本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，公開了一種檢測口腔癌的標(biāo)志物及其試劑盒。
背景技術(shù)：
：DNA復(fù)制起始蛋白作為目前公認(rèn)的表征細(xì)胞增殖狀態(tài)的標(biāo)志物，已經(jīng)被廣泛用于宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌等各種癌癥。Williams最早將DNA復(fù)制起始蛋白應(yīng)用在尿液脫落細(xì)胞的檢測，在92例宮頸癌脫落細(xì)胞涂片和57例組織切片中以MCM5、CDC6、PCNA和Ki67為檢測對象，免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，惡變細(xì)胞中可以觀察這幾種蛋白在不同病理階段的表達(dá)差異，其中MCM5與CDC6比PCNA，Ki67的敏感性更高。反映了DNA復(fù)制起始蛋白比傳統(tǒng)的細(xì)胞增殖標(biāo)志物更為敏感，因此可以考慮將其用于口腔癌的研究。目前關(guān)于DNA復(fù)制起始蛋白在口腔脫落細(xì)胞中的研究尚無報導(dǎo)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種檢測口腔癌的標(biāo)志物。本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測口腔癌的試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：一種檢測口腔癌的標(biāo)志物，由CDC6、CDT1、MCM2和CDC45四種DNA復(fù)制起始蛋白組成。CDC6、CDT1、MCM2和CDC45四種DNA復(fù)制起始蛋白在制備檢測口腔癌試劑盒中的應(yīng)用。一種檢測口腔癌的試劑盒，該試劑盒以CDC6、CDT1、MCM2和CDC45四種DNA復(fù)制起始蛋白作為檢測靶標(biāo)，根據(jù)以上四種DNA復(fù)制起始蛋白的mRNA表達(dá)量可以判斷口腔癌或口腔癌的發(fā)展階段。正常人、口腔炎癥、癌前病變、口腔癌和術(shù)后階段所述口腔癌的發(fā)展階段是指細(xì)胞發(fā)展處于癌前病變、癌癥期、癌癥術(shù)后等。所述檢測四種DNA復(fù)制起始蛋白的mRNA表達(dá)量時，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品的引物序列如SEQIDNO：1～10所示，用于擴(kuò)增大于200bp的QRT-PCR引物序列如SEQIDNO：11～20所示，用于擴(kuò)增小于150bp的QRT-PCR引物序列如SEQIDNO：21～30所示。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明旨在通過對正常人，口腔炎癥、癌前病變、口腔癌和術(shù)后階段的CDC6、CDT1、MCM2和CDC45mRNA水平進(jìn)行定量檢測，同時結(jié)合臨床診斷結(jié)果，判斷這些腫瘤標(biāo)志物作為口腔癌早期篩選的理想腫瘤標(biāo)志物的可行性。探討口腔脫落細(xì)胞中腫瘤標(biāo)志物含量變化的機(jī)制，以及在預(yù)后判斷上的臨床價值。附圖說明圖1.CDC6(A)、CDT1(B)、MCM2(C)和CDC45(D)在正常組、炎癥、癌前損傷、口腔癌和術(shù)后組的相對表達(dá)水平的箱式圖，箱式部分代表50％的四分位數(shù)(25％以上，75％以下)，粗線代表相對表達(dá)的均值，小圓圈代表出離范圍值。圖2為DNA復(fù)制起始蛋白mRNA相對表達(dá)均值比較，A：CDC6；B：CDT1；C：MCM2；D：CDC45。具體實(shí)施方式下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。實(shí)施例1一、研究對象：包括76例患病組患者和24例正常健康人作為對照組；患病組：2007～2008年在中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔科就診的患者中選取76例患者，其中炎癥14例、癌前損傷(白斑)14例、口腔癌20例、術(shù)后28例(所有病例均手術(shù)擴(kuò)大切除原發(fā)灶。炎癥組多為牙周炎和口底蜂窩織炎，癌前損傷組為白斑和口腔良性腫瘤，口腔癌多為舌鱗癌、頰癌、頜骨癌、牙齦癌，患者臨床診斷均由病理診斷證實(shí)為口腔鱗狀細(xì)胞癌，全身檢查無其他惡性腫瘤。患者年齡在31～75歲之間，平均55歲。按照口腔患病類型分為，舌、牙齦、頰、頜骨、口底。對照組：24例正常健康人作為正常對照組，他們均來自經(jīng)口腔檢查無牙周病、無炎癥、無潰瘍，全身檢查無全身疾病的志愿者。