專利名稱：抗cdh3抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗CDH3抗體，使用所述抗體來治療或預(yù)防或診斷CDH3相關(guān)疾病的方法，以及包含所述抗體的藥物組合物或診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
鈣粘蛋白是細(xì)胞-細(xì)胞粘附糖蛋白，它們形成鈣依賴性細(xì)胞間連接點(diǎn)，而且在系統(tǒng)發(fā)生中及在成年組織和器官的發(fā)育和維持中發(fā)揮至關(guān)重要的作用(NPL1)。在胚胎發(fā)生期間，特定鈣粘蛋白的細(xì)胞表達(dá)導(dǎo)致嗜同性相互作用，這些相互作用在細(xì)胞分選和組織分層的過程中是至關(guān)重要的(NPL2-4)。這些細(xì)胞附著的改變?cè)诩?xì)胞失穩(wěn)中發(fā)揮重要作用，而且可改變受到細(xì)致調(diào)節(jié)的上皮結(jié)構(gòu)分化過程(NPL5-6)。因?yàn)檫@個(gè)原因，已經(jīng)有人暗示鈣粘蛋白的功能喪失或過表達(dá)以及編碼這些蛋白的基因的背后的控制分子機(jī)制與癌發(fā)生有關(guān) (NPL7)。鈣粘蛋白家族細(xì)分成多個(gè)亞家族，包括經(jīng)典的E-、P_、和N-鈣粘蛋白，每個(gè)亞家族表現(xiàn)出獨(dú)特的組織分布(NPL 8)。雖然E-鈣粘蛋白在所有上皮組織中表達(dá)，但是P-鈣粘蛋白(CDH3)的表達(dá)僅僅局限于分層的上皮的基底層或下層，包括前列腺和皮膚，而且還局限于乳腺肌上皮細(xì)胞(NPL 9-10)?，F(xiàn)在有大量的證據(jù)也揭示異常P-鈣粘蛋白表達(dá)與細(xì)胞增殖及與結(jié)腸、乳腺、肺、甲狀腺、和宮頸的腫瘤有關(guān)(NPL11-12)。人P-鈣粘蛋白據(jù)報(bào)告是被針對(duì)外陰表皮樣癌生成的NCC-CAD-299單克隆抗體識(shí)別的抗原(NPLlO)。預(yù)期對(duì)P-鈣粘蛋白介導(dǎo)的粘附和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)腫瘤細(xì)胞增殖和存活降低。因而，鑒于P-鈣粘蛋白似乎在細(xì)胞增殖和實(shí)體瘤進(jìn)展中擁有關(guān)鍵作用，期望生成針對(duì)P-鈣粘蛋白的抗體，它能給具有多種癌癥的患者提供治療效益。針對(duì)癌癥特異性分子的單克隆抗體已經(jīng)證明在癌癥治療中是有用的(NPL13)。除了用于乳腺癌、惡性淋巴瘤和結(jié)腸癌的人源化或嵌合抗體諸如曲妥單抗(NPL13)、利妥昔單抗(NPL14)和貝伐單抗(NPL15)等臨床應(yīng)用的成功例子之外，有若干針對(duì)其它分子靶標(biāo)的單克隆抗體正處于開發(fā)中，而且人們正在評(píng)估它們的抗腫瘤活性。預(yù)期這些單克隆抗體會(huì)給具有沒有有效療法的腫瘤的患者帶來希望。關(guān)于這些單克隆抗體的其它重要問題之一，是實(shí)現(xiàn)針對(duì)癌細(xì)胞的選擇性治療效果，而避免由于它們對(duì)表達(dá)靶分子的細(xì)胞的特異性反應(yīng)而造成的嚴(yán)重毒性(NPL17-19，PTL1-4)。引用列表專利文獻(xiàn)PTL I W02002/097395PTL 2 W02004/110345PTL 3 W02006/114704PTL 4 W02007/102525非專利文獻(xiàn)
NPL I Conacci-Sorrell M, et al. , J Clin Invest, 109:987-91, (2002NPL 2 Nose A, et al.，Cell, 54:993-1001，(1988)NPL 3 =Steinberg MS, et al. ,. Proc Natl Acad Sci USA, 91:206-9，(1994)NPL 4 =Takeichi M. Science, 251:1451-5，(1991)NPL 5 =Daniel Cff,et al. , Dev Biol, 169:511-9，(1995)NPL 6 Nose A and Takeichi M.J Cell Biol, 103:2649-58，(1986)NPL 7 Behrens J. Cancer Metastasis Rev, 18:15-30(1999) NPL 8 Takeichi M. Development, 102:639-55 (1988)NPL 9 =Takeichi M. J Cell Biol 103:2649-58，(1986)NPL 10 Shimoyama Y，et al. , Cancer Res, 49:2128-33(1989)NPL 11 :GamalIo, Modern Pathology, 14:650-654, (2001)NPL 12 Stefansson, et al.，J. Clin. Oncol. 22(7):1242-1252(2004)NPL 13 Harris, M. Lancet Oncol, 5:292-302 (2004)NPL 14 Baselga, J. Oncology, 61:SuuplSuupl 214-21(2004)NPL 15 Maloney, D. G. , et al. Blood, 90:2188-2195 (1997)NPL 16 Ferrara, N. , et al. Nat Rev Drug Discov, 3:391-400(2004)NPL 17 Crist,ff. M. , et al. J Clin Oncol, 19:3091-3102(2001)NPL 18 ffunder, J. S. , et al. J Bone Joint Surg Am, 80:1020-1033 (1998)NPL 19 Ferguson, ff. S. and Goorin, A. M. Cancer Invest, 19:292-315(2001)發(fā)明概述本發(fā)明提供針對(duì)⑶H3的單克隆抗體，它們特異性識(shí)別⑶H3多肽，諸如具有SEQ IDNO 2所示氨基酸序列的多肽，或其片段。本發(fā)明提供了用9°Y標(biāo)記的抗CDH3單克隆抗體在攜帶癌細(xì)胞系的異種移植小鼠中具有顯著的抗腫瘤活性。具體而言，本發(fā)明涉及下面各項(xiàng)[I] 一種抗體或其片段，其中所述抗體包含H(重)鏈V(可變)區(qū)和L(輕)鏈V區(qū)，其中所述H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)選自下組(a)包含具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列的H鏈V區(qū)中所含的互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)或與之功能上等同的⑶R的H鏈V區(qū)，以及包含具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的L鏈V區(qū)中所含的⑶R或與之功能上等同的⑶R的L鏈V區(qū)；(b)包含具有SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列的H鏈V區(qū)中所含的⑶R或與之功能上等同的⑶R的H鏈V區(qū)，以及包含具有SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的L鏈V區(qū)中所含的⑶R或與之功能上等同的⑶R的L鏈V區(qū)；(C)包含具有SEQ ID NO: 36所示的氨基酸序列的H鏈V區(qū)中所含的⑶R或與之功能上等同的⑶R的H鏈V區(qū)，以及包含具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的L鏈V區(qū)中所含的⑶R或與之功能上等同的⑶R的L鏈V區(qū)；和(d)包含具有SEQ ID NO:68、72、76或80所示的氨基酸序列的H鏈V區(qū)中所含的⑶R或與之功能上等同的⑶R的H鏈V區(qū)，以及包含具有SEQ IDNO:60的氨基酸序列的L鏈V區(qū)中所含的⑶R或與之功能上等同的⑶R的L鏈V區(qū)，且其中所述抗體能夠結(jié)合⑶H3多肽或其部分肽。
在典型的實(shí)施方案中，所述抗體選自下組小鼠抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、抗體片段、以及單鏈抗體。[2]本發(fā)明的抗體或其片段能夠與細(xì)胞毒劑、治療劑、放射性同位素標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物綴合。在典型的實(shí)施方案中，抗體被放射性同位素標(biāo)記物標(biāo)記。在更典型的實(shí)施方案中，放射性同位素標(biāo)記物選自9(1釔(9°Y)、125碘(125I)和111銦(mIn)。[3]在受試者中治療或預(yù)防與CDH3有關(guān)的疾病，或抑制表達(dá)CDH3的細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法，所述方法包括對(duì)所述受試者施用有效量的本發(fā)明的抗體或其片段。[4] 一種用于受試者中與CDH3有關(guān)的疾病或發(fā)生該疾病的傾向的診斷或預(yù)后的方法，其包括(a)使來自所述受試者的樣品或標(biāo)本接觸本發(fā)明的抗體或其片段；(b)檢測(cè)所述樣品或標(biāo)本中⑶H3多肽；并 (c)基于與對(duì)照相比CDH3蛋白的相對(duì)豐度來確定所述受試者是否患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生所述疾病。[5]用于在受試者中治療或預(yù)防與CDH3有關(guān)的疾病，或抑制表達(dá)CDH3的細(xì)胞的生長(zhǎng)的藥物組合物，所述組合物包含有效量的本發(fā)明的抗體或其片段，以及可藥用的擔(dān)載體或賦形劑。[6] 一種用于與CDH3有關(guān)的疾病的診斷或預(yù)后的試劑盒，該試劑盒包含本發(fā)明的抗體或片段。附圖
簡(jiǎn)述圖I顯示9°Y標(biāo)記的抗CDH3抗體(克隆#3、#4、#5和#6)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。9°Y標(biāo)記的抗⑶Η3抗體，特別是克隆#3、#4、和#6，有效地抑制了裸小鼠中移植的Η1373細(xì)胞的生長(zhǎng)，而施用無標(biāo)記的抗⑶Η3抗體沒有顯示腫瘤生長(zhǎng)的抑制。圖2顯示抗CDH3抗體(克隆#3、#4、#5和#6)的還原型SDS-PAGE分析?？寺?3、#4、#5的條帶圖樣揭示了與IgG重鏈和輕鏈對(duì)應(yīng)的兩條帶，而克隆#6的圖樣揭示了兩條重鏈帶和一條輕鏈帶。實(shí)施方案詳述本發(fā)明涉及抗⑶Η3抗體、包含它們的組合物、及它們?cè)谥委熁蝾A(yù)防與⑶Η3有關(guān)的疾病如癌癥中的用途。在一個(gè)典型的實(shí)施方案中，所述抗體是用放射性同位素標(biāo)記物標(biāo)記的。已經(jīng)報(bào)告了用于對(duì)自胰腺癌患者收集的胰腺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)分析的cDNA微陣列(Nakamura等，Oncogene (2004)，23:2385-400)。隨后鑒定了在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)特異性增強(qiáng)的多種基因。胎盤鈣粘蛋白(P-鈣粘蛋白；CDH3)，一種胞質(zhì)膜蛋白，是這些基因之一，在主要器官中呈現(xiàn)低表達(dá)水平。對(duì)于癌癥治療的靶基因來說這樣的特征是合適的，因?yàn)榭梢员苊飧弊饔玫奈ｋU(xiǎn)。另外，在其它癌細(xì)胞系中確認(rèn)了類似的⑶H3過表達(dá)，諸如肺、結(jié)腸直腸、前列腺、乳腺、胃和肝癌細(xì)胞系(W0/2007/102525)。定義如本文中使用的，術(shù)語“抗體”意圖包括與指定蛋白質(zhì)或其肽特異性起反應(yīng)的免疫球蛋白及其片段?？贵w可以包括人抗體、靈長(zhǎng)類化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、人源化抗體、融合至其它蛋白質(zhì)或放射性標(biāo)記物的抗體、和抗體片段。另外，本文中的抗體以最廣義使用，而且明確覆蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、自至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們展現(xiàn)期望的生物學(xué)活性?！翱贵w”指所有類(例如 IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM)?！翱贵w片段”指完整抗體的一部分，一般包含完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。因而，在本發(fā)明中，抗體片段可以包含完整抗體的一個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合部分。如本文中使用的，術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”指抗體保留特異性結(jié)合抗原(例如CDH3)的能力的一種或多種免疫學(xué)活性片段。已經(jīng)顯示抗體的抗原結(jié)合功能可以由全長(zhǎng)抗體的片段來實(shí)施?？贵w片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2、和Fv片段；線性抗體；和單鏈抗體分子。不管結(jié)構(gòu)如何，抗體片段結(jié)合被完整抗體識(shí)別的同一抗原。術(shù)語“抗體片段”還包括結(jié)合特定抗原的合成的或遺傳工程改造的多肽，諸如由輕鏈可變區(qū)組成的多肽、由重鏈和輕鏈可變區(qū)組成的“Fv”片段、其中輕鏈和重鏈可變區(qū)通過肽接頭相連接的重組單鏈多肽分子(“scFv蛋白”)、和由模擬高變區(qū)的氨基酸殘基組成的最小識(shí)別單位。如本文中使用的，與CDR “功能上等同”是指CDR賦予具備它們的抗體以與具有原 CDR的抗體基本上相等的抗原結(jié)合活性和抗原特異性。與CDR功能上等同的例子包括原始CDR替換、缺失、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基者。只要保持抗原結(jié)合活性和抗原特異性，氨基酸突變的數(shù)目和百分比沒有特別限制。不過，一般優(yōu)選改變可變區(qū)中所含的原始⑶R的氨基酸序列的20%以下。更優(yōu)選地，突變的百分比為15%以下，10%以下，5%以下。在優(yōu)選的實(shí)施方案，氨基酸突變的數(shù)目是10個(gè)以下，5個(gè)以下，4個(gè)以下，3個(gè)以下，2個(gè)以下，I個(gè)以下。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解可以接受的保留原始CDR的性質(zhì)的突變。抗體的牛成本發(fā)明使用針對(duì)⑶H3的抗體。這些抗體將通過已知方法來提供。描述了用于生成依照本發(fā)明使用的抗體的例示技術(shù)。( )單克降抗體單克隆抗體是從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的，基本上同質(zhì)即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體是相同的，除了可能以極小量存在的天然突變外。因此，修飾語“單克隆”表示抗體的這樣的特征，即其不是分立(discrete)抗體的混合物。例如,單克隆抗體可通過最初由Kohler等，Nature 256:495 (1975)描述的雜交瘤方法來制備，或者可通過重組DNA方法來制備(美國專利4，816，567)。在雜交瘤方法中，用CDH3多肽免疫小鼠或其它合適的宿主動(dòng)物，諸如倉鼠，以引發(fā)出生成或能夠生成會(huì)特異性結(jié)合CDH3多肽的抗體的淋巴細(xì)胞?；蛘撸梢栽隗w外用CDH3多肽免疫淋巴細(xì)胞。然后，使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding,《Monoclonal Antibodies !Principles and Practice)),59-103, Academic Press,1986)。將制備的雜交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基通?？珊写吸S嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞生長(zhǎng)。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些高效融合、支持所選抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定的高水平生成抗體、并對(duì)諸如HAT培養(yǎng)基等培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細(xì)胞。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系包括鼠源骨髓瘤系，諸如可從 Salk Institute Cell Distribution Center (San Diege, California,USA)獲得的MOPC-21和MPC-Il小鼠腫瘤的衍生鼠源骨髓瘤系，及可從American TypeCulture Collection (Manassas, Virginia, USA)獲得的 SP-2 或 X63_Ag8_653 細(xì)胞。用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系也已有描述(Kozbor, J.Immunol. 133:3001(1984) ;Brodeur等人,〈〈Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications》，51-63, Marcel Dekker, Inc. , New York,1987)。對(duì)于其中生長(zhǎng)著雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基，測(cè)定培養(yǎng)基中針對(duì)抗原的單克隆抗體的生成。優(yōu)選的是，通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測(cè)定，諸如放射性免疫測(cè)定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)，測(cè)定由雜交瘤細(xì)胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過例如Munson等，Anal. Biochem. 107:220 (1980)的30Scatchard分析來測(cè)定。
