專利名稱：一種pool fq-pcr聯(lián)合檢測腫瘤耐藥基因的方法及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于核酸診斷領域，涉及腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)基 因MDR、MRP1、MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTs的基因檢測的方法，特別是涉及使用一種Pool FQ-PCR(小池-熒光PCR)的方法對腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)基因進行 檢測，該方法進一步涉及一種檢測試劑盒，用于檢測腫瘤患者組織、血樣等樣本中多藥耐藥 基因mRNA，用于對化療藥物產(chǎn)生耐藥的輔助診斷及其病人藥物治療的療效監(jiān)控。
背景技術：
腫瘤細胞多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)是造成化療失敗的重要原因， 耐藥的機制雖有很多，但總結起來不外乎是腫瘤細胞內(nèi)各種耐藥相關轉運蛋白和酶類量的 改變。而這種量的改變是由編碼這些轉運蛋白和酶類的耐藥相關基因過度表達或表達下調(diào) 造成的。腫瘤細胞在受到一定的抗腫瘤藥作用后，甚至在抗腫瘤藥物作用之前產(chǎn)生了針對 這種藥物及相關藥物，甚至無關藥物的抗性，稱為多藥耐藥性。狹義的多藥耐藥性是指由 于MDRl基因表達的P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)及其MDR相關蛋白(MDR-related protein, MRP)的表達而產(chǎn)生的抗藥性。而廣義的多藥耐藥則是指由于MDR、MRP、LRP、TAP、 BRCP基因表達以及谷胱甘肽S-轉移酶(GST)基因、拓撲異構酶(Τ0Ρ0)基因、熱休克蛋白 (HSP)基因、蛋白激酶 C(PKC)基因、癌基因(c-Ha-ras、bcl-2、bcr-abl、erbB-2、fos、jun、 MDM-2等)、細胞因子(IL-6、TGFi3、IGF-2等)、抗氧化相關基因、DNA修復基因以及各種化 療藥物代謝相關基因的表達引起的對于抗腫瘤化療藥物的抗性。1.MDR 基因MDR基因是研究最早的耐藥相關基因，人類基因組有兩種已知的MDR基因MDR1和 MDR3。兩者均定位于染色體7q21. 1，且編碼的蛋白質(zhì)有80%同源。MDRl基因編碼轉運蛋 白并呈現(xiàn)多藥耐藥表型。MDR轉運蛋白中研究最深入的是P-gp，它是由MDRl基因編碼的分子量為170kDa 的跨膜性糖蛋白。P-gp分子可以分為氨基酸順序幾乎相等的兩部分，12個疏水性氨基酸在 膜內(nèi)排列成6對，使P-gp嵌于膜內(nèi)，在膜外側的部分連接糖基，在膜內(nèi)側親水區(qū)有兩個核苷 酸結合位點，屬于轉運蛋白超家族，即ABC (ATP binding cassette family)家族。P_gp的 跨膜結構具有通道蛋白的特性，具有能量依賴性藥泵的功能。P-gp與抗腫瘤藥物結合，同時 在其核苷酸結合位點上結合ATP，ATP水解后所釋放的能量使藥物轉出細胞外，結果使藥物 濃度下降，其細胞毒作用因而減弱或完全喪失，細胞由此產(chǎn)生耐藥性，此為經(jīng)典的多藥耐藥 途徑。惡性腫瘤細胞P-gp表達上調(diào)的機制還不十分清楚，MDRl基因表達水平的提高主 要是轉錄水平表達的升高。對蛋白激酶C具有激活作用的因子可以誘導MDRl基因的表達。 對于MDRl基因啟動子基因區(qū)的序列和結構進行分析，發(fā)現(xiàn)有一段高度保守的DNA序列可與熱休克蛋白結合稱之為熱休克元件(HSE，heat shock element)，提示MDRl基因的表達水 平可能會受到熱休克蛋白的調(diào)節(jié)。還有研究顯示細胞因子、腫瘤抑制基因P53及其突變體 對MDRl基因的表達也具有一定的調(diào)節(jié)作用，而且還具有細胞種類的特異性。