二、CDC6、CDT1、MCM2和CDC45的mRNA水平定量檢測，具體方法如下：1、RNA提?。菏茉囌叱浞钟们逅诤?，將漱口液用50ml離心管收集脫落細(xì)胞，4℃、8000g離心5min，棄上清，將管子倒置，使管中殘余的水晾干，按細(xì)胞的濃度加入TRIzol，提取RNA，詳細(xì)步驟參考本領(lǐng)域常規(guī)提取方法。2、第一鏈合成：提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，貯存于-20℃?zhèn)溆?，具體步驟詳見常規(guī)試劑盒說明書。3、熒光定量分析：由于要擴(kuò)增的目的基因?yàn)檎婧松铮砸镌O(shè)計(jì)需要跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)。擴(kuò)增的目的基因片段需要在標(biāo)準(zhǔn)品中克隆的基因片段之內(nèi)，故每個基因各有一對構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品的引物和兩對用于熒光定量的引物(表1，2，3)。本試驗(yàn)要檢測的目的基因共4個，另外還有一個看家基因，不能在同一管中完成5色的檢測，因此選用SYBRGreenI這種熒光染料。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度在80～150bp最為合適(可以延長至300bp)。試驗(yàn)采用的是石蠟切片，有研究發(fā)現(xiàn)，石蠟包埋的組織中RNA會片段化，還有不同程度的甲基化。為了研究石蠟包埋對RNA的影響，故設(shè)計(jì)了兩種PCR引物，一對用于擴(kuò)增長片段(200～300bp)，一對用于擴(kuò)增短片段(80～150bp)。SYBRGreenI為雙鏈小溝結(jié)合染料，沒有序列特異性，所以對引物設(shè)計(jì)的要求較高，在擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的引物二聚體和非特異性擴(kuò)增都會直接影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。故需要對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳和溶解曲線分析，確認(rèn)PCR的特異性。采用SYBRGreenIPremixExTaqkit(TaKaRa)檢測目的基因(β-ACTIN、CDC6、CDT1、MCM2和CDC45)，嚴(yán)格按照使用說明進(jìn)行操作。取上述合成的cDNA模板2μl，2×SYBRGreenIPremixExTaq10μl，上下游引物各0.4μl，至終濃度為0.2μmol，用ddH2O補(bǔ)足體系為20μl?；靹蚝髮⒐鼙谏弦后w稍離心到管底部。各反應(yīng)管于美國Bio-Rad公司熒光定量PCR儀iQTM5進(jìn)行擴(kuò)增。95℃預(yù)變性10sec，進(jìn)入循環(huán)94℃變性5sec，60℃退火延伸20sec，共45個循環(huán)，擴(kuò)增完畢后，進(jìn)行熔解曲線分析，從95℃到60℃共35℃，以0.5℃/sec的速率變化溫度，連續(xù)監(jiān)測熒光。每次試驗(yàn)中都設(shè)不含反轉(zhuǎn)錄酶的RT產(chǎn)物和無模板對照。為了得到線性的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋后作為模板(1×102～107copies/μl)，在每次PCR擴(kuò)增時都擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)品。表1用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品的引物序列表2用于擴(kuò)增大于200bp的QRT-PCR引物表3用于擴(kuò)增小于150bp的QRT-PCR引物4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：自建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出每個樣品的確切拷貝數(shù)。為了消除RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)的差異，以β-actin為內(nèi)參，那么單細(xì)胞目的基因mRNA表達(dá)水平用targetcopynumber/β-actincopynumber比值作為標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)水平指標(biāo)。每個樣品重復(fù)至少兩次，cDNA模板來源于不同的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。