在鑒定得到生成具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，所述克隆可通過有限稀釋流程進(jìn)行亞克隆，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(Goding，((MonoclonalAntibodies !Principles and Practice》，59-103, Academic Press,1986)。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可在動(dòng)物中作為腹水瘤進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)?？赏ㄟ^常規(guī)免疫球蛋白純化流程，諸如例如蛋白A-Sepharose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基、腹水或血清適當(dāng)分開。編碼單克隆抗體的DNA易于通過常規(guī)流程分離并測(cè)序(例如使用能夠特異性結(jié)合編碼鼠源抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞是所述DNA的優(yōu)選來源。一旦分離，可將DNA置于表達(dá)載體中，然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，諸如原本不產(chǎn)生免疫球蛋白蛋白質(zhì)的大腸桿菌細(xì)胞、猴COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。關(guān)于編碼抗體的DNA在細(xì)菌中的重組表達(dá)的綜述性論文包括 Skerra 等，Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 (1993)和Pluckthun, Tmmunol. Revs. 130:151-188(1992)。另一種生成針對(duì)CDH3反應(yīng)性的特異性抗體或抗體片段的方法是用CDH3蛋白或肽篩選在細(xì)菌中表達(dá)的編碼免疫球蛋白基因或其部分的表達(dá)文庫。例如，可以使用噬菌體表達(dá)文庫在細(xì)菌中表達(dá)整個(gè)Fab片段、VH區(qū)和Fv區(qū)。參見例如Ward等，Nature,341:544-546 (1989) ；Huse 等，Science, 246:1275-1281 (1989);及 McCafferty 等，Nature,348:552-554(1990)。用例如⑶H3肽篩選此類文庫能鑒定出與⑶H3反應(yīng)性的免疫球蛋白片段。或者，可使用SCID-hu小鼠(可得自Genpharm)來生成抗體或其片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可從使用McCafferty 等，Nature 348:552-554(1990)所述技術(shù)構(gòu)建的抗體噬菌體文庫中分離抗體或抗體片段。Clackson等，Nature352:624-628 (1991)和 Marks 等，J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)分別描述了使用噬菌體文庫分離鼠源和人源抗體。后續(xù)出版物描述了通過鏈改組(Marks等，Bio/Technology 10:779-783(1992))，以及作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫的策略的組合感染和體內(nèi)重組(Waterhouse 等,Nuc. Acids Res. 21:2265-2266 (1993)),生成高親和力 CnM 范圍)的人源抗體。因此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替代方法。
還可以修飾DNA，例如通過用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列替代同源鼠源序列(美國專利 4，816，567 ；Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984))，或通過共價(jià)偶聯(lián)免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的整個(gè)或部分編碼序列。典型地，用此類非免疫球蛋白多肽替代抗體的恒定域，或者用它們替代抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變域，以產(chǎn)生這樣的嵌合二價(jià)抗體，它包含對(duì)一種抗原具有特異性的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，和對(duì)另一種不同抗原具有特異性的另一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明提供適合于治療或診斷疾病，和/或抑制表達(dá)⑶H3的細(xì)胞生長(zhǎng)的抗體。本發(fā)明還提供適于診斷CDH3相關(guān)疾病的抗體。在本發(fā)明中，成功地建立了鼠源單克隆抗體克隆#3、#4和#5，而且這些抗體，尤其是#3，被證明可有效抑制表達(dá)⑶H3的細(xì)胞(例如癌細(xì)胞)生長(zhǎng)。進(jìn)一步，這些抗體在它們的可變區(qū)中沒有糖基化位點(diǎn)。該性質(zhì)對(duì)于治療藥的開發(fā)是有利的，因?yàn)樗梢灾С挚贵w的均一性。此外，在本發(fā)明中，成功建立了克隆#6的沒有糖基化位點(diǎn)的變體。克隆#6已經(jīng)被 證明是具有抑制多種表達(dá)CDH3的細(xì)胞生長(zhǎng)的能力的抗體，但是它在H鏈V區(qū)的CDR2中具有一個(gè)糖基化位點(diǎn)。本發(fā)明的變體的天冬酰胺殘基被改變?yōu)榻z氨酸、蘇氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺殘基。小鼠單克隆抗體#3、克隆#4和#5的H鏈V區(qū)的氨基酸序列分別示于SEQID NO: 4,20、36。小鼠單克隆抗體克隆#3、克隆#4和#5的L鏈V區(qū)的氨基酸序列分別示于SEQ IDNO: 12,28,44ο進(jìn)一步，克隆#6的變體的H鏈V區(qū)的氨基酸序列分別示于SEQ ID Ν0:68、72、76和80?？寺?6的變體的L鏈V區(qū)的氨基酸序列示于SEQ ID NO:60。H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)中所含的⑶R可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法來確定。例如，Kabat等人(Kabat Ε. A. et al. (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest. 5thEdition)或 Chothia 等人(Chothia et al. J. Mol. Biol. (1987) 196; 901-917)描述的方法通常被用來確定CDR。因此，本發(fā)明提供抗體或其片段，包含H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)，其中所述H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)選自下組(a)包含具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列的H鏈V區(qū)中所含的互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)或與之功能上等同的⑶R的H鏈V區(qū)，以及包含具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的L鏈V區(qū)中所含的⑶R或與之功能上等同的⑶R的L鏈V區(qū)；(b)包含具有SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列的H鏈V區(qū)中所含的⑶R或與之功能上等同的⑶R的H鏈V區(qū)，以及包含具有SEQ ID NO: 28的氨基酸序列的L鏈V區(qū)中所含的⑶R或與之功能上等同的⑶R的L鏈V區(qū)；(C)包含具有SEQ ID NO: 36所示的氨基酸序列的H鏈V區(qū)中所含的⑶R或與之功能上等同的⑶R的H鏈V區(qū)，以及包含具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的L鏈V區(qū)中所含的⑶R或與之功能上等同的⑶R的L鏈V區(qū)；和(d)包含具有SEQ ID NO:68、72、76或80所示的氨基酸序列的H鏈V區(qū)中所含的⑶R或與之功能上等同的⑶R的H鏈V區(qū)，以及包含具有SEQ IDNO:60的氨基酸序列的L鏈V區(qū)中所含的⑶R或與之功能上等同的⑶R的L鏈V區(qū)，且其中所述抗體能夠結(jié)合⑶H3多肽或其部分肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，⑶R可根據(jù)Kabat定義(Kabat E. A. et al. (1991) Sequenceof Proteins of Immunological Interest. 5th Edition)來確定。每個(gè)克隆的根據(jù) Kabat定義確定的CDR如下所述?？寺?3的各CDR的氨基酸序列為H鏈V區(qū)中的CDRl: SFffIH (SEQ IDNO:6), CDR2:NIDPSDSETHYNQYFKD(SEQ ID NO:8)和 CDR3:GGTGFSS(SEQ ID NO:10) ；L鏈 V 區(qū)中的 CDRl:KASQDIDSYLS (SEQ IDNO:14), CDR2:RANRLVD(SEQ ID NO:16)，和CDR3:LQYDEFPRT(SEQID NO:18)?？寺?4的各CDR的氨基酸序列為H鏈V區(qū)中的CDRl: SYWMH (SEQ IDNO:21)，CDR2:NIDPSDSETHYNQNFND(SEQ ID NO:24)和 CDR3:GGTGFAY (SEQ ID NO:26)；L鏈 V 區(qū)中的 CDR1:KASQDINNYLG(SEQ IDN0:30)，CDR2:RTDRLIE(SEQ ID NO:32)，和CDR3:LQYDEFPRM(SEQID NO:34)?？寺?5的各CDR的氨基酸序列為H鏈V區(qū)中的CDRl: SYWMH (SEQ IDNO: 38)，CDR2:NIDPSDSETHYNQKFNDRA(SEQ ID NO:40)和 CDR3:GGTGFAY(SEQ ID NO:42)； L鏈 V 區(qū)中的 CDR1:KASQDINNYLG(SEQ IDNO:46)，CDR2:RTDRLIE(SEQ ID NO:48)，和CDR3:LQYDEFPRM(SEQID NO:50)?？寺?6的變體的各⑶R的氨基酸序列為H鏈V區(qū)中的⑶Rl: SYffIH (SEQID NO:54), CDR2:EIDPSDSYTYYNQNFKG (SEQ ID NO:70), EIDPSDTYTYYNQNFKG (SEQID NO:74), EIDPSDAYTYYNQNFKG(SEQID N0:78)或 EIDPSDQYTYYNQNFKG(SEQ IDNO:82)及 CDR3:SGYGNLFVY(SEQ ID NO:58) ;L 鏈 V 區(qū)中的 CDRl:SATSSVTYMY(SEQIDNO:62)，CDR2:RTSNLAS(SEQ ID NO:64),和 CDR3:QHYHIYPRT(SEQID NO:66)。因此，本發(fā)明還提供抗體或其片段，其中所述抗體包含H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)，其中所述H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)選自(a)包含具有如SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列的CDR1、具有如SEQ IDN0:8所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有如SEQ ID N0:10所示的氨基酸序列的⑶R3的H鏈V區(qū)，以及包含具有如SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列的⑶R1、具有如SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有如SEQ IDNO: 18所示的氨基酸序列的⑶R3的L鏈V區(qū)；(b)包含具有如SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列的CDRl、具有如SEQID NO: 24所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有如SEQ ID N0:26所示的氨基酸序列的⑶R3的H鏈V區(qū)，以及包含具有如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的⑶R1、具有如SEQ ID N0:32所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有如SEQ IDNO: 34所示的氨基酸序列的⑶R3的L鏈V區(qū)；(c)包含具有如SEQ ID NO: 38所示的氨基酸序列的CDRl、具有如SEQID NO:40所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有如SEQ ID N0:42所示的氨基酸序列的⑶R3的H鏈V區(qū)，以及包含具有如SEQ ID N0:46所示的氨基酸序列的⑶R1、具有如SEQ ID N0:48所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有如SEQ IDNO: 50所示的氨基酸序列的⑶R3的L鏈V區(qū)；和(d)包含具有如SEQ ID NO: 54所示的氨基酸序列的⑶Rl、具有如SEQIDNO:70，74，78或82所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列的⑶R3的H鏈V區(qū)，以及包含具有如SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列的⑶R1、具有如SEQID NO: 64所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有如SEQ ID NO: 66所示的氨基酸序列的⑶R3的L鏈V區(qū)。上述“包含具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的CDRl、具有如SEQID NO:8所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有如SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列的⑶R3的H鏈V區(qū)”的H鏈V區(qū)(VH)的一個(gè)例子是具有如SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列的VH。上述“包含具有如SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列的⑶R1、具有如SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有如SEQ IDNO: 8所示的氨基酸序列的⑶R3的L鏈V區(qū)”的L鏈V區(qū)(VL)的一個(gè)例子是具有如SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列的VL。上述“包含具有如SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列的CDRl、具有如SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQ ID NO: 26所示的氨基酸序列的CDR3的H鏈V區(qū)”的VH的一個(gè)例子是具有如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的VH。上述“包含具有如SEQID NO: 30所示的氨基酸序列的⑶R1、具有如SEQ ID NO: 32所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有如SEQ IDNO: 34所示的氨基酸序列的CDR3的L鏈V區(qū)”的VL的一個(gè)例子是具有如SEQIDNO:28所示的氨基酸序列的VL。上述“包含具有如SEQ ID NO: 38所示的氨基酸序列的CDRl、具有如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列的CDR3的H鏈V區(qū)”的VH的一個(gè)例子是具有如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的VH。上述“包含具有如SEQ ID NO: 46所示的氨基酸序列的⑶R1、具有如SEQ ID NO: 48所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有如SEQ IDNO: 50所示的氨基酸序列的⑶R3的L鏈V區(qū)”的VL的一個(gè)例子是具有如SEQIDNO:44所示的氨基酸序列的VL。上述“包含具有如SEQ ID N0:54所示的氨基酸序列的⑶R1、具有如SEQ IDNO: 70, 74，78或82所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQ ID NO: 58所示的氨基酸序列的CDR3的H鏈V區(qū)”的VH的一個(gè)例子是具有如SEQ IDNO:68, 72，76，或80所示的氨基酸序列的VH。上述“包含具有如SEQ ID N0:62所示的氨基酸序列的⑶R1、具有如SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列的CDR2、和具有如SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列的CDR3的L鏈V區(qū)”的VL的一個(gè)例子是具有如SEQ ID N0:60所示的氨基酸序列的VL。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗體或其片段，其中所述抗體包含具有選自SEQ ID NO: 4，20, 36，68，72，76和80的氨基酸序列的H鏈V區(qū)，和/或具有選自SEQ IDNO: 12,28,44和60的氨基酸序列的L鏈V區(qū)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含(a)具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的H鏈V區(qū)，和具有如SEQ IDN0:12所示的氨基酸序列的L鏈V區(qū)；(b).具有如SEQ ID N0:20所示的氨基酸序列的H鏈V區(qū)，和具有如SEQID NO:28所示的氨基酸序列的L鏈V區(qū)；(c)具有如SEQ ID NO: 36所示的氨基酸序列的H鏈V區(qū)，和具有如SEQID NO:44所示的氨基酸序列的L鏈V區(qū)；或(d)具有如SEQ ID NOs:68，72，76或80所示的氨基酸序列的H鏈V區(qū)，和具有如SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列的L鏈V區(qū)。本發(fā)明的抗體可以通過常規(guī)方法制備。例如，所述抗體可以通過將編碼抗體多肽的多肽整合到合適的載體中，將該載體導(dǎo)入宿主，并根據(jù)常規(guī)基因重組技術(shù)從所述宿主產(chǎn)生抗體來制備(參見，例如，Vandamme, A. M. et al. , Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-75)。編碼本發(fā)明抗體的V區(qū)的多核苷酸的核酸序列可以從本發(fā)明的抗體的V區(qū)的氨基酸序列推導(dǎo)出來。例如，SEQ ID N0:3和11所示的核酸序列可以分別用作編碼克隆#3的VH和VL的核酸序列。例如，SEQ ID NO: 19和27所示的核酸序列可以分別用作編碼克隆#4的VH和VL的核酸序列。例如，SEQ ID NO:35和43所示的核酸序列可以分別用作編碼克隆#5的VH和VL的核酸序列。例如，SEQ ID N0:67、71、75或79，和59所示的核酸序列可以分別用作編碼克隆#6的變體的VH和VL的核酸序列。編碼本發(fā)明抗體的V區(qū)的多核苷酸可基于所述序列信息通過常規(guī)方法如固相技術(shù)(Beaucage SL&Iyer RP,Tetrahedron(1992)48，2223-311; Matthes et al. , EMBO J (1984) 3，801-5)和寡核苷酸合成技術(shù)(Joneset al. Nature (1986) 321，522-5)來合成。編碼抗體V區(qū)的多核苷酸整合到含有編碼抗體恒定(C)區(qū)的多核苷酸的表達(dá)載體中。為了制備本發(fā)明中使用的抗體，將編碼抗體的多肽(抗體基因)整合到表達(dá)載體中，使得抗體基因能夠在表達(dá)控制元件(例如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子)的控制下表達(dá)。用該表達(dá)載 體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以表達(dá)抗體。在抗體基因的表達(dá)中，可以將編碼H鏈的多核苷酸和編碼L鏈的多核苷酸整合到不同的表達(dá)載體中，然后用所得的重組表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞?；蛘?，可以將編碼H鏈的多核苷酸和編碼L鏈的多核苷酸一起整合到一個(gè)表達(dá)載體中，然后用所得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(例如，W094/11253)。抗體基因可以用已知的方法表達(dá)。為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，可以將常規(guī)的有用啟動(dòng)子、要表達(dá)的抗體基因和多聚(A)信號(hào)(位于抗體基因的3’端的下游)可操作地連接。例如，作為有用的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子系統(tǒng)，可以使用人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子系統(tǒng)。其他啟動(dòng)子/增強(qiáng)子系統(tǒng)，例如，源自病毒(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿病毒40(SV40))者和源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞者(例如人延伸因子la (HEF1 a )，也可以用于在本發(fā)明中表達(dá)抗體。當(dāng)使用SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子系統(tǒng)時(shí)，可以容易地利用Mulligan等人(Nature (1979) 277, 108-14.)的方法來進(jìn)行基因表達(dá)。當(dāng)使用HEFl α啟動(dòng)子/增強(qiáng)子系統(tǒng)時(shí)，可以容易地利用Mizushima等人(Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322.)的方法來進(jìn)行