2. MRP 基因自從第一個MRP基因，即MRPl被分離以來，其余幾種同源基因也相繼被發(fā)現(xiàn)， 包括 MRP2 (cMOAT)、MRP3、MRP4、MRP5、MRP6、MRP7、MRP8、MRP9 禾口 MRP10。MRP 位于染色體 16pl3. 12-pl3，編碼一種具有1522個氨基酸的蛋白質(zhì)，此蛋白質(zhì)被稱為多藥耐藥相關蛋 白。其分子量為190kDa，故又被稱為P-190。與P_gp相似，MRP上有ATP結合位點，兩者同 屬于ATP依賴性跨膜轉運蛋白類，即ABC超家族的成員。不過P-gp與MRP又有許多不同 之處P_gp主要分布于胞膜，而MRP則分布于胞膜和質(zhì)膜；P-gp是將胞內(nèi)藥物排出胞外，降 低細胞內(nèi)藥物濃度，而MRP除部分將藥物排出胞外之外，還使胞內(nèi)藥物重新分布，從而呈現(xiàn) MDR表型。MRP主要作為一種谷胱甘肽偶聯(lián)物轉運蛋白，降低細胞內(nèi)GSH濃度會影響MRP介導 的藥物轉運。除了化療藥物外，MRP還可轉運半胱氨酰白三烯(尤其是LTC4)、谷胱甘肽和 葡萄糖醛酸偶聯(lián)物(包括類固醇、前列腺素A2、膽鹽衍生物和黃曲霉毒素Bi)。但GSH并不 是必需與藥物偶聯(lián)轉運才能進行，而可能是與藥物一起聯(lián)合轉運的，Mariska等認為多肽才 是MRP跨膜轉運的底物。最近Gupta等發(fā)現(xiàn)MRP可能參與轉運像成纖維細胞生長因子這樣 分子量達16，000大小的蛋白質(zhì)。3. LRP 基因該基因定位于染色體16p，全長^88bp，編碼896個氨基酸的蛋白質(zhì)，相對分子量 IlOkDa,此蛋白質(zhì)被命名為肺耐藥相關蛋白(Lung resistance-relatedprotein)。LRP不 是一種ABC轉運蛋白，沒有跨膜結構域和ATP結合位點。LRP與鼠編碼的主要穹隆體蛋白 (major vault protein，MVP)，有81 %的同源性，推測LRP可能是人類的MVP。穹隆體為一 細胞器，可能參與胞質(zhì)中囊泡的運輸及核質(zhì)物質(zhì)的運輸。LRP可能通過兩種機制引起MDR: 一方面使那些以細胞核為靶點的藥物不能進入胞核；另一方面使胞質(zhì)中的藥物進入運輸囊 泡，通過胞吐機制排出胞外。直接轉導LRPcDNA并不傳導耐藥表型，這說明LRP可能與其他 分子聯(lián)合起作用，單獨并不能產(chǎn)生多藥耐藥現(xiàn)象。4. BCRP 基因乳腺癌耐藥蛋白(breastcancer resistance protein，BCRP)是最近剛發(fā)現(xiàn)的一 種ABC不完全性轉運蛋白。由BRCP基因編碼，位于染色體4q22_q23，BRCP分子量為72kDa。 BRCP基因產(chǎn)生兩種轉錄產(chǎn)物，它們在5’端稍有區(qū)別，并編碼一種655個氨基酸的蛋白質(zhì)。ABC轉運蛋白可分成完全性和不完全性轉運蛋白兩類，前者包括兩組由一個親脂 性跨膜結構和一個ATP結合結構組成的區(qū)域，而后者只有一組。不完全性轉運蛋白必需形 成二聚體或多聚體才能具有轉運功能。通常完全性轉運蛋白位于胞膜上，而不完全性轉運 蛋白位于質(zhì)膜上，如線粒體上的M-ABCl和ABC7、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的TAPl和TAP2以及過氧化小體 上的ALD亞家族成員等。BCRP是目前發(fā)現(xiàn)的第一種主要位于胞膜上的ABC不完全性轉運蛋 白。Rocchi等用Wfestern blot和免疫化學染色法證實BCRP/MXR在許多耐藥細胞株上表 達，而且被定位于血漿側生物膜，而不同于其他不完全性轉運蛋白。Ross等用RT-PCR法檢 測了 20例AML，1例ALL患者腫瘤細胞BCRP mRNA的表達，結果差異很大，近一半樣本表達量高出對照1000倍，另一半則BCRP mRNA低表達或幾乎測不出陽性結果。