環(huán)數(shù)為合適循環(huán)數(shù)，將剩余90ul PCR產(chǎn)物全部擴(kuò)增。5. 4將全部擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過(guò)8% 7M尿素膠回收，凝膠洗脫緩沖液洗脫后再乙醇沉淀回收，核酸定量?jī)x確定ssDNA的量，用于下一輪的篩選。6.重復(fù)η輪篩選(步驟3-5)7.放射性同位素檢測(cè)文庫(kù)的富集情況7. 1利用Τ4多核苷酸激酶的末端轉(zhuǎn)移反應(yīng)將富集文庫(kù)標(biāo)記放射性同位素，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。7. 2將標(biāo)記好的ssDNA文庫(kù)置于沸水中煮2_;3min，然后冰水浴IOmin備用；7. 3文庫(kù)與篩選靶標(biāo)及消減靶標(biāo)共同孵育，同前進(jìn)行凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，將膠進(jìn)行磷屏顯影。7. 4富集程度最好的文庫(kù)與不同濃度的純化蛋白進(jìn)行EMSA結(jié)合實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)建立的基于EMSA分離的消減SELEX篩選，獲得了特異識(shí)別融合蛋白中CAT結(jié)構(gòu)域的富集文庫(kù)。因此，該方法能夠從兩組液相標(biāo)本中篩選針對(duì)差異成分的寡核苷酸適配子。利用富集的文庫(kù)還可以對(duì)差異成分進(jìn)行釣取鑒定。由圖2可以得到結(jié)論篩選靶標(biāo)與消減靶標(biāo)的差異成分在于前者為重組的融合蛋白，后者為標(biāo)簽蛋白，兩者其余的菌體蛋白成分大致相同。由圖3可以得到結(jié)論經(jīng)過(guò)篩選后，第5輪文庫(kù)、第10輪文庫(kù)均有富集，第10輪文庫(kù)富集程度最高。且第10輪富集文庫(kù)與不同濃度的融合蛋白呈現(xiàn)劑量相關(guān)的結(jié)合，與標(biāo)簽蛋白無(wú)結(jié)合，說(shuō)明富集文庫(kù)僅結(jié)合篩選靶標(biāo)中差異的CAT結(jié)構(gòu)域。
權(quán)利要求
1.一種針對(duì)液相非純化復(fù)合靶標(biāo)的電泳凝膠阻滯-SELEX技術(shù)方法，其特征是利用電泳凝膠阻滯與SELEX技術(shù)結(jié)合的原理，針對(duì)液相未純化差異靶標(biāo)進(jìn)行消減篩選，獲得特異識(shí)別差異靶標(biāo)的特異寡核苷酸適配子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述方法，篩選的靶標(biāo)可以是大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)后超聲上清。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述方法，篩選的靶標(biāo)可以是細(xì)胞培養(yǎng)上清或提取的細(xì)胞組份。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述方法，篩選的靶標(biāo)可以是血清樣品、體液樣品、組織提取成分寸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中所述方法，SELEX篩選采用的可以是單鏈DNA文庫(kù)，也可以是RNA 文庫(kù)或修飾后的DNA或RNA文庫(kù)。
6.權(quán)利要求1中所述方法在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用，包括靶標(biāo)分子的釣取、檢測(cè)、純化和功能抑制劑的篩選。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種針對(duì)液相非純化復(fù)合靶標(biāo)的電泳凝膠阻滯-SELEX技術(shù)方法的建立和應(yīng)用。具體是將非純化的靶標(biāo)與單鏈寡核苷酸文庫(kù)在液相中孵育，利用電泳凝膠阻滯的原理，通過(guò)消減篩選，獲得針對(duì)篩選樣品與消減樣品中差異成分的特異寡核苷酸適配子，用作靶標(biāo)的檢測(cè)與功能抑制等。獲得的寡核苷酸適配子還可用于鑒定和發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的分子標(biāo)志物。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102382813SQ20101026626
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2010年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月30日
發(fā)明者丁紅梅, 劉農(nóng)樂(lè), 夏偉, 李少華, 李慧, 李潔, 王芳, 趙強(qiáng), 邵寧生 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所