基因表達(dá)。對(duì)于在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，可將常規(guī)可用的啟動(dòng)子、用于分泌目標(biāo)抗體的信號(hào)序列和抗體基因操作性連接在一起。作為啟動(dòng)子，可使用IacZ啟動(dòng)子或araB啟動(dòng)子。當(dāng)使用IacZ啟動(dòng)子時(shí)，可以按照Ward等人(Ward等，Nature (1098) 341, 544-6 ；FASBEJ. (1992)6,2422-7)所述的方法進(jìn)行基因表達(dá)，而當(dāng)使用araB啟動(dòng)子時(shí)，可以按照Better等人(Better等，Science (1988) 240,1041-3)所述的方法進(jìn)行基因表達(dá)。對(duì)于用于分泌抗體的信號(hào)序列而言，當(dāng)須將目標(biāo)抗體分泌到大腸桿菌周質(zhì)間隙時(shí)，可使用 PelB 信號(hào)序列(Lei, S. P.等，J. Bacteriol. (1987) 169,4379-83)。將分泌至周質(zhì)間隙的抗體分離出來，然后重折疊，使抗體呈合適構(gòu)型?？墒褂脕碜圆《?例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV))等的復(fù)制起點(diǎn)。為了增加宿主細(xì)胞系統(tǒng)中的基因拷貝數(shù)，表達(dá)載體還可含有選擇標(biāo)記基因，例如氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因和二氫葉酸還原酶(dhfr)基因。為了產(chǎn)生本發(fā)明所用的抗體，任何表達(dá)系統(tǒng)(包括真核細(xì)胞系統(tǒng)和原核細(xì)胞系統(tǒng))都可使用。真核細(xì)胞包括已建立的動(dòng)物細(xì)胞系(例如哺乳動(dòng)物、昆蟲、霉菌和真菌、酵母)。原核細(xì)胞包括細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌細(xì)胞。優(yōu)選本發(fā)明所用的抗體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK、VeiO和HeLa細(xì)胞)中表達(dá)。然后，在體外或體內(nèi)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以產(chǎn)生目標(biāo)抗體?？刹捎萌魏我阎椒ㄟM(jìn)行宿主細(xì)胞的培養(yǎng)。本文所用的培養(yǎng)基可以是DMEM培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基或MDM培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可含有血清補(bǔ)充物，例如胎牛血清(FCS)。在重組抗體的產(chǎn)生中，除了上述宿主細(xì)胞外，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也可用作宿主。例如，將抗體基因插入到原本在動(dòng)物乳汁中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(例如β_酪蛋白)的編碼基因的預(yù)定位置上，以制備融合基因。將含有引入抗體基因的融合基因的DNA片段注射到非人類動(dòng)物胚胎中，然后將胚胎引入雌性動(dòng)物中。帶有胚胎的雌性動(dòng)物懷有轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物或其后代的乳汁分泌出目標(biāo)抗體。為了增加含抗體乳汁的量，可將合適激素給 予轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(Ebert, K. Μ.等，Bio/Technology (1994) 12，699-702)?？蓪⑷缟纤霰磉_(dá)和產(chǎn)生的抗體從細(xì)胞或宿主動(dòng)物體內(nèi)分離出來并純化。本發(fā)明所用的抗體的分離和純化可在親和柱上進(jìn)行。常規(guī)使用的抗體分離和純化的其它方法也可采用；因此并不具體限定方法。例如，各種色譜、過濾、超濾、鹽析和透析方法都可單獨(dú)使用或組合使用，以分離純化目標(biāo)抗體(Antibodies A Laboratory Manual. Harlow, David Lane編著，Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。(ii)嵌合抗體和人源化抗體在本發(fā)明中，可使用人工修飾的重組抗體，包括嵌合抗體和人源化抗體。這些修飾抗體可由任何已知方法來制備。例如，可使用為產(chǎn)生“嵌合抗體”而開發(fā)的技術(shù)(Morrison等，1984, Proc. Natl. Acad. Sci. , 81 :6851-5 ；Neuberger 等，1984, Nature, 312 :604-8 ；Takeda 等，1985, Nature, 314 :452-4)。嵌合抗體是分子中的不同部分來自不同動(dòng)物物種的分子，例如具有鼠mAb的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的分子，例如“人源化抗體”。本發(fā)明的嵌合抗體可如下制備將抗體V區(qū)的編碼DNA與人抗體C區(qū)的編碼DNA連接起來，將連接產(chǎn)物整合到表達(dá)載體中，然后將所得重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主中，產(chǎn)生嵌合抗體。人源化抗體也可稱為“重塑(reshaped)人抗體”，其中將非人類哺乳動(dòng)物(例如小鼠)抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植到人抗體上。產(chǎn)生這樣的人源化抗體的通用遺傳重組方法也是已知的(例如EP 125023 ;W096/02576)。具體地講，設(shè)計(jì)并合成將小鼠抗體⑶R與構(gòu)架區(qū)(FR)連接在一起的DNA序列，所述合成是通過PCR方法，用設(shè)計(jì)成具有與CDR和FR終止區(qū)重疊的區(qū)域的若干寡核苷酸作為引物。將所得DNA與人抗體C區(qū)的編碼DNA連接起來，將連接產(chǎn)物整合到表達(dá)載體中。將所得重組表達(dá)載體引入到宿主中，因而產(chǎn)生人源化抗體(例如W096/02576)。選擇與⑶R連接的FR，使得⑶R可構(gòu)成功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)。必要時(shí)，可以替換抗體V區(qū)FR中的氨基酸，使重塑人抗體的⑶R可構(gòu)成合適的抗原結(jié)合位點(diǎn)(Sato，K.等，Cancer Res. (1993)53,851-6)。嵌合抗體由非人類哺乳動(dòng)物抗體來源的V區(qū)和人抗體來源的C區(qū)組成。人源化抗體由非人類哺乳動(dòng)物抗體來源的CDR和人抗體的FR和C區(qū)組成。人源化抗體可用于臨床用途，因?yàn)獒槍?duì)人體的抗體抗原性降低。本發(fā)明所用的嵌合抗體或人源化抗體的一個(gè)具體實(shí)例是抗體中的V區(qū)來自小鼠單克隆抗體克隆#3、#4、#5或克隆#6的變體的抗體，或者抗體中的CDR來自小鼠單克隆抗體克隆#3、#4、#5或克隆#6的變體的抗體。產(chǎn)生這樣的嵌合抗體和人源化抗體的方法如下所述。例如，首先，從抗體生成細(xì)胞的RNA通過使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等制備編碼克隆#3、#4、#5或克隆#6的變體的抗體的V區(qū)或⑶R的基因(參見例如Larrick等，^Methods:a Companion to Methods in Enzymology^,第 2 卷，第 106 頁，1991 ；Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibody〃，收錄于 MonoclonalAntibody:Production, Engineering and Clinical Application, Ritter 等編，第 166 頁，Cambridge University Press, 1995,及Ward等，"Genetic Manipulation and Expressionof Antibody〃，收錄于 Monoclonal Antibody:Principles andApplications, Birch 等編，第137H，Wiley-LiSS，Inc.，1995)。編碼抗體V區(qū)或⑶R的多核苷酸可以通過寡核苷酸合成技術(shù)來合成(如Jones等，(1986) Nature，321:522-5)。然后，按照常規(guī)方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后切取目標(biāo)DNA片段，回收，純化并連接到載體DNA上。可用已知連接試劑盒將所得DNA和載體DNA連接起來，構(gòu)建重組載體?？砂凑找韵乱阎椒ㄖ苽漭d體 DNA :J. Sambrook 等，“Molecular Cloning”，Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989。載體DNA用限制酶消化,然后可以用已知方法或使用自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)定所需DNA的核苷酸序列。一旦克隆小鼠單克隆抗體L鏈和H鏈的V區(qū)的編碼DNA片段(在下文中，抗體L鏈或H鏈有時(shí)可稱為“小鼠L鏈或H鏈”(對(duì)于小鼠抗體)和“人L鏈或H鏈”(對(duì)于人抗體)，就將小鼠V區(qū)的編碼DNA與人抗體恒定區(qū)的編碼DNA連接起來并表達(dá)，以產(chǎn)生嵌合抗體。制備嵌合抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法包括將克隆cDNA中存在的小鼠前導(dǎo)序列和V區(qū)序列與哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體中已經(jīng)存在的人抗體C區(qū)的編碼序列連接起來。或者，將克隆cDNA中存在的小鼠前導(dǎo)序列和V區(qū)序列與人抗體C區(qū)的編碼序列連接起來，然后再連接到哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體中。包含人抗體C區(qū)的多肽可以是任何人抗體H鏈或L鏈的C區(qū)，包括例如C Y I、C Y 2、CY3或Cy4(人H鏈)或CA或Ck (L鏈)。為了制備嵌合抗體，先構(gòu)建兩個(gè)表達(dá)載體；也就是說，構(gòu)建含有處于表達(dá)控制元件(例如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子系統(tǒng))控制之下的小鼠L鏈V區(qū)和人L鏈C區(qū)的編碼DNA的表達(dá)載體，以及含有處于表達(dá)控制元件(例如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子系統(tǒng))控制之下的小鼠H鏈V區(qū)和人H鏈C區(qū)的編碼DNA的表達(dá)載體。然后，宿主細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如COS細(xì)胞))用這些表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化并在體外或體內(nèi)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞以產(chǎn)生嵌合抗體(參見例如W091/16928)?；蛘?，將克隆cDNA中存在的小鼠前導(dǎo)序列與小鼠L鏈V區(qū)和人L鏈C區(qū)的編碼DNA以及小鼠前導(dǎo)序列與小鼠H鏈V區(qū)和人H鏈C區(qū)的編碼DNA都引入到一個(gè)表達(dá)載體中(參見例如W094/11523)，再將所述載體用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；然后在體外或體內(nèi)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主以產(chǎn)生所需嵌合抗體?？赏ㄟ^將含有編碼小鼠H鏈V區(qū)的核苷酸序列的cDNA(在下文中也稱為“H鏈V區(qū)的cDNA” )導(dǎo)入含有編碼人抗體H鏈C區(qū)的核苷酸序列的基因組DNA(在下文中也稱為“H鏈C區(qū)的基因組DNA”)或編碼所述區(qū)的cDNA (在下文中也稱為“H鏈C區(qū)的cDNA”)的合適表達(dá)載體中，從而獲取用于表達(dá)嵌合抗體H鏈的載體。H鏈C區(qū)包括例如具有編碼H鏈C區(qū)(尤其是編碼CYl區(qū))的基因組DNA的表達(dá)載體包括例如HEF-PMh-g Y I (W092/19759)和 DHER-INCREMENTE-RVh-PMl-f (W092/19759)?；蛘?，如先前文獻(xiàn)所述方法，采用來自人PBMC(外周血單核細(xì)胞)的cDNA制備人恒定區(qū)文庫(Liu，A. Y.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,第 84 卷，3439-43,1987 ；Reff ,Μ. Ε.等，Blood,第 83 卷，第2期，435-45，1994)。當(dāng)將編碼小鼠H鏈V區(qū)的cDNA插入到這些表達(dá)載體中時(shí)，可通過PCR方法將合適核苷酸序列引入到所述cDNA中。例如，可用下述PCR引物進(jìn)行PCR :經(jīng)設(shè)計(jì)而使所述cDNA在其5'端具有合適限制酶識(shí)別序列和緊鄰其起始密碼子前的Kozak共有序列，以便改善轉(zhuǎn)錄效率的引物；以及經(jīng)設(shè)計(jì)而使所述cDNA在其3'端具有合適限制酶識(shí)別序列和剪接供體位點(diǎn)，用于基因組DNA的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的適當(dāng)剪接以產(chǎn)生mRNA，以將這些合適核苷酸序列弓I入到表達(dá)載體中的引物。由此構(gòu)建的編碼小鼠H鏈V區(qū)的cDNA用合適限制酶處理，然后插入到所述表達(dá)載體中以構(gòu)建含有編碼H鏈C區(qū)(Cy I區(qū))的基因組DNA的嵌合H鏈表達(dá)載體。或者，由此構(gòu) 建的編碼小鼠H鏈V區(qū)的cDNA可以用合適限制酶處理，與編碼所述H鏈C區(qū)C Y I的cDNA連接，然后插入到表達(dá)載體例如PQcXIH(Clontech)中，以構(gòu)建含有編碼嵌合H鏈的cDNA表達(dá)載體。用于表達(dá)嵌合抗體L鏈的載體可通過將編碼小鼠L鏈V區(qū)的cDNA與編碼人抗體L鏈C區(qū)的基因組DNA或cDNA連接起來并引入到合適表達(dá)載體中來獲取。L鏈C區(qū)包括例如K鏈和λ鏈。當(dāng)構(gòu)建含有編碼小鼠L鏈V區(qū)的cDNA的表達(dá)載體時(shí)，可將合適核苷酸序列例如識(shí)別序列或Kozak共有序列通過PCR方法引入到所述表達(dá)載體中。編碼人L λ鏈C區(qū)的cDNA的完整核苷酸序列可通過DNA合成儀來合成并通過PCR方法來構(gòu)建。已知人LA鏈C區(qū)具有至少4種不同同種型，每種同種型都可用于構(gòu)建表達(dá)載體。所構(gòu)建的編碼人L λ鏈C區(qū)的cDNA和以上構(gòu)建的編碼小鼠L鏈V區(qū)的cDNA可以在合適限制酶位點(diǎn)間連接并插入到表達(dá)載體例如PQcXIH(Clontech)中，以構(gòu)建含有編碼嵌合抗體L λ鏈的cDNA的表達(dá)載體?？梢宰岳绾谢蚪MDNA的HEF-PMlk-gk，構(gòu)建有待與編碼小鼠L鏈V區(qū)的DNA連接的編碼人L K鏈C區(qū)的DNA(參見W092/19759)?；蛘撸梢匀缜叭怂龅夭捎脕碜匀薖BMC(外周血單個(gè)核細(xì)胞)的cDNA制備人恒定區(qū)文庫(Liu，A. Y.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,第 84 卷，3439-43,1987 ；Reff ,Μ. Ε.等，Blood,第 83 卷，第 2 期，435-45，1994)?？赏ㄟ^PCR方法將合適限制酶的識(shí)別序列引入到編碼L K鏈C區(qū)的DNA的5'端及3'端，如上構(gòu)建的編碼小鼠L鏈V區(qū)的DNA與編碼Lk鏈C區(qū)的DNA可彼此連接并插入到表達(dá)載體例如PQcXIH(Clontech)中，以構(gòu)建含有編碼嵌合抗體L κ鏈的cDNA的表達(dá)載體。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法(Jones等，Nature321:522-525(1986);Reichmann 等,Nature 332:323-327(1988);Verhoeyen 等,Science239:1534-1536(1988))，通過用⑶R序列替代相應(yīng)的人抗體序列來實(shí)現(xiàn)。為了制備將小鼠單克隆抗體CDR移植到人抗體上的人源化抗體，理想的是小鼠單克隆抗體FR與人抗體FR之間存在高度同源性。因此，將小鼠單克隆抗體克隆#3、#4、#5或克隆#6的變體的H鏈和L鏈的V區(qū)與所有已用ProteinData Bank闡明結(jié)構(gòu)的已知抗體的V區(qū)之間進(jìn)行比較。