BCRP高表達和 P-gp高表達并無緊密相關性，提示對P-gp陰性患者BCRP可能引起對某些抗白血病藥耐藥。 AML患者BCRP mRNA高表達發(fā)生率很高，這就為深入的研究來證明疾病亞型、預后與BCRP表 達及功能的關系提供了保證?，F(xiàn)今BCRP的所有研究主要集中在BCRP mRNA水平，由于沒有多抗和單抗血漿來 有效檢測BCRP，故蛋白水平的檢測仍未建立。腫瘤細胞BCRP表達和定位情況知之甚少。 Scheffer等用BCRP專門的單抗BXP-34檢測了一組人類腫瘤細胞，結果顯示除一例小腸腫 瘤BCRP輕微陽性表達外，一組人類原發(fā)腫瘤的冷凍標本BCRP都為陰性。甚至在原發(fā)耐藥 相對高水平的腎腺癌BCRP也未檢出。而且在以用藥物治療的乳腺癌或AML，也不能檢測到 BCRP。盡管以上資料可能提示在耐藥病例BCRP臨床發(fā)生率有限，但化療后乳腺癌腫塊則有 顯著縮小。還有在AML患者病情復發(fā)獨立于使用過藥物的類型等原因，因此，腫瘤細胞檢測 的結果不能反映真實耐藥情況。當前尚需開發(fā)其他BCRP特異的單抗，采用合適的檢測手 段，進行大規(guī)模腫瘤樣本的篩選，這些研究將對BCRP陽性的腫瘤組織耐藥機制的探討提供 線索。Rabindran等在逆轉BCRP介導耐藥方面的研究資料表明，F(xiàn)TC(Fumitremorgin C) 在P-gp或MRP無表達的耐藥細胞株中，有潛在逆轉耐藥的作用。因為藥物篩選的細胞株可 能包含MDR的多種耐藥機制，檢測FTC在BCRP基因轉染的細胞株MCF-7中的逆轉作用，結 果顯示FTC在體外幾乎完全逆轉BCRP介導的耐藥。FTC的進一步研究保證了其在BCRP功 能分析中的作用，并且可能成為臨床調(diào)節(jié)化療的修飾劑。

發(fā)明內(nèi)容
熒光定量PCR技術其原理是在常規(guī)PCR擴增系統(tǒng)中加入一段與靶基因特異互補的 熒光標記探針。探針的5'端標記有報告基團，如FAM、VIC等，3'端標記有熒光淬滅基團， 如TAMRA等。當探針完整的時候，報告基團所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不 到熒光信號。隨著PCR擴增的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針就會將探 針切斷產(chǎn)生熒光信號。用熒光檢測儀檢測熒光值的變化，即可準確判定擴增產(chǎn)物的量。熒 光定量PCR方法就是根據(jù)此原理。在PCR過程中，連續(xù)不斷地檢測反應體系中熒光信號的 變化。當信號增強到某一閾值，此時的循環(huán)次數(shù)(用循環(huán)閾值Ct表示)就被記錄下來。Ct 值和PCR體系中起始模板的對數(shù)之間有著嚴格的線性關系，利用各梯度陽性定量標準品擴 增的Ct和定量模板數(shù)經(jīng)對數(shù)擬合作圖制成標準曲線，再根據(jù)待測樣品的Ct值就可以準確 定出起始模板核酸的數(shù)量。基于熒光定量PCR技術原理，為了克服現(xiàn)有檢測技術中的缺陷和不足，本發(fā)明 提供了一種使用小池熒光PCR(Poc)I FQ-PCR)技術快速準確檢測腫瘤多藥耐藥基因MDR、 MRP1、MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTS的方法及其試劑盒。該方法的主要原理和過程是首先 針對腫瘤多藥耐藥基因MDR、MRP1、MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTs的序列設計特異性引物和 熒光探針，采用熒光定量PCR方法，在擴增儀上多管(Pool，小池)同時進行。主要過程包 括(1)采集和運送樣品；( 樣本預處理和提取RNA ； (3) Pool FQ-PCR體外擴增法對樣本 進行檢測合成特定引物和熒光探針，用Pool FQ-PCR技術并用擴增反應液(PCRMIX)對樣 本進行檢測；(4)擴增反應結束后根據(jù)每個擴增反應的熒光強度對相應樣本進行分析，從而判斷所采集的樣本中腫瘤多藥耐藥基因的存在。 首先，對腫瘤多藥耐藥基因序列進行分析，從Genbank下載所有腫瘤多藥耐藥基 因(MDR、MRPU MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTs等)，經(jīng)過生物信息學分析反復比對，設計特 異性引物和探針序列，詳細如下