用One-WayANOVAtest和Kruskal–WallisHtest去分析癌前階段和癌變階段以后mRNA表達(dá)的整體顯著差異性。Mann–WhitneyUtest用于分析組內(nèi)兩種病理階段的顯著性差異。一元線性回歸用于分析不同基因的mRNA表達(dá)與病理參數(shù)之間的相關(guān)性。ROC(receiveroperatingcharacteristiccurves)用于醫(yī)學(xué)診斷試驗(yàn)性能的評價。通過改變診斷界點(diǎn)，獲得多對真陽性率(TPR)與假陽性率(FPR)值，以FPR為橫坐標(biāo)，TPR為縱坐標(biāo)，繪制ROC曲線，計(jì)算與比較ROC曲線下面積，以此反映診斷試驗(yàn)的價值。即分析各不同的DNA復(fù)制起始蛋白作為檢測舌林狀細(xì)胞癌的精確性。在ROC曲線下的面積(areasunderthecurves，AUC)代表了診斷準(zhǔn)確性的高低，一般來說這一指標(biāo)取值范圍在0.5至1之間,完全無價值的診斷AUC＝0.5，完全理想的診斷AUC＝1。一般認(rèn)為AUC為0.5-0.7時，表示診斷價值較低；為0.7-0.9時，表示診斷準(zhǔn)確性為中等；為0.9以上時表示診斷價值較高。p＜0.05認(rèn)為差異具有顯著性。以上的統(tǒng)計(jì)分析通過SPSS13.0軟件進(jìn)行。5、結(jié)果：目的基因的表達(dá)都是相對于看家基因β-actin的相對標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)值。這5個基因的線性相關(guān)性非常高達(dá)到R2>0.994。各目的基因的相對表達(dá)值和不同的病理參數(shù)如表4所示。表4臨床病理參數(shù)及mRNA相對表達(dá)值(n＝100)上表通過熒光定量PCR分析了在不同的樣本中CDC6、CDT1、MCM2、CDC45的相對表達(dá)數(shù)值，所有數(shù)值均為相對于同一樣品的β-actin的比值。6、CDC6熒光定量PCR結(jié)果分析：熒光定量PCR結(jié)果顯示CDC6mRNA的表達(dá)水平在正常與患病組中有整體上的顯著性差異(P＝0.000；Kruskal–Wallistest)。在正常與癌前損傷、鱗狀細(xì)胞癌和術(shù)后的CDC6的表達(dá)兩兩比較發(fā)現(xiàn)，正常組除了與癌前損傷和口腔癌之間有顯著型差異外(P＝0.000,0.000；Mann–Whitneytest)，還與術(shù)后有顯著性差異(p＝0.000)，表明CDC6在術(shù)后一段時間仍有較高表達(dá)。結(jié)果如圖1A和表5所示。另外CDC6的平均表達(dá)水平在炎癥與癌前損傷之間無顯著性差異(P＝0.054)，而炎癥與口腔癌之間的差異性顯著(P＝0.007)。值得注意的是CDC6的表達(dá)在癌前損傷和口腔癌的表達(dá)示有顯著性差異(p＝0.028)，也就是說通過CDC6可以有效地將癌前損傷與口腔癌區(qū)分開來。然而在炎癥和術(shù)后(p＝0.078)，癌前損傷和術(shù)后(p＝0.303)，口腔癌和術(shù)后組(p＝0.428)的比較發(fā)現(xiàn)CDC6mRNA的表達(dá)并沒有顯著性差異(p＝0.311)，以上的結(jié)果表明CDC6mRNA表達(dá)水平隨著舌鱗癌的發(fā)展進(jìn)程是上調(diào)的。7、CDT1熒光定量結(jié)果分析：CDT1mRNA的表達(dá)水平在正常與患病組中的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異的(P＝0.077；Kruskal–Wallistest)(圖1B，表5)。另外,在正常組分別與炎癥、癌前損傷、術(shù)后進(jìn)行差異顯著性比較，CDT1在這三組之間表達(dá)沒有顯著性差異(p＝0.918,0.442,0.270，Mann–Whitneytest)。CDT1正常對照與口腔癌組之間比較差異顯著(p＝0.001)。另外炎癥與口腔癌，術(shù)后與口腔癌之間也有顯著性差異(p＝0.008，0.007)。其余各組兩兩比較都沒有顯著性差異。從以上結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)CDT1作為檢測脫落細(xì)胞的腫瘤標(biāo)志物僅能將相對低表達(dá)的正常組、炎癥組、術(shù)后組與相對高表達(dá)的口腔癌組區(qū)分開，而對于其他組之間則不能有效的區(qū)別開來。8、MCM2熒光定量結(jié)果分析：比較MCM2在臨床病理不同分類的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)(圖1C，表5)，正常對照組與口腔患病組及術(shù)后組在整體上有顯著性差異(P＝0.000；Kruskal–Wallistest)。