此外，同時(shí)還將它們與由Kabat等根據(jù)抗體FR的長(zhǎng)度、氨基酸的同源性等而分類的人抗體亞組(HSG :人亞組)進(jìn)行比較(Kabat, E.A.等，US Dep, HealthandHuman Services, US Government Printing Offices,1991)。設(shè)計(jì)編碼人源化抗體V區(qū)的DNA的第一步是根據(jù)設(shè)計(jì)來選擇人抗體V區(qū)。例如，與小鼠抗體V區(qū)FR具有大于80%同源性的人抗體V區(qū)FR可用于產(chǎn)生人源化抗體。在人源化抗體中，C區(qū)和所述抗體V區(qū)框架(FR)區(qū)來自人，而V區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)來自小鼠。可以按照稱為⑶R移植的方式，通過PCR方法產(chǎn)生包含人源化抗體V區(qū)的多肽，只要有適合作為模板人抗體的DNA片段可用?！癈DR移植”是指制備編碼小鼠來源的CDR的DNA片段并替代人抗體CDR作為模板的方法。如果沒有可用作模板的人抗體DNA片段,可通過DNA合成儀來合成數(shù)據(jù)庫中登記的核苷酸序列，并可通過PCR方法來產(chǎn)生人源化抗體V區(qū)的DNA。此外，當(dāng)數(shù)據(jù)庫中僅登記有氨基酸序列時(shí)，將可按照以下報(bào)道的方法， 根據(jù) Kabat, E.A.等，載于 US Dep. Health andHuman Services, USGovernment PrintingOffices, 1991中報(bào)告的抗體的密碼子用法的知識(shí)，自氨基酸序列推導(dǎo)出完整核酸序列。在DNA合成儀中合成該核酸序列，并可通過PCR方法來制備人源化抗體V區(qū)的DNA并引入到合適的宿主中，接著表達(dá)它以產(chǎn)生所需多肽。通過PCR方法的CDR移植的通用方法描述于下文，當(dāng)有作為模板的人抗體DNA片段可用時(shí)。首先，合成對(duì)應(yīng)于相應(yīng)CDR的小鼠來源的DNA片段。根據(jù)先前克隆的小鼠H鏈和L鏈的V區(qū)的核苷酸序列，合成CDR I至3。例如，當(dāng)根據(jù)小鼠單克隆抗體克隆#3來產(chǎn)生人源化抗體時(shí)，H 鏈 V 區(qū) CDR 序列可以是 SEQ ID NO 6 (VH CDR1)、8 (VH CDR2)和 10 (VHCDR3)所示的氨基酸序列；而L鏈V區(qū)CDR序列可以是SEQ ID NO: 14 (VL CDR1)、16(VL CDR2)和18 (VL CDR3)所示的氨基酸序列。當(dāng)根據(jù)小鼠單克隆抗體克隆#4來產(chǎn)生人源化抗體時(shí)，H鏈 V 區(qū) CDR 序列可以是 SEQ ID NO 22(VH CDR1)、24(VH CDR2)和 26 (VHCDR3)所示的氨基酸序列；而 L鏈 V 區(qū) CDR 序列可以是 SEQ ID NO 30(VL CDR1)、32(VL CDR2)和 34(VL CDR3)所示的氨基酸序列。當(dāng)根據(jù)小鼠單克隆抗體克隆#5來產(chǎn)生人源化抗體時(shí)，H鏈V區(qū)CDR序列可以是SEQ IDNO 38(VH CDR1)、40(VH CDR2)和42 (VHCDR3)所示的氨基酸序列；而1^鏈V 區(qū) CDR 序列可以是 SEQ ID NO 46 (VL CDR1)、48(VL CDR2)和 50 (VLCDR3)所示的氨基酸序列。當(dāng)根據(jù)小鼠單克隆抗體克隆#6來產(chǎn)生人源化抗體時(shí)，H鏈V區(qū)CDR序列可以是SEQID NO 54(VH CDR1)、70，74，78 或 82(VHCDR2)和 66 (VHCDR3)所示的氨基酸序列;而1鏈 V區(qū)CDR序列可以是SEQ IDNO 62(VL CDR1)、64(VL CDR2)和66 (VL CDR3)所示的氨基酸序列。人源化抗體H鏈V區(qū)的DNA可與任何人抗體H鏈C區(qū)(例如人H鏈C Y I區(qū))的DNA連接起來。如上所述，H鏈V區(qū)的DNA可用合適限制酶處理并與處于表達(dá)控制元件(例如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子系統(tǒng))控制之下的編碼人H鏈C區(qū)的DNA連接起來，構(gòu)成含有人源化H鏈V區(qū)和人H鏈C區(qū)的DNA的表達(dá)載體。人源化抗體L鏈V區(qū)的DNA可與任何人抗體L鏈C區(qū)(例如人L鏈C λ區(qū))的DNA連接起來。L鏈V區(qū)的DNA可用合適限制酶處理并與處于表達(dá)控制元件(例如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子系統(tǒng))控制之下的編碼人LA鏈C區(qū)的DNA連接起來，構(gòu)成含有人源化L鏈V區(qū)和人LA鏈C區(qū)的DNA的表達(dá)載體。編碼人源化抗體H鏈V區(qū)和人H鏈C區(qū)的DNA以及編碼人源化L鏈V區(qū)和人L鏈C區(qū)的DNA也可導(dǎo)入一個(gè)表達(dá)載體(例如公開于W094/11523的載體)中，所述載體可用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，然后在體內(nèi)或體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主以產(chǎn)生所需人源化抗體。為了產(chǎn)生嵌合或人源化抗體，應(yīng)當(dāng)制備如上所述的兩個(gè)表達(dá)載體。因此，對(duì)于嵌合抗體，構(gòu)建包含處于表達(dá)控制元件(例如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子系統(tǒng))控制之下的小鼠H鏈V區(qū)和人H鏈C區(qū)的編碼DNA的表達(dá)載體，以及包含處于表達(dá)控制元件控制之下的小鼠L鏈V區(qū)和人L鏈C區(qū)的編碼DNA的表達(dá)載體。對(duì)于人源化抗體，構(gòu)建包含處于表達(dá)控制兀件控制之下的人源化H鏈V區(qū)和人H鏈C區(qū)的編碼DNA的表達(dá)載體，以及包含處于表達(dá)控制元件控制之下的人源化L鏈V區(qū)和人L鏈C區(qū)的編碼DNA的表達(dá)載體。然后，可用這些表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如COS細(xì)胞)，在體外或體內(nèi)培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化細(xì)胞以產(chǎn)生嵌合或人源化抗體(參見例如W091/16928)?；蛘?，可 以將編碼H鏈V區(qū)和C區(qū)的DNA和編碼L鏈V區(qū)和C區(qū)的DNA連接在一個(gè)載體中并轉(zhuǎn)化到合適宿主細(xì)胞中以產(chǎn)生抗體。因此，在嵌合抗體的表達(dá)中，可將克隆cDNA中存在的小鼠前導(dǎo)序列、小鼠H鏈V區(qū)和人H鏈C區(qū)的編碼DNA以及小鼠前導(dǎo)序列、小鼠L鏈V區(qū)和人L鏈C區(qū)的編碼DNA引入到一個(gè)表達(dá)載體(例如公開于例如W094/11523中的載體)中。在人源化抗體的表達(dá)中，可將人源化H鏈V區(qū)和人H鏈C區(qū)的編碼DNA以及人源化L鏈V區(qū)和人L鏈C區(qū)的編碼DNA引入到一個(gè)表達(dá)載體(例如公開于例如W094/11523中的載體)中。這樣的載體用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并在體內(nèi)或體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主以產(chǎn)生目標(biāo)嵌合或人源化抗體。任何表達(dá)系統(tǒng)都可用于產(chǎn)生針對(duì)本發(fā)明FZDlO蛋白的嵌合或人源化抗體。例如，真核細(xì)胞包括動(dòng)物細(xì)胞，例如已建立的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、真菌細(xì)胞和酵母細(xì)胞；原核細(xì)胞包括細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌。優(yōu)選本發(fā)明的嵌合或人源化抗體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如COS或CHO細(xì)胞)中表達(dá)。用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的任何常規(guī)啟動(dòng)子都可使用。優(yōu)選使用例如人巨細(xì)胞病毒(HCMV)立即早期啟動(dòng)子。另外，用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)的啟動(dòng)子可包括病毒啟動(dòng)子(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿病毒(SV)40的啟動(dòng)子)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞來源的啟動(dòng)子(例如人多肽鏈延伸因子-I a (HEF-1 α )的啟動(dòng)子)。例如，按照Mulligan 等人的方法(Mulligan 等，Nature，277，108-14，1979)可以容易地使用 SV40 啟動(dòng)子；Mizushima, S.等人的方法(Mizushima, S.等，Nucleic Acids Research, 18, 5322,1990)可容易地與HEF-I α啟動(dòng)子一起使用。復(fù)制起點(diǎn)包括來自SV40、多瘤病毒、腺病毒或牛乳頭瘤病毒(BPV)的那些。此外，表達(dá)載體可包含以下酶的基因作為選擇標(biāo)記，用于增加宿主細(xì)胞系統(tǒng)中的基因拷貝數(shù)磷酸轉(zhuǎn)移酶APH(3' ) II或I (neo)、胸苷激酶(TK)、大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)或二氫葉酸還原酶(DHFR)。用嵌合或人源化抗體的編碼DNA轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體經(jīng)培養(yǎng)而產(chǎn)生的目標(biāo)嵌合或人源化抗體，可從細(xì)胞中分離純化出來?？赏ㄟ^使用蛋白A瓊脂糖柱進(jìn)行目標(biāo)嵌合或人源化抗體的分離純化，也可使用蛋白質(zhì)分離純化時(shí)所用的任何方法，因此對(duì)此沒有限制。例如，可任選選擇或組合色譜、超濾、鹽析和透析方法以分離純化嵌合或人源化抗體。
嵌合抗體或人源化抗體分離之后，所得純化抗體的濃度可通過ELISA測(cè)得?？赏ㄟ^任何已知方法進(jìn)行抗原結(jié)合活性或其它活性(包括嵌合抗體或人源化抗體與正常細(xì)胞的結(jié)合活性)的測(cè)定(Antibodies ALaboratory Manual,Harlow,David Lane編著，Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。對(duì)于抗體的抗原結(jié)合活性的測(cè)定方法,可采用ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)、EIA (酶免疫測(cè)定)、RIA (放射免疫測(cè)定)或熒光測(cè)定等技術(shù)。在ELISA中，通常將本發(fā)明的抗體固定在平板上，將本發(fā)明的蛋白質(zhì)施加到平板上，再施加含有所需抗體的樣品(如產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的培養(yǎng)上清液或純化的抗體)。然后施加用帶有酶(如堿性磷酸酶)標(biāo)記簽的識(shí)別第一抗體的第二抗體，并將其預(yù)溫育。洗滌后，在平板中加入酶底物如磷酸對(duì)硝基苯酯，測(cè)定吸光度，評(píng)價(jià)目標(biāo)樣品的抗原結(jié)合活性?？梢允褂肂IAcore(Pharmacia)評(píng)價(jià)本發(fā)明抗體的結(jié)合活性。為了保持抗原結(jié)合活性，依照一種優(yōu)選的方法，通過使用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是可獲得的，且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。還有圖解和顯示所選候選免疫球蛋白 序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序可用。通過檢查這些顯示圖像可以分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能行使中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可從受體和輸入序列中選出FR殘基并進(jìn)行組合，從而獲得所需的抗體特征，諸如更高的對(duì)靶抗原的親和力。(iii)抗體片段已經(jīng)開發(fā)了多種生成抗體片段的技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過蛋白水解消化完整抗體來得到這些片段(參見例如 Morimoto 等，Journal of Biochemical and Biophysical Methods24:107-117(1992)及 Brennan 等，Science 229:81(1985))。然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細(xì)胞生成這些片段。例如，可從上文討論的噬菌體抗體庫分離抗體片段。或者，可直接從大腸桿菌回收Fab’ -SH片段，并通過化學(xué)方法偶聯(lián)形成F(ab' )2片段(Carter等，Bio/Technology 10:163-167 (1992) )0依照另一種方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離F(ab’)2片段。用于生成抗體片段的其它技術(shù)對(duì)從業(yè)人員是顯而易見的。在其它實(shí)施方案中，優(yōu)選的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185 ;美國專利5，571，894;和美國專利5，587，458?？贵w片段還可以是“線性抗體”，例如如美國專利5，641，870中所述。所述線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。(iv)雙特異件抗體雙特異性抗體指對(duì)至少兩種不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。例如，可以將抗癌細(xì)胞標(biāo)志物臂與可結(jié)合白細(xì)胞上的觸發(fā)分子諸如T細(xì)胞受體分子(如CD2或CD3)或IgG的Fe 受體(FcyR)，諸如 Fe YRI (CD64)、FcyRII (CD32)和 Fe Y RIII (CD16)的臂組合，使得細(xì)胞防御機(jī)制聚焦于癌細(xì)胞。雙特異性抗體還可用于將胞毒劑定位于癌細(xì)胞。這些抗體擁有癌細(xì)胞標(biāo)志物結(jié)合臂及結(jié)合胞毒劑(如肥皂草毒蛋白、抗干擾素-α、長(zhǎng)春花生物堿、蓖麻毒蛋白A鏈、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂?？蓪㈦p特異性抗體制備成全長(zhǎng)抗體或抗體片段(如F(ab)2雙特異性抗體)。用于制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。傳統(tǒng)的全長(zhǎng)雙特異性抗體制備，當(dāng)兩種鏈具有不同的特異性時(shí)，是基于兩對(duì)免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達(dá)(Millstein等，Nature 305:537-539 (1983) )0由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成可能有10種不同抗體分子的混合物,其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。正確分子的純化，其通常通過親和層析步驟進(jìn)行，相當(dāng)麻煩且產(chǎn)物產(chǎn)量低。WO 93/08829 及 Traunecker 等，EMBO J. 10:3655-3659(1991)中公開了類似的流程。按照一種不同的方法，將具有所需的結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。融合優(yōu)選是與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定域融合。優(yōu)選的是，在至少一種融合物中存在包含輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CHl)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物以及，如果需要，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入各別的表達(dá)載體，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比例不等時(shí)可提供最優(yōu)產(chǎn)量的實(shí)施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了很大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈的同比例表達(dá)可導(dǎo)致高產(chǎn)量時(shí)或在該比例沒有特別意義時(shí)，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一個(gè)載體是可能的。在該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，雙特異性抗體由一個(gè)臂上具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個(gè)臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特 異性)構(gòu)成。人們發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)便于將所需雙特異性復(fù)合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開，這是由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個(gè)雙特異性分子中的存在提供了分離的便利途徑。該方法公開于W094/04690。關(guān)于生成雙特異性抗體的其它細(xì)節(jié)參見例如Suresh等，Methods in Enzymology 121:210(1986)。依照美國專利5，731，168中描述的另一種方法，可改造一對(duì)抗體分子之間的界面，從而使得從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收的異二聚體的百分比最大化。優(yōu)選的界面包含抗體恒定域的至少一部分Ch3域。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個(gè)或多個(gè)小氨基酸側(cè)鏈用較大側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)替換。在第二抗體分子的界面上通過用較小氨基酸側(cè)鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)替換大氨基酸側(cè)鏈而產(chǎn)生針對(duì)大側(cè)鏈)的相同或相似大小的補(bǔ)償性“空腔”。這提供了提高異二聚體相對(duì)于其它非期望的終產(chǎn)物諸如同二聚體的產(chǎn)量的機(jī)制。雙特異性抗體包括交聯(lián)或“異源偶聯(lián)”抗體。例如，異源偶聯(lián)物中的一種抗體可與親合素偶聯(lián)，另一種抗體與生物素偶聯(lián)。例如，此類抗體建議用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國專利4，676，980)，和用于治療HIV感染(W0 91/00360、WO 92/200373和EP03089)?？墒褂萌魏伪憷慕宦?lián)方法來制備異源偶聯(lián)抗體。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域眾所周知的，并且連同許多交聯(lián)技術(shù)一起公開于美國專利4，676，980。文獻(xiàn)中還描述了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化學(xué)連接來制備雙特異性抗體。Brennan等，Science 229:81 (1985)描述了通過蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab’)2片段的方法。將這些片段在存在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉的情況下還原，以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產(chǎn)生的Fab’片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼趸郊姿狨?TNB)衍生物。然后將Fab’-TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復(fù)成Fab’ -硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab’ -TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。最近的進(jìn)展使得從大腸桿菌中直接回收Fab’ -SH片段變得更加容易，這些片段可化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。Shalaby等，J. Exp. Med. 175:217-225(1992)描述了生成完全人源化的雙特異性抗體F(ab’)2分子。由大腸桿菌各別分泌每個(gè)Fab’片段，并在體外進(jìn)行定向化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。