NO. 6)； NO. 9)； NO. 12) NO. 18)
MDR 上游引物5，-CTGGACAAGCACTGAAAGATAAGA-3，(SEQ IDN0. 1)； MDR 下游引物5，-CAACGGTTCGGAAGTTTTCT-3，(SEQ ID NO. 2)； MDR 熒光探針5，-FAM-TCTGGGAAGATCGCTACTGAAGCA-TAMRA-3，(SEQ ID N0. 2)； -CGTTAGAGCCCAAAGTGGAATC-3，(SEQ ID N0. 4)； -AGTCGGCGGCGTAATTCTTA-3’ (SEQ ID N0. 5)； 針5’ -FAM-TGAGGCTGCCCCAAGACTCAGACTTG-TAMRA-3’ (SEQ ID
MRPl上游引物5' MRPl下游引物5' MRPl熒光探
MRP2上游引物5' MRP2下游引物5' MRP2熒光探
MRP4上游引物5' MRP4下游引物5' MRP4熒光探
-CATCAAAGAAAGTGGAACAGGA-3，(SEQ ID N0. 7)； -TGCGTCTGGAACGAAGACTC-3，(SEQ ID N0. 8)； 針5， -FAM-CTGTTCCACTTTCTTTGATGAAACAA-TAMRA-3， (SEQ ID
-GGTGGCTCAATCCCTTGTTT-3 ‘ (SEQ ID N0. 10)； -AAGGTGCTGTGAGCGGTCTT-3 ‘ (SEQ ID N0. 11)； 針5’ -FAM-CCATAAACGGAGATTAGAGGAAGATG-TAMRA-3’ (SEQ ID
LRP 上游引物:5，-GGAGTCACCATGGCAACTGA-3，(SEQ ID N0. 13)；
LRP 下游引物:5，-TTCTGGTCCAGCACATGGATAT-3，(SEQ ID N0. 14)；
LRP 熒光探針5，-FAM-AGTTCATCATCCGCATCCCCCCATA-TAMRA-3，(SEQ ID NO. 15)；
BCRP 上游引物:5，-CCTCCACCTGTTAGTCCCATTT-3，(SEQ ID N0. 16)；
BCRP 下游引物5，-TGGTGCCACAACTCCTTGGT-3，(SEQ ID N0. 17)；
BCRP 熒光探針5，-FAM-TCTCCGGCTGCACAGAAGGCATTTC-TAMRA-3，(SEQ ID
GSTs 上游引物:5，-GCTCCACTACTTCAATGCACG-3，(SEQ ID N0. 19)；
GSTs 下游引物5，-CTTGTCCAAATCTTCTGCAGAT-3，(SEQ ID N0. 20)；
GSiTs 熒光探針5，-FAM-AGAATGGAGTCCACCCGGTGGCTC-TAMRA-3，(SEQ ID NO. 21)；同時弓I入人 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH),基因為內(nèi)標， 特異性引物和熒光探針如下GAPDH 上游引物5，-CAGGTGGTCTCCTCTGACTTCA-3，(SEQ IDN0. 22)；GAPDH 下游引物5，-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3，(SEQ ID N0. 13)；GAPDH 熒光探針5，-FAM-ACACCCACTCCTCCACCTTTGACGCTAMRA-3，(SEQ ID N0. 