分別將正常組與炎癥、癌前損傷、口腔癌和術(shù)后組進(jìn)行差異顯著性比較，發(fā)現(xiàn)正常組與炎癥和術(shù)后組之間沒有顯著性差異(p＝0.108，0.681>0.05；Mann–Whitneytest)，而在正常組與癌前損傷組及口腔癌組之間有顯著性差異(p＝0.002，0.000)MCM2的表達(dá)水平隨著口腔病變程度的升高而升高。炎癥與癌前損傷、口腔癌組、術(shù)后之間也有顯著性差異(p＝0.007，0.000，0.029)，MCM2可以將炎癥與癌前損傷，癌，與術(shù)后區(qū)別開來，炎癥組的表達(dá)高于正常組和術(shù)后，說明在炎癥階段細(xì)胞增殖速度加快，而術(shù)后，由于切除了癌變部位，口腔粘膜上皮的增生得到控制，故術(shù)后MCM2的表達(dá)顯著下調(diào)到正常水平，使得術(shù)后與口腔癌組之間產(chǎn)生顯著性差異(p＝0.000)，正常組與術(shù)后組之間沒有顯著性差異。然而當(dāng)我們將癌前損傷組分別與口腔癌組、術(shù)后組比較時，可觀察到顯著性差異(分別為p＝0.018和p＝0.002)。表明MCM2可以有效地將癌前損傷和口腔癌階段區(qū)別開，并在術(shù)后MCM2顯著下調(diào)。以上數(shù)據(jù)揭示了MCM2mRNA的相對表達(dá)水平可作為將癌前病變至口腔癌階段惡性程度的判斷標(biāo)準(zhǔn)，另外對于預(yù)后的判別有一定的臨床參考價值。9、CDC45熒光定量結(jié)果分析：CDC45的表達(dá)水平在正常對照組與口腔患病組及術(shù)后組在整體上有顯著性差異(P＝0.000，Kruskal–Wallistest)，結(jié)果如圖1D，表5所示。正常組分別與炎癥、癌前損傷和口腔癌組相比都有顯著性差異(分別為p＝0.003,0.001和0.000；Mann–Whitneytest)。這個結(jié)果顯示用CDC45可以把正常組與口腔炎癥，癌前損傷以及口腔鱗癌區(qū)別開來。炎癥組分別與癌前損傷組和口腔癌組比較結(jié)果顯示，在這三個階段，CDC45的表達(dá)呈逐漸上調(diào)的趨勢，但是兩兩之間不構(gòu)成顯著性差異(p＝0.198，0.085)。術(shù)后組與正常組、癌前損傷組與癌變組分析結(jié)果顯示，CDC45術(shù)后mRNA的表達(dá)與正常的表達(dá)無顯著性差異(p＝0.34)，而與癌前損傷(p＝0.004)，口腔癌(p＝0.000)有顯著性差異。提示CDC45與術(shù)后口腔上皮細(xì)胞的增殖狀態(tài)有關(guān)。但是CDC45并不能把癌前損傷和口腔癌區(qū)別開來(p＝0.304)。表5為DNA復(fù)制起始蛋白的在各組的差異顯著性比較(p<0.05)CharacteristicCDC6CDT1MCM2CDC45Kruskal–Wallis0.0000.0770.0000.000Normal-inflammation0.1260.9180.1080.003Normal-lesion0.0000.4420.0020.001Normal-OSCC0.0000.0010.0000.000Normal-surgery0.0000.2700.6810.340Inflammation-lesion0.0070.2900.0070.198Inflammation-OSCC0.0000.0080.0000.085Inflammation-surgery0.0290.2700.0290.117Lesion-OSCC0.0780.0840.0180.304Lesion-surgery0.3030.4350.0020.004OSCC-surgery0.4280.0070.0000.000對各組基因相對表達(dá)進(jìn)行均值分析，結(jié)果如圖2所示：CDC6、CDT1、MCM2、CDC45在正常，炎癥、癌前損傷、癌變、階段表達(dá)均呈上升趨勢，在術(shù)后，除CDC6稍高與癌前損傷，其它3個基因均降低到趨于正常水平。表6描述了目的基因表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的聯(lián)系。相關(guān)性分析表明CDC6(r＝0.305,P＝0.000)有顯著性相關(guān)性，而CDT1(r＝0.101,P＝0.200),MCM2(r＝0.082，P＝0.307)和CDC45(r＝0.067，P＝0.413)均沒有相關(guān)性。一元線性回歸分析在兩兩之間表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示在CDC6和MCM2之間(r＝0.206,P＝0.035)，CDT1和CDC45(r＝0.596,P＝0.000)之間有顯著相關(guān)性，結(jié)果如圖2A，2B所示。