還描述了從重組細(xì)胞培養(yǎng)物直接制備和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。(Kostelny等，J.Immunol. 148 (5) : 1547-1553 (1992))。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體的Fab’部分連接?？贵w同二聚體在鉸鏈區(qū)被還原而形成單體，然后重新氧化而形成抗體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。由Hollinger等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)描述的“雙抗體”技術(shù)提供了制備雙特異性抗體片段的替代機(jī)制。該片段包含通過接頭相連的輕鏈可變區(qū)(')和重鏈可變區(qū)(Vh)，所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)。因此，迫使一個(gè)片段上的Vh和\結(jié)構(gòu)域與另一個(gè)片段上的互補(bǔ)\和Vh結(jié)構(gòu)域配對(duì)，由此形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。還報(bào)道了通過使用單鏈Fv(sFv) 二聚體制備雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Gruber等，J.Immunol. 152:5368(1994)。考慮高于2價(jià)的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt等，J.Immunol. 147:60(1991)。
抗體偶聯(lián)物和其它修飾本發(fā)明的抗體任選偶聯(lián)至細(xì)胞毒劑或治療劑。例如，治療劑包括任何可用于治療癌癥的化療劑?；焺┑睦影瘎╊?，諸如噻替哌(thiotepa)和環(huán)磷酰胺(cyclosphosphamide);燒基磺酸酯類，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙唳類，諸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa)；乙撐亞胺類(ethylenimine)和甲基蜜胺類(methylemelamine),包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(trietyIenephosphoramide)、三乙撐硫代憐酉先胺(triethyIenethiophosphaoramide)和三輕甲蜜胺(trimethyIolmelamine);氮芥類，諸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽憐酸胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異憐酸胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamineoxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽留醇(phenesterine)、松龍苯芥(prednimustine)、曲憐胺(trofosfamide)、尿卩密唳氮芥(uracil mustard);硝基脲類，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine);抗生素類,諸如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、力口利車霉素(calicheamicin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線菌素 D(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6_ 二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依達(dá)比星(idambicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素(mitomycin)、霉酌·酸(my cophenol ic acid)、諾加霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培來霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲霉素(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代謝物類，諸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨噪呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate) J票呤類似物，諸如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、6_巰基票呤、硫咪票呤、硫鳥票呤；啼P定類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿唳(doxifIuridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5_FU ;雄激素類，諸如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄焼(mepitiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone);抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);葉酸補(bǔ)充劑，諸如亞葉酸；醋葡內(nèi)酯(aceglatone);醒磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside);氨基酮戊酸(aminolevulinic acid);氛苯口丫口定(amsacrine) ；bestrabucil 匕生群(bisantrene)；依達(dá)曲沙(edatraxate) ；defofamine ;地美可辛(demecolcine);地卩丫醌(diaziquone);依洛尼塞(efornithine);醋酸輕卩比咔唑(elliptinium acetate);依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；輕脲；香燕多糖(Ientinan);氯尼達(dá)明(Ionidamine);米托胍腙(mitoguazone)； 米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌達(dá)醇(mopidamol) ;二胺硝卩丫卩定(nitracrine);噴司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);卩比柔比星(pirarubicin);鬼曰酸(podophyllinicacid) ；2-乙基酸餅；丙卡巴餅(procarbazine) ；PSK&commat ;雷佐生(razoxane);西索菲蘭(sizofirane);錯(cuò)螺胺(spirogermanium);細(xì)交鏈抱菌酮酸(tenuazonic acid);三亞胺醌(triaziquone) ;2，2，，2" _ 三氯三乙胺；烏拉坦(urethan);長(zhǎng)春地辛(vindesine)；達(dá)卡巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine) ;二溴甘露醇(mitobronitol) ;二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol);哌泊溴焼(pipobroman) ；gacytosine ;阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide);噻替哌；類紫杉醇(taxoid)，例如帕立他塞(paclitaxel) (TAXOLO, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)和多西他塞(doxetaxel) (TAXOTEW ，Rhtoe-Poulenc Rorer, Antony, France);苯丁酸氮芥(chlorambucil);吉西他濱(gemcitabine) ;6_硫鳥票呤；巰基票呤；甲氨噪呤；鉬類似物，諸如順鉬和卡鉬；長(zhǎng)春堿(vinblastine)、鉬(platinum);依托泊苷(etoposide) (VP-16)；異環(huán)磷酰胺(ifosfamide);絲裂霉素C (mitomycin C);米托蒽醌(mitoxantrone);長(zhǎng)春新減(vincristine);長(zhǎng)春瑞賓(vinorelbine);諾維本(navelbine);諾安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide);柔紅霉素(daunomycin);氨基蝶呤；希羅達(dá)(xeloda);伊拜膦酸鹽(ibandronate) ;CPT_11 ;拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000;二氟甲基鳥氨酸(DMFO);視黃酸；埃斯波霉素(esperamicins);卡培他濱(capecitabine);及上述任何物質(zhì)的藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。此外，治療劑還包括作用于調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤的作用的抗激素劑，諸如抗雌激素類，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-輕基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、奧那司酮(onapristone)、和托瑞米芬(toremifene) (Fareston);和抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、尼魯米特(nilutamide)、亮丙瑞林(Ieuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin);及上述任何物質(zhì)的藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。本文還設(shè)想了抗體與一個(gè)或多個(gè)小分子毒素(如加利車霉素、美登木素(美國專利5，208，020)、單端孢霉素和CC1065)的偶聯(lián)物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將抗體偶聯(lián)至一個(gè)或多個(gè)美登木素分子(例如約I個(gè)至約10個(gè)美登木素分子每個(gè)抗體分子)。例如可以將美登木素轉(zhuǎn)變成May SS-Me7May SS-Me可以還原成May-SH3并與經(jīng)修飾的抗體反應(yīng)(Chari等，Cancer Research 52:127-131 (1992))以生成美登木素生物堿-抗體偶聯(lián)物?；蛘?，可以將抗體偶聯(lián)至一個(gè)或多個(gè)加利車霉素分子。加利車霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度生成雙鏈DNA斷裂?？捎玫募永嚸顾亟Y(jié)構(gòu)類似物包括但不限于 Y II、α 21、α 31、N-乙酸基-Y II、PSAG 和 Oil (Hinman 等，Cancer Research53:3336-3342(1993)及 Lode 等，Cancer Research 58:2925-2928(1998))。可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、夕卜毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin) A鏈、α-帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolaca Americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋 白(crotin)、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制物、白樹毒素(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、釀霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和單端孢菌毒素(trichothecenes)。參見例如1993年10月28日公開的WO 93/21232。本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋偶聯(lián)有多種放射性同位素的抗體。例子包括mIn、211At、mI、125I、9°Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P和Lu的放射性同位素。在本發(fā)明中，本發(fā)明的抗體可以在即將使用前用放射性核素標(biāo)記，或者作為放射性標(biāo)記的抗體來提供。熟練從業(yè)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到有多種放射性核素和化療細(xì)胞毒劑可通過公知技術(shù)偶聯(lián)至腫瘤特異性抗體并投遞至某部位以特異性破壞腫瘤細(xì)胞和組織(參見例如W. A. Blattler等的美國專利4，542，225，1985年9月17日公告；及Pastan等，1986，Cell，47:641-648)。例如，適合于使用的成像和細(xì)胞毒性試劑包括 125I、123I、mIn (例如 Sumerdon 等，1990，Nucl. Med. Biol.，17:247-254)、和99mTc ;熒光標(biāo)記物，諸如熒光素和羅丹明；化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，諸如螢光素；和用于磁共振成像的順磁性離子(Lauffer 等，1991, Magnetic Resonance in Medicine, 22:339-342)。可以使用在本領(lǐng)域已知的并得到實(shí)踐的方案和技術(shù)用此類試劑標(biāo)記抗體?？梢詮睦鏦enzel 和 Meares, Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, New York,1983 ;Colcer 等，1986,Meth. Enzymol. , 121:802-816 ;&Monoclonal Antibody for CancerDetection and Therapy, Baldwin 等編，Academic Press, 1985, pp. 303-316 中參考放射性標(biāo)記抗體的技術(shù)。釔-90(9°Y)標(biāo)記的單克隆抗體已有記載用于使投遞至腫瘤或癌細(xì)胞和/或組織的劑量最大化，同時(shí)限制對(duì)正常組織的毒性(例如Goodwin和Meares, 1997, CancerSupp I ement，80:2675-2680 )。其它細(xì)胞毒性放射性核素，包括但不限于碘-131 (m I)和錸-186也可用于標(biāo)記本發(fā)明的單克隆抗體。在放射性核素中，釔-90(9°Y)可適合于放射免疫療法，這是由于釔-90 (9°Υ)提供勝過碘-131 (131I)的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榍罢呖蓪?duì)腫瘤投予更高的貝塔能(2. 3MeV比O. 6IMeV),且具有5_10mm的路徑長(zhǎng)度，從而具有更好的殺死靶細(xì)胞及鄰近細(xì)胞的能力，這一點(diǎn)在大體積或顯影不良的腫瘤中是特別有利的。依照要使用的成像模式來選擇所使用的可檢測(cè)/檢測(cè)標(biāo)記物。例如，放射性標(biāo)記物，諸如銦-111 (111In)、锝^細(xì)^^入或碘-口^131〗)可用于平面掃描或單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層照相術(shù)(SPECT)。還有，發(fā)射正電子的標(biāo)記物，諸如氟-19可用于正電子發(fā)射斷層照相術(shù)(PET)。順磁性離子，諸如釓(III)或錳(II)可用于磁共振成像(MRI)。單克隆抗體還可用不透射線的標(biāo)記物標(biāo)記以在注射后通過例如X射線、CATscan、或MRI來顯現(xiàn)癌細(xì)胞。特別地，對(duì)于⑶H3相關(guān)疾病(例如癌癥)，通過對(duì)標(biāo)記物在癌癥內(nèi)的定位，可以確定疾病的擴(kuò)散。例如，表達(dá)CDH3的癌癥內(nèi)存在的和可檢測(cè)的標(biāo)記物的量容許確定要診斷的受試者中癌癥或腫瘤的有無。