24)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，上述各引物合成后需經(jīng)過HPLC(高效液相色 譜)的方法純化，各熒光探針均為在5’標記有Fam熒光素，作為報告基團，3’標記有Tamra， 作為淬滅基團。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，為了完成本發(fā)明的檢測方法首先采集標 本，適用標本類型包括腫瘤新鮮組織或新鮮血樣(EDTA2-Na抗凝)等。標本應立即用于測 試，也可保存于_80°C或液氮待測，標本運送時應采用0°C冰壺。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，為了完成本發(fā)明的檢測方法對上述各種標本提 取RNA 取固體組織50mg左右用玻璃勻漿器勻漿或剪刀剪碎，加入500 μ IRNA提取液，研磨 或振蕩至勻漿狀，轉移到1. 5ml的EP管中；或者全血應用紅細胞裂解液(或淋巴細胞分離 液)分離淋巴細胞，沉淀加入500 μ 1 Trizol reagents，反復吹打。然后加入氯仿、異丙醇、 75% DEPC乙醇處理，最終用20 μ 1 DEPC Η20溶解沉淀，即為本實驗需要的RNA。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，為了完成本發(fā)明的檢測方法，首先要合成cDNA， 取上述提取的RNA2 μ 1，加1 μ 1逆轉錄酶系，7 μ 1逆轉錄緩沖液，充分混勻后短暫離心， 420C 30分鐘，后95°C 5min滅活逆轉錄酶。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，為了完成本發(fā)明的檢測方法，擴增體系按照如 下方式配制，各上游引物(IOuM)=Iul各下游引物(IOuM)=Iul各熒光探針(IOuM)0. 5ulPCR 反應液17. 5ul_Total20. 0μ 1根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，上述PCR反應液包含F(xiàn)Q buffer (由 5 XFQbuffer經(jīng)雙蒸水稀釋為IX作為工作濃度)、四種核苷酸單體(dNTPs)等成分。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，上述用IXFQ buffer工作液各主要成分和濃度 如下50mM Tris-HCl (pH8.0)、5mM MgC12、50mM KC1、0. 01 %的明膠等。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所檢測的腫瘤多藥耐藥基因包括MDR、MRP、LRP 和BCRP等，也就是說，對于某標本進行腫瘤多藥耐藥基因檢測，需要對該標本同時進行 MDR、MRPl、MRP2、MRP4、LRP、BCRP 禾口 GSTs 等幾個檢測反應。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，用于腫瘤多藥耐藥基因MDR、MRP1、MRP2、MRP4、 LRP、BCRP和GSTs檢測的幾個反應管(Pool)作為一個整體同步進行，各自檢測不同的基因， 所以稱為“小池熒光PCR(Poc)I FQ-PCR) ”，實現(xiàn)了快速準確檢測的目的。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的小池熒光PCR(P001 FQ-PCR)檢測方法 引入了一種陽性質(zhì)控品，作為實驗的陽性對照和實驗控制，該組陽性質(zhì)控品是由MDR、MRP1、 MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTs等幾個基因擴增的特異性片段經(jīng)克隆構建的重組質(zhì)粒組成， 其中各自濃度均為107COpieS/ml，而陰性質(zhì)控品是一種經(jīng)過高壓滅菌的TE緩沖液。所以， 本發(fā)明的方法不但可以進行檢測，還可一對mRNA進行定量。