但是在其它的兩兩比較之間沒有相關(guān)性。表6病理參數(shù)與CDC6、CDT1、MCM2和CDC45之間的相關(guān)性本研究采用QRT-PCR方法檢測了口腔病變患者脫落細(xì)胞中DNA復(fù)制起始蛋白mRNA的含量，同時與正常對照進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)口腔鱗癌患者脫落細(xì)胞DNA復(fù)制起始蛋白含量顯著高于正常對照組，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有極顯著性差異。提示該方法可以有效地將正?？谇幻撀浼?xì)胞及癌變脫落細(xì)胞有效的區(qū)分開來。癌前病變是指口腔粘膜白斑、紅斑、扁平苔癬；乳頭狀瘤和粘膜下纖維性病變等?？谇徽衬ぐ装呤荳HO認(rèn)定的口腔癌前病變，其癌變率為7％～15％，非均質(zhì)型白斑可達(dá)15％～40％。這些病變并非都會癌變，但臨床上許多癌前病變表現(xiàn)無明顯癥狀，要經(jīng)歷長時間，變?yōu)閻盒园┘?xì)胞，因此問題是如何確定這些病損的轉(zhuǎn)歸，那么就需定期檢查，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)惡變可立即采取治療，這樣可增加口腔癌治愈的可能性。許多學(xué)者開始致力于口腔白斑癌變標(biāo)志物的研究，可以有效地將癌前與癌變階段區(qū)別開，這對于口腔癌的早期治愈至關(guān)重要。這也是本研究的主要目的。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCM2和CDC6在區(qū)分癌前病變階段的表達(dá)均顯著低于癌變階段脫落細(xì)胞中相應(yīng)基因的表達(dá)，這對于區(qū)別癌前病變和癌變有著積極的作用。我們的先前的發(fā)現(xiàn)表明CDC6也是一個敏感的檢測異常增生和惡變細(xì)胞的標(biāo)志物。它隨著細(xì)胞周期的進(jìn)行在核與細(xì)胞質(zhì)之間穿梭。但是相對于MCM來說，CDC6是一個相對低豐度，不穩(wěn)定的蛋白，CDC6并不適用于癌癥的大量篩查。而CDT1和CDC45雖然在癌前病變階段的表達(dá)低于癌變階段，但是在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不構(gòu)成顯著性差異，所以不建議作為區(qū)別這兩個階段的標(biāo)志物。另外，如何準(zhǔn)確預(yù)測口腔鱗癌患者治療的預(yù)后，研究與預(yù)后相關(guān)的臨床指標(biāo)，有助于臨床醫(yī)師對患者的治療提供一定的臨床參考價值。目前臨床上對于口腔鱗癌原發(fā)病灶、復(fù)發(fā)病灶以及轉(zhuǎn)移病灶的診斷主要依靠臨床醫(yī)師的臨床經(jīng)驗(yàn)，同時結(jié)合臨床輔助檢查，最終需要通過病理活檢方法實(shí)現(xiàn)。而這些檢查通常是要等到腫瘤長到一定程度，臨床上表現(xiàn)出來時才能夠發(fā)現(xiàn)對于那些部位隱蔽，或者手術(shù)治療后采用組織瓣修復(fù)局部缺損的病變，往往不能夠早期發(fā)現(xiàn)局部復(fù)發(fā)。我們的檢測結(jié)果提示口腔鱗癌，癌前損傷，和術(shù)后不同階段脫落細(xì)胞DNA復(fù)制起始蛋白含量，只有CDC6在術(shù)后一段時間仍有較高表達(dá)，推測CDC6的高表達(dá)不能作為預(yù)后的標(biāo)志基因。其原因尚待進(jìn)一步的研究。另外，CDT1、MCM2和CDC45在術(shù)后均低表達(dá)，與癌變階段有顯著性的差異，與正常對照組之間無差異顯著性。以上結(jié)果說明這三個DNA復(fù)制起始蛋白檢測對于判斷口腔鱗癌患者的預(yù)后，尤其是對于判斷口腔鱗癌患者治療后腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險具有一定的輔助參考價值。其確切結(jié)論尚有待于將來進(jìn)一步的跟蹤隨訪。綜上所述，通過QRT-PCR技術(shù)檢測脫落細(xì)胞中DNA復(fù)制起始蛋白mRNA變化，可以監(jiān)測口腔鱗癌的早期病變，并為預(yù)后提供有用的信息。另外脫落細(xì)胞學(xué)技術(shù)在口腔癌作為一種簡便快速、非侵入性和相對無痛苦的檢查方法，容易為患者所接受，適用于口腔病變的人群普查、腫瘤診斷和療效監(jiān)測等方面。隨著各種新技術(shù)的發(fā)展以及臨床醫(yī)學(xué)與實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)的緊密結(jié)合，必然會有更多的新技術(shù)應(yīng)用于其中，將會有力地促進(jìn)口腔癌的診斷與治療。當(dāng)前第1頁1 2 3