抗體與細(xì)胞毒劑的偶聯(lián)物的制備可使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑，諸如3-(2-吡啶基二巰基)丙酸N-琥珀酰亞胺酯(srop)、4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己胺-I-羧酸琥珀酰亞胺酯、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞胺二甲酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)疊氮苯甲?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)重氮苯甲?；?己二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1，5- 二氟-2，4- 二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitetta等，Science 238:1098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標(biāo)記的I-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見WO 94/11026。接頭可以是便于在細(xì)胞中釋放細(xì)胞毒性藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩(wěn)定接頭、肽酶敏感接頭、二甲基接頭或含二硫化物接 頭(Charm 等，Cancer Research 52:127-131(1992))?；蛘?，可例如通過重組技術(shù)或肽合成來制備包含抗體和細(xì)胞毒劑的融合蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將抗體與“受體”(諸如鏈霉親合素)偶聯(lián)，用于腫瘤的預(yù)定位，其中對(duì)患者施用抗體-受體偶聯(lián)物，隨后使用清除劑從循環(huán)中除去未結(jié)合的偶聯(lián)物，然后施用與細(xì)胞毒劑(如放射性核苷酸)偶聯(lián)的“配體”(例如親合素)。可以將本發(fā)明的抗體與前體藥物活化酶偶聯(lián)，所述前體藥物活化酶將前體藥物(例如肽基化療劑，參見WO 81/01145)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚钥拱┧?。參見例如WO 88/07378和美國專利 4，975，278。此類偶聯(lián)物的酶成分包括任何這樣的酶，其能夠以一定的方式作用于前體藥物從而將其轉(zhuǎn)變?yōu)楦谢钚缘?、具有?xì)胞毒性的形式。可用于本發(fā)明方法的酶包括但不限于可將含磷酸鹽/酯的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的堿性磷酸酶；可將含硫酸鹽/酯的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的芳基硫酸酯酶；可將無毒的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)榭拱┧幏蜞奏さ陌奏っ摪泵?；可將含肽的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的蛋白酶，諸如沙雷氏菌蛋白酶(serratia protease)、嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)、枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、羧肽酶和組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B和L);可用于轉(zhuǎn)化含D-氨基酸替代物的前體藥物的D-丙氨酰羧肽酶；可將糖基化前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的碳水化合物切割酶，諸如13-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶；可用于將13-內(nèi)酰胺衍生藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的13-內(nèi)酰胺酶；及可用于將氨基氮分別被苯氧乙酰基或苯乙?；苌乃幬镛D(zhuǎn)變成游離藥物的青霉素酰胺酶，諸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶?；蛘撸墒褂镁哂忻富钚缘目贵w，本領(lǐng)域也稱作“抗體酶”，將本發(fā)明的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x活性藥物(參見例如Massey, Nature328:457-458 (1987))?？扇绫疚乃鲋苽淇贵w-抗體酶偶聯(lián)物，用于將抗體酶遞送至腫瘤細(xì)胞群?？赏ㄟ^本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)將本發(fā)明的酶與抗體共價(jià)結(jié)合，諸如使用上文所討論的異雙功能交聯(lián)劑。或者，可使用本領(lǐng)域眾所周知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建這樣的融合蛋白，其包含與本發(fā)明酶的至少功能活性部分連接的本發(fā)明抗體的至少抗原結(jié)合區(qū)(參見例如Neuberger 等,Nature 312:604-608 (1984))。本文還涵蓋抗體的其它修飾。例如，可將抗體與多種非蛋白質(zhì)性聚合物中的一種，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物連接。本文公開的抗體還可配制成脂質(zhì)體?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法來制備包含抗體的月旨質(zhì)體，諸如 Epstein 等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985) ; Hwang 等,Proc. Natl.Acad. Sci. USA 77:4030(1980);美國專利 4，485，045 和 4，544，545;及 1997 年 10 月 23 日公布的WO 97/38731中描述的。美國專利5，013，556中公開了循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)的脂質(zhì)體。特別有用的脂質(zhì)體可用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物通過反相蒸發(fā)法生成。將脂質(zhì)體擠過具有設(shè)定孔徑的濾器，以產(chǎn)生具有所需直徑的脂質(zhì)體?？扇鏜artin等，J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)中所述，將本發(fā)明抗體的Fab’片段經(jīng)二硫化物交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)。任選在脂質(zhì)體中包含化療劑。參見 Gabizon 等，J. A National Cancer Inst. 81 (19) : 1484 (1989)。 涵蓋本文所述抗體的氨基酸序列修飾。例如，可以改進(jìn)抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性。通過將適當(dāng)?shù)暮塑账岣淖円肟贵w編碼核酸或者通過肽合成來制備抗體的氨基酸序列變體。此類修飾包括例如抗體氨基酸序列中的殘基刪除和/或插入和/或替代。只要最終的構(gòu)建物具有所需特性，可進(jìn)行刪除、插入和替代的任何組合以獲得最終的構(gòu)建物。氨基酸變化還可改變抗體的翻譯后加工，諸如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置。一種可用于鑒定抗體中作為優(yōu)選誘變位置的某些殘基或區(qū)域的方法稱作“丙氨酸掃描突變”，如 Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)所述。這里，鑒定一個(gè)或一組靶殘基(例如帶電荷的殘基，諸如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)，并用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影響氨基酸與抗原的相互作用。然后通過在或?qū)μ娲稽c(diǎn)引入更多或其它變體，推敲那些顯示出對(duì)替代的功能敏感性的氨基酸位置。因此，雖然引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先決定的，但是突變本身的性質(zhì)不需要預(yù)先決定。例如，為了分析在指定位點(diǎn)處的突變的后果，在靶密碼子或區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描誘變或隨機(jī)突變，并從所表達(dá)的抗體變體中篩選所需活性。氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-末端的融合，長(zhǎng)度范圍從一個(gè)殘基至包含上百或更多殘基的多肽，還包括單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰殘基的抗體或與細(xì)胞毒性多肽融合的抗體?？贵w分子的其它插入變體包括在抗體的N-或C-末端融合酶或提高抗體血清半衰期的多肽。另一類變體是氨基酸替代變體。這些變體在抗體分子中有至少一個(gè)氨基酸殘基被替換成不同的殘基。抗體中最有興趣進(jìn)行替代誘變的位點(diǎn)包括高變區(qū)，但FR改變也在考慮之內(nèi)。通過選擇替代來實(shí)現(xiàn)對(duì)抗體生物學(xué)特性的實(shí)質(zhì)性修飾，這些替代在保持(a)被替代區(qū)域的多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如作為折疊片或螺旋構(gòu)象，(b)分子的靶位點(diǎn)處的電荷或疏水性，或(C)側(cè)鏈的大小等方面的效果上顯著不同。根據(jù)共同的側(cè)鏈特性，將天然存在殘基如下分組(I)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie ；(2)中性親水性的Cys、Ser、Thr ;(3)酸性的Asp、Glu ;
(4)堿性的:Asn、Gin、His、Lys、Arg ;(5)影響鏈取向的殘基Gly、Pro ;和(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。非保守替代將需要用這些類別之一中的成員交換另一類別的成員。對(duì)任何不涉及抗體正確構(gòu)象的維持的半胱氨酸殘基也可加以替代，通常替換成絲氨酸，以改善分子的氧化穩(wěn)定性和防止異常交聯(lián)。相反，可向抗體中添加半胱氨酸鍵以改善其穩(wěn)定性(特別是當(dāng)抗體是片段諸如Fv片段時(shí))。特別優(yōu)選的一類替代變體牽涉替代親本抗體(如人源化或人抗體)的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基。通常，選擇用于進(jìn)一步開發(fā)的所得變體相對(duì)于產(chǎn)生它們的親本抗體將具有改進(jìn)的生物學(xué)特性。產(chǎn)生此類替代變體的一種便利方法是使用噬菌體展示的親和力成熟。簡(jiǎn)而言之，將數(shù)個(gè)高變區(qū)位點(diǎn)(例如6-7個(gè)位點(diǎn))突變，產(chǎn)生各個(gè)位點(diǎn)上所有可能的氨基酸替 代。將如此產(chǎn)生的抗體變體以單價(jià)形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，作為與各個(gè)顆粒內(nèi)包裝的M13基因III產(chǎn)物的融合物。然后如本文所公開的對(duì)噬菌體展示的變體篩選其生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區(qū)位點(diǎn)，可進(jìn)行丙氨酸掃描誘變以鑒定對(duì)抗原結(jié)合具有重要貢獻(xiàn)的高變區(qū)殘基?；蛘?另外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，以鑒定抗體和抗原之間的接觸點(diǎn)可能是有益的。所述接觸殘基及鄰近殘基是依照本文詳述的技術(shù)進(jìn)行替代的候選者。產(chǎn)生這樣的變體后，如本文所述對(duì)該組變體進(jìn)行篩選，可選擇在一種或多種相關(guān)測(cè)定法中具有優(yōu)良特性的抗體進(jìn)行進(jìn)一步的開發(fā)。編碼抗體氨基酸序列變體的核酸分子可通過本領(lǐng)域已知的多種方法制備。這些方法包括但不限于從天然來源分離(在天然存在氨基酸序列變體的場(chǎng)合)，或者通過對(duì)早先制備的變體或非變體型抗體進(jìn)行寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變、PCR誘變和盒式誘變來制備。可以修飾本發(fā)明中使用的抗體以改善效應(yīng)器功能，以便例如增強(qiáng)抗體的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。這可通過在抗體Fe區(qū)中引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代來實(shí)現(xiàn)?；蛘?另外，可在Fe區(qū)中引入半胱氨酸殘基，從而容許該區(qū)中形成鏈間二硫鍵。如此產(chǎn)生的同二聚體抗體可具有改善的內(nèi)化能力和/或提高的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒性(ADCC)。參見Caron等，J. Exp.Med. 176:1191-1195(1992)和 Shopes, B. , J. Immunol. 148:2918-2922(1992)。具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性的同二聚體抗體還可使用如Wolff等，Cancer Research53:2560-2565(1993)中描述的異雙功能交聯(lián)劑來制備。或者，可工程改造出這樣的抗體，其具有雙重Fe區(qū)，由此可具有增強(qiáng)的補(bǔ)體溶解和ADCC能力。參見Stevenson等，Anti-CancerDrug Design 3:219-230(1989)。為了提高抗體的血清半衰期，可如例如美國專利5，739，277中所述將補(bǔ)救受體結(jié)合表位摻入抗體(尤其是抗體片段)。在用于本文時(shí)，術(shù)語“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”指IgG分子(如IgGp IgG2, IgG3或IgG4) Fe區(qū)中負(fù)責(zé)提高IgG分子體內(nèi)血清半衰期的表位。診斷與CDH3有關(guān)的疾病本發(fā)明的抗體可用作診斷與CDH3有關(guān)的疾病(如癌癥)的標(biāo)志物。更具體地，可通過用本發(fā)明的抗體檢測(cè)源自受試者的樣品中的⑶H3多肽來診斷與CDH3有關(guān)的疾病。據(jù)此，本發(fā)明提供通過用本發(fā)明的抗體檢測(cè)源自受試者的樣品中的CDH3多肽來診斷受試者中與CDH3有關(guān)的疾病或發(fā)生所述CDH3的傾向的方法。該方法包括下述步驟(a)使來自受試者的樣品或標(biāo)本接觸本發(fā)明的抗體或其片段；(b)檢測(cè)樣品或標(biāo)本中的CDH3多肽；并(c)基于CDH3蛋白與對(duì)照相比的相對(duì)豐度來判斷受試者是否患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生疾病。在一個(gè)典型的實(shí)施方案中，與CDH3有關(guān)的疾病是癌癥，更具體地說，胰腺、肺、結(jié)腸、前列腺、乳腺、胃或肝癌?；蛘?，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可用于活體中癌癥的檢測(cè)或成像。更具體地，本發(fā)明提供癌癥檢測(cè)或成像的方法，其包括下述步驟 (I)給受試者施用本發(fā)明的抗體或其片段；(2)檢測(cè)活體中所述抗體或片段的累積或定位；并(3)確定患者中抗體或其結(jié)合片段的位置?；蛘?，依照本發(fā)明，可檢測(cè)受試者中的癌細(xì)胞或組織。例如，本發(fā)明提供用于檢測(cè)受試者中表達(dá)CDH3的癌癥的方法，包括給受試者施用本發(fā)明的抗體或其片段，容許所述抗體或片段特異性結(jié)合受試者細(xì)胞或組織中的CDH3多肽；使細(xì)胞或組織中結(jié)合的抗體可視化；并將結(jié)合于所述細(xì)胞或組織的所述抗體的水平與正常對(duì)照細(xì)胞或組織比較，其中結(jié)合于受試者的細(xì)胞或組織的抗體的水平相當(dāng)于正常對(duì)照細(xì)胞或組織升高指示受試者中有癌癥。優(yōu)選地，為了追蹤施用入活體的抗體，可以用可檢測(cè)分子標(biāo)記抗體。例如，可以追蹤用熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、或放射性同位素標(biāo)記的抗體的體內(nèi)行為。用此類分子標(biāo)記抗體的方法是本領(lǐng)域公知的?？梢杂^察(例如使用內(nèi)窺鏡或腹腔鏡)用熒光物質(zhì)或發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的抗體。在使用放射性同位素時(shí),抗體的定位可通過放射性同位素的放射性示蹤來成像。在本發(fā)明中,本發(fā)明的抗體的體內(nèi)定位或累積證明癌細(xì)胞的存在。相似的方法已經(jīng)被用于其它抗體，而從業(yè)人員會(huì)知道適合于身體內(nèi)結(jié)合的抗體或片段的位置成像的多種方法。作為非限制性指導(dǎo)，施用約10-1000微克(meg.)、優(yōu)選約50-500mcg、更優(yōu)選約100-300mcg、更優(yōu)選約200_300mcg純化的抗體。例如，人的可應(yīng)用劑量包括約100_200mcg/kg體重或350-700mg/m2體表面積。用于診斷與CDH3有關(guān)的疾病的試劑盒本發(fā)明提供用于與CDH3有關(guān)的疾病的診斷的試劑盒。具體而言，試劑盒包括本發(fā)明的抗體或其片段作為CDH3多肽的檢測(cè)試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的試劑盒的抗體可以用熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、或放射性同位素標(biāo)記。標(biāo)記抗體和檢測(cè)帶標(biāo)記抗體的方法是本領(lǐng)域公知的，本發(fā)明可采用任何標(biāo)記物和方法。另外，試劑盒可包括陽性和陰性對(duì)照試劑，和用于檢測(cè)本發(fā)明的抗體的第二抗體。例如，自健康正常受試者或非癌組織獲得的組織樣品可充當(dāng)有用的陰性對(duì)照試劑。本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包括從商業(yè)和用戶立場(chǎng)看可取的其它材料，包括緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、和印有使用說明的包裝插頁(例如書面的、磁帶、CD-ROM等)。這些試劑和此類可以裝在帶有標(biāo)簽的容器中。合適的容器包括瓶、管形瓶、和試管。容器可以由各種材料制成，諸如玻璃或塑料。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供用于要診斷的受試者內(nèi)癌癥的檢測(cè)、成像或治療的試劑盒，其包括本發(fā)明的抗體。或者，本發(fā)明還提供包含本發(fā)明抗體的診斷試劑，該試劑用于施用到要診斷與CDH3有關(guān)的疾病(包括癌癥)的受試者體內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以用放射性同位素標(biāo)記。