陽性質(zhì)控品擴增曲線，如圖1。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的小池熒光PCR(P001 FQ-PCR)檢測 方法，各小池(反應管)的反應體系設置為25ul，具體配制方法是上述檢測擴增體系 (PCR-MIX) 20ul、Taq耐熱DNA聚合酶系2ul以及合成的cDNA或者陽性質(zhì)控品或者陰性質(zhì) 控品分別為Ml。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的試劑盒在ABI PRISM 7700、 ABIPRISM5700.ABI GeneAmp7000、ABIPRISM7300/7500、MJ Opticon 等熒光定量擴增儀的擴 增條件為93°C— 2分鐘，然后93°C 30秒一55°C 45秒，采集熒光，40個循環(huán)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，反應結束后，使用手動調(diào)整閾值使陰性質(zhì)控品Ct值在40以上，Ct值小于35個循環(huán)的為陽性；Ct值在35-40個循環(huán)之間，為灰區(qū)，需要進 行重復試驗。重復試驗之后，如果Ct值仍然在35-40個循環(huán)之間，判斷為陽性，沒有熒光值 增長為陰性。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，用TE buffer稀釋陽性質(zhì)控品(107COpieS/ml)， 濃度梯度為每 ml 1· 0Χ106、1· 0Χ105、1· 0Χ104、1· 0Χ103、1· 0Χ102、1· OxiOlCopies,進行 靈敏度實驗，結果證實本試劑盒檢測靈敏度為ι. ο X 102copies/ml，比RT-PCR方法更為敏 感和精確，如圖2和3。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，用經(jīng)測序驗證的陽性標本進行特異性實驗，結 果證實，本試劑盒特異性較好，吻合度為100%。本發(fā)明的試劑盒經(jīng)過多次不同的重復實驗驗證證實，具有良好的重復性好和穩(wěn)定 好的性能。在-20°C條件下試劑盒可有效期可以達12個月。
四

圖1顯示MDR、MRP1、MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTs等擴增曲線較好，呈標準的 S型擴增曲線。圖2為用TE buffer稀釋陽性質(zhì)控品(107COpies/ml)，濃度梯度依次為 1. 0 XlOVml >1. 0 X105/ml >1. 0 XioVml >1. OX 103/ml >1. 0 X102/ml >1. 0 XlOVml,進行靈 敏度實驗，結果證實本小池熒光PCR(PoolFQ-PCR)檢測試劑盒靈敏度為1. 0 X IO2Copies/ ml,比RT-PCR方法更為敏感和精確，如圖3，1 6為梯度稀釋的質(zhì)控標準品PCR反應產(chǎn)物， 2%瓊脂瓊脂糖凝膠，樣品濃度分別為 1. OX 107/ml、1. OX 106/ml、1. 0XlO5Ail、1. OXlO4/ ml、1. 0X 103/mlU. OX 102/ml)。
五具體實施例方式實施例1 腫瘤多藥耐藥基因檢測標本的采集適用標本類型包括腫瘤新鮮組織或新鮮血樣(EDTA2_Na抗凝)等標本。標本采集 腫瘤新鮮組織，取活檢或手術病人腫瘤組織約50-100mg (約黃豆大小)，放于1. 5mlDEPC水 處理的滅菌離心管中，密閉送檢。新鮮血液，無菌注射器抽取受檢者靜脈血3-5毫升，注入 EDTA2Na抗凝管中，充分混勻送檢。實施例2 腫瘤多藥耐藥基因mRNA的提取固體組織，取50mg左右組織用玻璃勻漿器勻漿或剪刀剪碎，加入0. 5mLTrizol reagents，研磨或振蕩，轉移到1. 5mL的EP管中，室溫放置5min。