例如，本發(fā)明的試劑盒可以含有本發(fā)明的抗體，其經(jīng)過螯合劑和放射性物質(zhì)的修飾。MX-DOPA是用于修飾抗體的優(yōu)選螯合劑。同時(shí)，銦-111 (111In)可用作用于生物成像的示蹤劑。或者，為了與CDH3有關(guān)的疾病的放射免疫療法，可以用貝塔核素例如釔-90 (9°Y)標(biāo)記抗體。在本發(fā)明中，也可以以其鹽或溶液的形式提供銦-111 (111In)或釔-90ΓΥ)。銦-111 (111In)或釔-90 (90Y)的合適的鹽是氯化物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與CDH3有關(guān)的疾病是胰腺、肺、結(jié)腸、前列腺、乳腺、胃或肝癌。治療用涂下面描述的是使用本發(fā)明的抗體來治療和/或預(yù)防與CDH3有關(guān)的疾病，或抑制表達(dá)CDH3的細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法和藥物組合物。在典型的實(shí)施方案中，與CDH3有關(guān)的疾病是 癌癥，包括但不限于胰腺、肺、結(jié)腸、前列腺、乳腺、胃或肝癌細(xì)胞。具體而言，依照本發(fā)明在受試者中治療和/或預(yù)防與CDH3有關(guān)的疾病，或抑制表達(dá)CDH3的細(xì)胞的方法包括以有效量給受試者施用本發(fā)明的抗體或片段。本發(fā)明中的受試者可以是動(dòng)物，包括哺乳類和鳥類動(dòng)物。例如，哺乳動(dòng)物可以包括人、小鼠、大鼠、猴、家兔、和犬。本文所述抗體或其片段能特異性結(jié)合CDH3多肽，所以當(dāng)給受試者施用抗體或其片段時(shí)，它結(jié)合受試者中的CDH3多肽，而且可以遏制表達(dá)CDH3的細(xì)胞如癌性細(xì)胞的生長(zhǎng)。或者，當(dāng)抗體或其片段可偶聯(lián)有治療性模塊并施用于受試者時(shí)，它被投遞至受試者中表達(dá)⑶Η3多肽的區(qū)域(即患病區(qū)域)，從而治療性模塊可以被選擇性地投遞到患病區(qū)域并作用于它。這樣的治療性模塊可以是已知的或?qū)?huì)被開發(fā)的對(duì)癌癥具有治療功效的任何治療劑，包括但不限于放射性同位素標(biāo)記物和化療劑?？筛鶕?jù)多種因素來選擇可用作治療劑的放射性同位素標(biāo)記物，這些因素包括貝塔射線能及其發(fā)射效率、發(fā)射的伽馬射線的有無、其能量和發(fā)射效率、物理半衰期、和標(biāo)記方法。一般地，可使用基于釔(諸如9°Υ)和碘(諸如125I和131I)的放射性同位素標(biāo)記物?；焺┛梢允且阎幕?qū)?huì)被開發(fā)的用于治療癌癥的任何試劑，包括但不限于甲氨蝶呤、泰素、巰嘌呤、硫鳥嘌呤、順鉬、卡鉬、絲裂霉素、博來霉素、多柔比星、伊達(dá)比星、柔紅霉素、放線菌素D、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞濱、帕立他塞、和多西他賽。本發(fā)明的抗體或其片段能選擇性結(jié)合CDH3多肽且不結(jié)合正常細(xì)胞，所以能有效避免由抗體或其片段或者放射性同位素或化療劑引起的副作用，因此可以有高的治療功效?？梢砸杂行е委熁蝾A(yù)防CDH3相關(guān)疾病的劑量將本文所述抗體或其片段施用于受試者。有效劑量指抗體或其片段足以在所治療受試者中產(chǎn)生有益健康的好處的量。下文描述了藥物組合物含有本發(fā)明抗體或其片段時(shí)可采用的制劑和施用方法。要進(jìn)一步理解，在必要或想要時(shí)，可施用不同單克隆抗體的雞尾酒(cocktail)，諸如本文中描述的具體的單克隆抗體或其片段的混合物，以緩解與CDH3有關(guān)的疾病。確實(shí)，在雞尾酒中使用單克隆抗體或其片段的混合物來靶定疾病細(xì)胞上的數(shù)種抗原或不同表位是一種有利的辦法，特別是用于預(yù)防由于腫瘤細(xì)胞和/或癌細(xì)胞因抗原之一的下調(diào)所致的逃逸(evasion)。
依照本發(fā)明使用的藥物組合物可以以常規(guī)方式使用一種或多種藥學(xué)可接受載體或賦形劑來配制?；颍景l(fā)明提供用于治療或預(yù)防與CDH3有關(guān)的疾病，或抑制表達(dá)CDH3的細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物組合物，其包含有效量的本發(fā)明的抗體或其片段，以及可藥用的擔(dān)載體或賦形劑。抗體或其片段可配制成供通過注射進(jìn)行的胃腸外施用(即靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi))，經(jīng)由例如推注注射或連續(xù)輸注。供注射用的配制劑可以以單位劑量形式與添加的防腐劑一起在例如安瓿或多劑量容器中提供。組合物可采取油性或水性媒介中的懸浮液、溶液、或乳狀液等形式，而且可含有配方劑，諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，抗體可以是凍干粉形式，以便于在使用前用合適的媒介例如無菌無熱原水構(gòu)建。抗體或片段、或其偶聯(lián)的治療性模塊的毒性和治療功效，可按照標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)規(guī)程在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物(例如用于測(cè)定LD50 (使群體的50%致死的劑量)和ED50 (在群體的50%中有治療效果的劑量))中確定。毒性和治療性效果之間的劑量之比為治療指數(shù)，其可表述為比值LD/ED。 自細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于確定供人體使用的劑量范圍。所述抗體的劑量?jī)?yōu)選在包括ED50在內(nèi)的循環(huán)血漿濃度范圍之內(nèi)，毒性很小或沒有毒性。根據(jù)所采用的劑量形式、所利用的施用路徑及所偶聯(lián)的治療性模塊的類型和量，劑量可以在此范圍內(nèi)變化。對(duì)于本發(fā)明的抗體或其片段而言，有效劑量首先可以根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定來估算?？梢栽趧?dòng)物模型中配制實(shí)現(xiàn)包括IC50 (即測(cè)試抗體實(shí)現(xiàn)癥狀抑制最大值半數(shù)的濃度)在內(nèi)的循環(huán)血漿濃度范圍的劑量，如在細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)定的?？梢岳眠@樣的信息更準(zhǔn)確地確定在人體中有用的劑量。血漿中的水平可通過例如高效液相層析來測(cè)量。根據(jù)受試者的狀況和年齡和/或施用路徑，本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇本發(fā)明藥物組合物的適宜劑量。例如，以如下的量施用本發(fā)明的藥物組合物，使得在I天中依照本發(fā)明的抗體被施用于受試者的量為約3至約15mcg每kg受試者體重,優(yōu)選約10至約15mcg每kg受試者體重?？梢钥紤]受試者的狀況和年齡、施用路徑、及對(duì)藥物組合物的響應(yīng)來選擇施用間隔和時(shí)間。例如，藥物組合物可以施用于受試者I至5次，優(yōu)選I次I天，持續(xù)5至10天。在另一個(gè)方面，當(dāng)胃腸外施用包含放射性同位素標(biāo)記的抗體的組合物時(shí)，單個(gè)成人一次施用劑量為 O. lmCi/kg 至 I. OmCi/kg,優(yōu)選 O. lmCi/kg 至 O. 5mCi/kg,更優(yōu)選 O. 4mCi/
kg ο藥物組合物可系統(tǒng)地或局部地施用。優(yōu)選以靶向投遞方式施用，以便將活性成分投遞至患病部位。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物與一種或一組化療劑一起用于治療或預(yù)防癌癥，所述化療劑包括但不限于甲氨蝶呤、泰素、巰嘌呤、硫鳥嘌呤、順鉬、卡鉬、絲裂霉素、博來霉素、多柔比星、伊達(dá)比星、柔紅霉素、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞濱、帕立他塞、和多西他賽。關(guān)于放射療法，根據(jù)要治療的癌癥的類型，可使用任何放射療法方案。例如，但非限制，可施用X射線照射。也可施用發(fā)射伽馬射線的放射性同位素，諸如鐳、鈷、和其它的元素的放射性同位素以暴露組織。在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用化學(xué)療法或放射療法，優(yōu)選在使用含有本發(fā)明抗體的方法和組合物之后至少I小時(shí)、5小時(shí)、12小時(shí)、I天、I周、I個(gè)月、更優(yōu)選幾個(gè)月(例如長(zhǎng)至3個(gè)月)。在使用依照本發(fā)明的方法和組合物的治療之前、同時(shí)、或之后施用的化學(xué)療法或放射療法可通過本領(lǐng)域已知的任何方法來施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供本發(fā)明的抗體在制造用于治療或預(yù)防與CDH3有關(guān)的疾病的藥物組合物中的用途。特別地，本發(fā)明進(jìn)一步提供放射性標(biāo)記的本發(fā)明抗體在制造用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物中的用途?；蛘撸景l(fā)明進(jìn)一步提供供治療或預(yù)防與CDH3有關(guān)的疾病用的本發(fā)明抗體。特別地，還提供供癌癥放射性免疫療法中使用的放射性標(biāo)記的本發(fā)明抗體?；蛘?，本發(fā)明進(jìn)一步提供制造用于治療或預(yù)防與CDH3有關(guān)的疾病的藥物組合物的方法或工藝，其中該方法或工藝包括將作為活性組分的本發(fā)明抗體與藥學(xué)或生理學(xué)可接受的擔(dān)載體一起配制的步驟。特別地，本發(fā)明進(jìn)一步提供制造用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物的方法或工藝，其中該方法或工藝包括將作為活性組分的放射性標(biāo)記的本發(fā)明抗體與藥學(xué)或生理學(xué)可接受的擔(dān)載體一起配制的步驟。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供制造用于治療或預(yù)防與CDH3有關(guān)的疾病的藥物組合物的方法或工藝，其中該方法或工藝包括將活性組分與藥學(xué)或生理學(xué)可接受的擔(dān)載體混合的步驟，其中所述活性組分是本發(fā)明的抗體。特別地，本發(fā)明進(jìn)一步提供制造用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物的方法或工藝，其中該方法或工藝包括將放射性標(biāo)記的本發(fā)明抗體與藥學(xué)或生理學(xué)可接受的擔(dān)載體混合的步驟。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于要診斷的受試者體內(nèi)癌癥的生物成像或免疫閃爍成像術(shù)的本發(fā)明抗體。或者，本發(fā)明提供本發(fā)明抗體在制造用于受試者體內(nèi)癌癥的生物成像或免疫閃爍成像術(shù)的診斷劑中的用途。本發(fā)明進(jìn)一步提供制造用于受試者體內(nèi)癌癥的生物成像或免疫閃爍成像術(shù)的診斷劑的方法或工藝，其中該方法或工藝包括將本發(fā)明的抗體與藥學(xué)或生理學(xué)可接受的擔(dān)載體混合的步驟。
實(shí)施例下面，基于實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明。材料和方法抗體牛成從來源于癌細(xì)胞的cDNA池?cái)U(kuò)增CDH3基因編碼的胞外域(SEQ ID NO :83)。將產(chǎn)物克隆入pcDNA3. I (Invitrogen, CA)。為了生成⑶H3特異性抗體,每?jī)芍芙o小鼠皮下免疫接種域表達(dá)載體(17. 5 μ g/次注射)，持續(xù)一個(gè)月。確認(rèn)抗血清的滴度后，自小鼠提取脾細(xì)胞并與骨髓瘤細(xì)胞融合以制備雜交瘤。篩選能產(chǎn)生結(jié)合癌細(xì)胞表面上的天然CDH3抗原的雜交瘤。通過篩選，確認(rèn)雜交瘤克隆#3、克隆#4、克隆#5及克隆#6以高水平生成抗原特異性抗體,因此選擇了這些雜交瘤來生成抗體供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)用。將雜交瘤克隆#3、克隆#4、克隆#5及克隆#6腹膜內(nèi)注射給小鼠。2至3周后回收腹水。使用蛋白A柱(GE Healthcare,NJ)自腹水純化抗體。這里，也用克隆#3、克隆#4、克隆#5和克隆#6來指代抗體。細(xì)胞培養(yǎng)使用了人非小細(xì)胞肺癌系H13 7 3進(jìn)行體內(nèi)治療研究，因?yàn)樗淮_認(rèn)表達(dá)CDH3多妝。H1373購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassasm，VA)，而且在補(bǔ)充有10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/鏈霉素的RPMI中于37° C在5%C02的增濕氣氛中維持。放射件標(biāo)記對(duì)于由雜交瘤克隆#3、克隆#4、克隆#5和克隆#6生成的抗⑶H3小鼠單克隆抗體，以及對(duì)照抗體正常小鼠 IgGl (Nordic immunological laboratories, Tiburg，The Netherlands)，用釔-90 (9°Y)標(biāo)記。藉由雙功能金屬離子螯合劑p_SCN-Bn_DTPA或p-SCN-Bn-CHX-A〃-DTPA (Macrocyclics, Dallas, TX, USA)用 9°Y 標(biāo)記抗體。在二甲基甲酰胺中分別以1:5的摩爾比將一毫克抗體與該螯合劑綴合。于37° C溫育20小時(shí)后，使用Biospin 柱 6 (Bio-Rad,Tokyo, Japan)純化抗體-螯合劑復(fù)合物。將 90YCl3 (QSA Global,Brauschweig, Germany)與O. 25M乙酸(pH 5. 5) 一起于室溫平行預(yù)溫育5分鐘。為了獲得90Y標(biāo)記的抗體，分別將抗體-螯合劑復(fù)合物與經(jīng)預(yù)溫育的9°YC13溶液一起于37° C溫育I小時(shí)。使用Biospin柱6依照制造商的用法說明純化經(jīng)標(biāo)記的抗體。在標(biāo)記過程期間，沒有觀察到這些抗體的降解。
異種移植模型依照群馬大學(xué)動(dòng)物使用和動(dòng)物委員會(huì)的規(guī)定實(shí)施動(dòng)物照看和處理。將100微升H1373細(xì)胞懸浮液(IxlO7細(xì)胞)皮下接種入雌性3-5周齡裸鼠(Charles RiverLaboratories Japan Inc. Yokohama, Japan)的右脅。飼養(yǎng)這些小鼠數(shù)周以形成腫瘤。自攜帶腫瘤的小鼠分離建立的腫瘤，并切割成邊長(zhǎng)2mm的立方體組織碎塊。將這些碎塊依次移植入裸鼠。移植后，飼養(yǎng)這些小鼠直至平均腫瘤體積達(dá)到100mm3。放療將異種移植小鼠隨機(jī)指派至十個(gè)不同處理組中。如上所述制備9°Y標(biāo)記的抗體(4-10mCi/mg)。給小鼠靜脈內(nèi)注射9°Y標(biāo)記的或非標(biāo)記的克隆#3、克隆#4、克隆#5或克隆#6。注射9°Υ標(biāo)記的正常小鼠IgGl作為對(duì)照。將所注射抗體的放射性調(diào)整至100微Ci每只動(dòng)物。在注射后的5周時(shí)間里監(jiān)測(cè)經(jīng)處理的異種移植物小鼠的體重和腫瘤體積。使用下面的公式計(jì)算腫瘤體積(mm3):(最短的直徑)2x(最長(zhǎng)的直徑)x0.5。還原性SDS-PAGE將每5 μ g 抗-CDH3 抗體與含有 4%SDS、125mM Tris-HCl (pH6. 8) ,20% 甘油、0. 04%溴酚藍(lán)及10%巰基乙醇的SDS緩沖液混合。加熱后，將混合物施加到4-20%梯度SDS-PAGE凝膠上。然后將凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250 (CBB)染色，并用10%甲醇和7%乙酸脫色。用掃描儀獲取凝膠圖像。V區(qū)氨基酸序列的分析使用RNeasy迷你試劑盒(QIAGEN)自雜交瘤克隆#3、克隆#4和克隆#5提取總RNA。使用 Superscript II 逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)自各總 RNA 合成 cDNA。使用 NovaTaq DNA 聚合酶(Novagen)和小鼠Ig引物集(Novagen)擴(kuò)增編碼單克隆抗體可變區(qū)的多核苷酸。用于擴(kuò)增的引物如下MuIgVH5，-B;5，-GGGAATTCATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTT-3，(SEQ ID NO:84)用作重鏈5’引物；MuIg kappa VL5’-D (下列引物的混合物)；5，-ACTAGTCGACATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT-3，(SEQ ID NO:85)和5，-ACTAGTCGACATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG-3’ (SEQ ID NO:86)用作輕鏈 5’ 引物，
MuIgGVH3，_2;5，-CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG-3，(SEQ ID NO:87)用作重鏈5’引物，以及MuIg kappa VL3’-I; 5’-CCCMGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3’ (SEQ ID NO:88)用作輕鏈3’引物。將PCR產(chǎn)物克隆到pCR2. I-TOPO(Invitrogen)中。將插入?yún)^(qū)測(cè)序并確定了克隆#3、克隆M和克隆#5的可變區(qū)(除信號(hào)序列外)的核酸序列。以下面的符號(hào)表示引物序列中的不同核苷酸；B代表C、G或T，D代表A、G或T，H代表A, C或T，I代表肌苷酸，K代表G或T、M代表A或C，R代表A或G，S代表C或G，V代表A、C或G，W代表A或T，Y代表C或T。益果
為了評(píng)估CDH3靶向放射免疫療法的效力，抗-CDH3抗體用發(fā)射β射線的同位素90Y(tl/2=64. I小時(shí))放射標(biāo)記后，通過靜脈注射施用給荷腫瘤裸小鼠。用釔-90標(biāo)記的克隆#3、#4、和#6處理的腫瘤的生長(zhǎng)速率被來自這些抗體上綴合的釔-90的放射所顯著降低(圖I)。尤其是在觀察過程中，釔90-標(biāo)記的克隆#3和克隆#6在H1373異種移植小鼠中強(qiáng)烈阻遏了腫瘤生長(zhǎng)。另一方面，9°Y標(biāo)記的對(duì)照抗體對(duì)腫瘤生長(zhǎng)未顯示出影響。因此，9°Υ標(biāo)記的抗體的治療效果似乎依賴于其對(duì)腫瘤細(xì)胞表面上表達(dá)的CDH3多肽的親和力。任何接受抗體處理的小鼠的體重都沒有顯著降低(數(shù)據(jù)未顯示)。與釔-90綴合的抗-⑶Η3抗體克隆#3、克隆#4和克隆#6對(duì)腫瘤發(fā)揮出顯著的治療效果。因此，CDH3可能是引人注意的癌癥治療靶標(biāo)，而抗CDH3抗體可能作為新的腫瘤治