全血，應用紅細胞裂解液 (或淋巴細胞分離液)分離淋巴細胞，沉淀加入500 μ 1 Trizolreagents，反復吹打，室溫放 8 5πι η0加入IOOul氯仿，用力震蕩15s，室溫靜置5min，4°C 13，OOOrpm離心5min。小心將 上層水相轉移到干凈離心管中，加等體積異丙醇，充分混勻，13，OOOrpm離心5min。棄上清， 加入500 μ 1 75%的DEPC乙醇，充分混勻，13，OOOrpm離心5min，小心吸去大部分乙醇。將 提取管敞口在室溫空氣中干燥lOmin，用20 μ 1 DEPC Η20溶解沉淀。陰性質(zhì)控品，取100 μ 1 加入500ul Trizol reagents充分震蕩，余按上述操作。實施例3 腫瘤多藥耐藥基因cDNA的合成取2 μ 1上述提取的RNA，加1 μ 1逆轉錄酶系，7 μ 1逆轉錄緩沖液，充分混勻后短 暫離心，42°C 30分鐘，后95°C 5min滅活逆轉錄酶。即得到cDNA。
實施例4 小池熒光PCR(Pool FQ-PCR)方法對多藥耐藥基因進行檢測從試劑盒中取出PCR MIX、Taq酶系，室溫融化并振蕩混勻后，10, OOOrpm離心IOs 進行PCR擴增，各小池(Pool)對應的檢測體系為
權利要求
1.一種Pool FQ-PCR聯(lián)合檢測腫瘤多藥耐藥基因MDR、MRPl、MRP2、MRP4、LRP、BCRP和 GSTs的方法及其試劑盒，試劑盒采用的特異性引物和探針序列如下MDR 上游引物5，-CTGGACAAGCACTGAAAGATAAGA-3，(SEQ ID NO. 1)； MDR 下游引物5，-CAACGGTTCGGAAGTTTTCT-3，(SEQ ID NO. 2)； MDR 熒光探針5，-FAM-TCTGGGAAGATCGCTACTGAAGCA-TAMRA-3，(SEQ ID NO. 2)； MRPl 上游引物:5，-CGTTAGAGCCCAAAGTGGAATC-3，(SEQ ID NO. 4)； MRPl 下游引物:5，-AGTCGGCGGCGTAATTCTTA-3，(SEQ ID NO. 5)； MRPl 熒光探針5，-FAM-TGAGGCTGCCCCAAGACTCAGACTTG-TAMRA-3，(SEQ ID NO. 6)； MRP2 上游引物5，-CATCAAAGAAAGTGGAACAGGA-3，(SEQ ID NO. 7)； MRP2 下游引物5，-TGCGTCTGGAACGAAGACTC-3，(SEQ ID NO. 8)； MRP2 熒光控針5，-FAM-CTGTTCCACTTTCTTTGATGAAACAA-TAMRA-3，(SEQ ID NO. 9)； MRP4 上游引物:5，-GGTGGCTCAATCCCTTGTTT-3，(SEQ ID NO. 10)； MRP4 下游引物:5，-AAGGTGCTGTGAGCGGTCTT-3，(SEQ ID NO. 11)； MRP4 熒光探針5，-FAM-CCATAAACGGAGATTAGAGGAAGATG-TAMRA-3，(SEQ ID NO. 12)； LRP 上游引物:5，-GGAGTCACCATGGCAACTGA-3，(SEQ ID NO. 13)； LRP 下游引物:5，-TTCTGGTCCAGCACATGGATAT-3，(SEQ ID NO. 14)； LRP 熒光探針5，-FAM-AGTTCATCATCCGCATCCCCCCATA-TAMRA-3，(SEQ ID NO. 15)； BCRP 上游引物:5，-CCTCCACCTGTTAGTCCCATTT-3，(SEQ ID NO. 16)； BCRP 下游引物:5，-TGGTGCCACAACTCCTTGGT-3，(SEQ ID NO. 17)； BCRP 熒光探針5，-FAM-TCTCCGGCTGCACAGAAGGCATTTC-TAMRA-3，(SEQ ID NO. 18)； GSTs 上游引物:5，-GCTCCACTACTTCAATGCACG-3，(SEQ ID NO. 19)； GSTs 下游引物5，-CTTGTCCAAATCTTCTGCAGAT-3，(SEQ ID NO. 20)； GSTs 熒光探針5，-FAM-AGAATGGAGTCCACCCGGTGGCTC-TAMRA-3，(SEQ ID NO. 21)； 同時弓I入人 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH),基因為內(nèi)標,特異 性引物和熒光探針如下GAPDH 上游引物5，-CAGGTGGTCTCCTCTGACTTCA-3，(SEQ ID NO. 22)； GAPDH 下游引物5，-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3，(SEQ ID NO. 13)； GAPDH 熒光探針5，-FAM-ACACCCACTCCTCCACCTTTGACGC TAMRA-3，(SEQ ID NO. 24)。 上述各引物合成后需經(jīng)過HPLC的方法純化，各熒光探針均在5’標記有Fam熒光素，作 為報告基團，3’標記有Tamra，作為淬滅基團。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種PoolFQ-PCR(小池-熒光PCR)聯(lián)合檢測腫瘤多藥耐 藥基因MDR、MRP1、MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTs的方法及其試劑盒，用于檢測的多個反應 管(小池，Pool)，作為一個整體同步進行，各自檢測不同的耐藥基因，所以稱為“小池熒光 PCR(Pool FQ-PCR) ”，實現(xiàn)了快速準確檢測的目的。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種分型檢測試劑盒，根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，為 了完成本發(fā)明的檢測方法，首先要合成cDNA，取上述提取的RNA2y 1，加1 μ 1逆轉錄酶系， 7μ 1逆轉錄緩沖液，充分混勻后短暫離心，42°C 30分鐘，后95°C 5min滅活逆轉錄酶。然后 每個小池分型檢測所用的擴增體系按照如下方式配制上游引物(IOuM) =Iul下游引物(IOuM) =Iul 熒光探針(IOuM) 0. 5ul PCR 反應液 17. 5μ1Total20. 0μ 1PCR反應液(PCR MIX)包含F(xiàn)Q buffer (由5XFQ buffer經(jīng)雙蒸水稀釋為IX作為工 作液)、四種核苷酸單體(dNTPs)等成分。其中IXFQ buffer工作液各主要成分和濃度為 50mM Tris-HCl (pH8.0)、5mM MgC12、50mM KC1、0. 01 %的明膠等。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種Pool FQ-PCR聯(lián)合檢測腫瘤多藥耐藥基因MDR、MRP1、MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTs的方法及其試劑盒，為臨床檢測腫瘤多藥耐藥基因提供了新的方法，該檢測過程包括(1)采集待檢測樣品；(2)樣品預處理和提取腫瘤多藥耐藥基因的mRNA并合成cDNA；(3)Pool FQ-PCR體外擴增法對樣本進行檢測合成特定分型引物和熒光探針，用Pool FQ-PCR技術并用擴增反應液(PCR MIX)對樣本進行檢測；(4)擴增反應結束后根據(jù)每個擴增反應的熒光強度對相應樣本進行分析，從而判斷所采集的樣品中腫瘤耐藥基因MDR、MRP1、MRP2、MRP4、LRP、BCRP和GSTs的存在。
文檔編號C12Q1/68GK102121048SQ201010000468
公開日2011年7月13日 申請日期2010年1月11日 優(yōu)先權日2010年1月11日
發(fā)明者任美峰, 史成軍, 張建業(yè), 徐貴峰, 符立梧, 那寧 申請人:中山大學附屬腫瘤醫(yī)院, 北京索奧生物醫(yī)藥科技有限公司, 廣州醫(yī)學院