療工具可供使用。小鼠單克隆抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)的氨基酸序列確定如下克隆#3，H鏈可變區(qū)(除信號(hào)序列外)QVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGYTFTSFWIHWVKQRPMQGLEWIGNIDPSDSETHYNQYFKDRATLTVDRSSSTAYMHLTSLTSEDSAVYYCARGGTGFSSWGQGTLVTVSA(SEQ ID N0:4)(由 SEQ ID NO:3 所示的核酸序列編碼)；克隆#3，L鏈可變區(qū)(除信號(hào)序列外)DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDIDSYLSWFQQKPGKSPKTLIHRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO: 12)(由 SEQ ID NO: 11所示的核酸序列編碼)；克隆#4，H鏈可變區(qū)(除信號(hào)序列外)LVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKTSGYTFTSYWMHWIKQRPIQGLEWIGNIDPSDSETHYNQNFNDRATFTVDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGGTGFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:20)(由 SEQ ID NO: 19所示的核酸序列編碼)；克隆#4，L鏈可變區(qū)(除信號(hào)序列外)DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINNYLGWFQQKPGKSPKTLIHRTDRLIEGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDVGTYYCLQYDEFPRMFGGGTKLEIK(SEQ ID NO: 28)(由 SEQ ID NO: 27所示的核酸序列編碼)；克隆#5, H鏈可變區(qū)(除信號(hào)序列外)LVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPIQGLEWIGNIDPSDSETHYNQKFNDRARLTVDKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCARGGTGFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO :36)(由 SEQ ID NO :35所示的核酸序列編碼)；和克隆#5, L鏈可變區(qū)(除信號(hào)序列外)DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINNYLGWFQQKPGKSPKTLIHRTDRLIEGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDVGTYYCLQYDEFPRMFGGGTKLDIK(SEQ ID NO:44)(由 SEQ ID NO:43所示的核酸
序列編碼)。按照Kabat定義確定的抗體⑶R序列如下所示克隆#3，SFWIH(SEQ ID NO:6)(由SEQ ID NO: 5所示的核酸序列編碼)作為VH CDRl, NIDPSDSETHYNQYFKD (SEQ ID NO:8)(由 SEQ ID NO: 7 所示的核酸序列編碼)作為VH CDR2，和GGTGFSS (SEQ ID NO: 10)(由SEQID NO:9所示的核酸序列編碼)作為VH CDR3, KASQDIDSYLS (SEQ ID NO: 14)(由 SEQ ID NO: 13 所示的核酸序列編碼)作為 VLCDRl, RANRLVD(SEQID NO: 16)(由 SEQ ID NO: 15 所示的核酸序列編碼)作為 VL CDR2，和LQYDEFPRT(SEQ ID NO: 18)(由 SEQ ID NO: 17 所示的核酸序列編碼)作為 VL CDR3;克隆#4，SYWMH(SEQ ID N0:22)(由SEQ ID NO:21所示的核酸序列編碼)作為VH CDRl, NIDPSDSETHYNQNFND (SEQ ID NO: 24)(由 SEQ IDN0:23 所示的核酸序列編碼)作為VH CDR2，和GGTGFAY(SEQ ID NO:26)(由SEQ ID NO: 25所示的核酸序列編碼)作為VH CDR3，KASQDINNYLG(SEQ ID N0:30)(由 SEQ ID NO:29 所示的核酸序列編碼)作為 VLCDRl，RTDRLIE(SEQ ID N0:32)(由 SEQ ID NO:31 所示的核酸序列編碼)作為 VLCDR2，和LQYDEFPRM(SEQ ID NO:34)(由 SEQ ID NO:33 所示的核酸序列編碼)作為 VL CDR3;，和克隆#5，SYWMH(SEQ ID N0:38)(由SEQ ID NO:37所示的核酸序列編碼)作為VH CDR1, NIDPSDSETHYNQKFNDRA(SEQ ID NO:40)(由 SEQ IDN0:39 所示的核酸序列編碼)作為VH CDR2，和GGTGFAY (SEQ ID NO: 42)(由SEQ ID NO: 41所示的核酸序列編碼)作為VH CDR3，KASQDINNYLG(SEQ ID NO:46)(由 SEQ ID NO:45 所示的核酸序列編碼)作為 VLCDRl，RTDRLIE (SEQ ID NO: 48)(由 SEQ ID NO: 47 所示的核酸序列編碼)作為 VLCDR2，和LQYDEFPRM(SEQ ID NO:50)(由 SEQ ID NO:49 所示的核酸序列編碼)作為 VL CDR3。在還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE分析。凝膠上條帶圖樣的特征是40_50kDa的分子量范圍，對(duì)應(yīng)于IgG重鏈；和20-30kDa的分子量范圍，對(duì)應(yīng)于IgG輕鏈?？?⑶H3抗體克隆#3、克隆#4和克隆#5和通常的IgG —樣顯示一條重鏈帶和一條輕鏈帶。另一方面，抗-⑶H3抗體克隆#6顯示了兩條重鏈帶和一條輕鏈帶。重鏈可變區(qū)的不完全糖基化導(dǎo)致了還原型SDS-PAGE中額外的重鏈帶。如圖2所示，不完全的糖基化影響抗體的均一性，可能在治療藥的開發(fā)中造成困難。因此，設(shè)計(jì)了克隆#6的糖基化位點(diǎn)上具有一個(gè)氨基酸替換的克隆#6的變體，以避免H鏈可變區(qū)中的糖基化。這些變體可能比克隆#6更適合應(yīng)用于基于抗體的癌癥藥物的開發(fā)?？寺?6變體的H鏈可變區(qū)的氨基酸序列如下所示(下劃線標(biāo)明替換的氨基酸殘基)克隆#6NS，H-鏈可變區(qū)(除信號(hào)序列外)QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKSSGYTFTSYWIHWVKQRPGHGLEWIGEIDPSDSYTYYNQNFKGKATLTIDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVFYCARSGYGNLFVYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:68)(由 SEQ IDN0:67所示的核酸序列編碼)；
克隆#6NT，H-鏈可變區(qū)(除信號(hào)序列外)QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKSSGYTFTSYWIHWVKQRPGHGLEWIGEIDPSD1YTYYNQNFKGKATLTIDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVFYCARSGYGNLFVYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO :72)(由 SEQ IDNO:71所示的核酸序列編碼)；克隆#6NA，H-鏈可變區(qū)(除信號(hào)序列外)QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKSSGYTFTSYWIHWVKQRPGHGLEWIGEIDPSDAYTYYNQNFKGKATLTIDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVFYCARSGYGNLFVYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO :76)(由 SEQ IDNO:75所示的核酸序列編碼)；和克隆#6NQ，H-鏈可變區(qū)(除信號(hào)序列外)QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKSSGYTFTSYWIHWVKQRPGHGLEWIGEIDPSDQYTYYNQNFKGKATLTIDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVFYCARSGYGNLFVYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:80)(由 SEQ IDNO:79所示的核酸序列編碼)?？寺?6變體的L鏈可變區(qū)(除信號(hào)序列外)的氨基酸序列與克隆#6相同；QIVLTQSPAIMSSSPGEKVTMSCSATSSVTYMYWYQQKPGSSPKPWIFRTSNLASGVPTRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQHYHIYPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:60)(由 SEQ ID NO:59 所示的核酸序列編碼)。根據(jù)Kabat定義確定的克隆#6變體的VH CDR2序列為克隆#6NS為EIDPSDSYTYYNQNFKG(SEQ ID N0:70)(由 SEQ ID N0:69所示的核酸序列編碼)、克隆#6NT為EIDPSDTYTYYNQNFKG(SEQ ID N0:74)(由 SEQ IDN0:73所示的核酸序列編碼))、克隆#6NA為EIDPSDAYTYYNQNFKG(SEQID NO:78)(由 SEQ ID NO:77 所示的核酸序列編碼))，克隆 #6NQ為 EIDPSDQYTYYNQNFKG(SEQ ID NO:82)(由 SEQ ID NO:81 所示的核酸序列編碼))。這些變體的根據(jù)Kabat定義的其他CDR序列與克隆#6的相同；SYffIH (SEQ ID N0:54)(由 SEQ ID NO:53 所示的核酸序列編碼)作為 VH CDRl, SGYGNLFVY(SEQ ID NO:58)(由 SEQ ID NO:57 所示的核酸序列編碼)作為 VH CDR3, SATSSVTYMY(SEQ ID NO:62)(由SEQ ID N0:61 所示的核酸序列編碼)作為 VL CDRl，RTSNLAS(SEQ ID NO:64)(由 SEQ IDN0:63 所示的核酸序列編碼)作為 VL CDR2，和 QHYHIYPRT (SEQ ID N0:66)(由 SEQ IDNO:65所示的核酸序列編碼)作為VL⑶R3。工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明至少部分基于如下的發(fā)現(xiàn)，即在體內(nèi)表達(dá)⑶H3的癌癥可以用放射性同位素標(biāo)記的抗CDH3抗體來治療。CDH3據(jù)報(bào)道是在胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌或肝癌中強(qiáng)烈表達(dá)的基因。因此，癌癥(例如胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌或肝癌)的治療可以使用用放射性同位素標(biāo)記物標(biāo)記的抗CDH3抗體方便地進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.一種抗體或其片段，其中所述抗體包含H(重)鏈V(可變)區(qū)和L(輕)鏈V區(qū)，其中所述H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)選自下組 (a)包含具有SEQID N0:4所示的氨基酸序列的H鏈V區(qū)中所含的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或與之功能上等同的⑶R的H鏈V區(qū)，以及包含具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的L鏈V區(qū)中所含的⑶R或與之功能上等同的⑶R的L鏈V區(qū)； (b)包含具有SEQID N0:20所示的氨基酸序列的H鏈V區(qū)中所含的CDR或與之功能上等同的⑶R的H鏈V區(qū)，以及包含具有SEQ ID N0:28的氨基酸序列的L鏈V區(qū)中所含的⑶R或與之功能上等同的⑶R的L鏈V區(qū)； (c)包含具有SEQID NO: 36所示的氨基酸序列的H鏈V區(qū)中所含的⑶R或與之功能上等同的⑶R的H鏈V區(qū)，以及包含具有SEQ ID N0:44的氨基酸序列的L鏈V區(qū)中所含的⑶R或與之功能上等同的⑶R的L鏈V區(qū)；和 (d)包含具有SEQID N0:68、72、76或80所示的氨基酸序列的H鏈V區(qū)中所含的⑶R或與之功能上等同的⑶R的H鏈V區(qū)，以及包含具有SEQ IDNO:60的氨基酸序列的L鏈V區(qū)中所含的⑶R或與之功能上等同的⑶R的L鏈V區(qū)， 且其中所述抗體能夠結(jié)合CDH3多肽或其部分肽。
2.權(quán)利要求I的抗體或其片段，其中所述H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)選自下組 (a)包含具有SEQID NO:6所示的氨基酸序列的CDRl、具有SEQ IDN0:8所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列的⑶R3的H鏈V區(qū)，和包含具有SEQID NO: 14所示的氨基酸序列的⑶R1、具有SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列的⑶R3的L鏈V區(qū)， (b)包含具有SEQID NO:22所示的氨基酸序列的CDRl、具有SEQ IDN0:24所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有SEQ ID NO: 26所示的氨基酸序列的⑶R3的H鏈V區(qū)，和包含具有SEQ ID NO: 30所示的氨基酸序列的CDRl、具有SEQ ID NO: 32所示的氨基酸序列的CDR2、和具有SEQ ID NO: 34所示的氨基酸序列的⑶R3的L鏈V區(qū)； (c)包含具有SEQID NO:38所示的氨基酸序列的CDRl、具有SEQ IDN0:40所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列的⑶R3的H鏈V區(qū)，和包含具有SEQ ID NO: 46所示的氨基酸序列的CDRl、具有SEQ ID NO: 48所示的氨基酸序列的CDR2、和具有SEQ ID NO: 50所示的氨基酸序列的⑶R3的L鏈V區(qū)；和 (d)包含具有SEQID NO: 54所示的氨基酸序列的CDRl、具有SEQ IDN0:70，74，78或82所示的氨基酸序列的CDR2、和具有SEQ ID NO: 58所示的氨基酸序列的CDR3的H鏈V區(qū)，和包含具有SEQ ID N0:62所示的氨基酸序列的⑶R1、具有SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列的⑶R2、和具有SEQ IDNO:66所示的氨基酸序列的⑶R3的L鏈V區(qū)。
3.權(quán)利要求I或2的抗體或其片段，其中所述抗體選自下組小鼠抗體、嵌合抗體、人源化抗體、抗體片段、和單鏈抗體。
4.權(quán)利要求3的抗體或其片段，其中所述抗體包含具有選自SEQIDNO: 4，20，36，68，72，76和80的氨基酸序列的H鏈V區(qū)，和/或具有選自SEQ ID NO: 12, 28,44和60的氨基酸序列的L鏈V區(qū)。
5.權(quán)利要求4的抗體或其片段，其中所述抗體包含 (a)具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列的H鏈V區(qū)和具有SEQ ID N0:12所示的氨基酸序列的L鏈V區(qū)； (b)具有SEQID NO:20所示的氨基酸序列的H鏈V區(qū)和具有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的L鏈V區(qū)； (c)具有SEQID NO:36所示的氨基酸序列的H鏈V區(qū)和具有SEQ ID N0:44所示的氨基酸序列的L鏈V區(qū)；或 (d)具有SEQID NO:68，72，76或80所示的氨基酸序列的H鏈V區(qū)和具有SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列的L鏈V區(qū)。
6.權(quán)利要求4或5的抗體或其片段，其中所述抗體是嵌合抗體。
7.權(quán)利要求6的抗體或其片段，其中所述抗體是人源化抗體。
8.權(quán)利要求7的抗體或其片段，其中所述人源化抗體還包含人抗體FR(框架)區(qū)和/或人抗體C區(qū)。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的抗體或其片段，其中所述抗體與細(xì)胞毒劑、治療劑、放射性同位素標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物綴合。
10.權(quán)利要求9的抗體或其片段，其中所述放射性同位素標(biāo)記物選自90釔(9°Y)和111銦(111In)。
11.一種用于在受試者中治療或預(yù)防與CDH3有關(guān)的疾病或抑制表達(dá)CDH3的細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法，其中所述方法包括給所述受試者施用有效量的權(quán)利要求ι- ο中任一項(xiàng)的抗體或片段。
12.一種用于在受試者中診斷與CDH3有關(guān)的疾病或發(fā)生該疾病的傾向的方法，其中所述方法包括 (a)使來自所述受試者的樣品或標(biāo)本接觸權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的抗體或片段； (b)檢測(cè)所述樣品或標(biāo)本中的CDH3多肽；并 (c)基于與對(duì)照相比CDH3多肽的相對(duì)豐度來判斷所述受試者是否患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生所述疾病。
13.一種用于治療或預(yù)防與⑶H3有關(guān)的疾病或抑制表達(dá)⑶H3的細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含有效量的依照權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的抗體或片段和可藥用的擔(dān)載體或賦形劑。
14.一種用于診斷與CDH3有關(guān)的疾病的試劑盒，其中所述試劑盒包含依照權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的抗體或片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗CDH3抗體，其能用放射性同位素標(biāo)記。此外，本發(fā)明提供包含抗CDH3抗體作為活性成分的藥物組合物和方法。由于CDH3在胰腺、肺、結(jié)腸、前列腺、乳腺、胃或肝癌細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)，本發(fā)明在胰腺、肺、結(jié)腸、前列腺、乳腺、胃或肝癌治療中是有用的。
文檔編號(hào)C12P21/08GK102781964SQ20098016348
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2009年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月28日
發(fā)明者中村佑輔, 吉岡弘樹, 大澤龍司, 山元進(jìn)司, 工藤愛子, 柴康弘, 遠(yuǎn)藤啟吾, 黃寶星 申請(qǐng)人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司