本發(fā)明涉及腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種檢測(cè)尿液中單羥酚類代謝物的試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
腫瘤標(biāo)志物是指在腫瘤的發(fā)生和增殖過(guò)程中，由腫瘤細(xì)胞本身所產(chǎn)生的或者是由機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞反應(yīng)而產(chǎn)生的，反映腫瘤存在和生長(zhǎng)的一類物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、激素、酶(同工酶)及癌基因產(chǎn)物等。化驗(yàn)患者血液或體液中的腫瘤標(biāo)志物，可在腫瘤普查中早期發(fā)現(xiàn)腫瘤,并觀察腫瘤治療的療效以及判斷患者預(yù)后。
單羥酚類代謝物(即酪氨酸、色氨酸等)作為腫瘤標(biāo)志物，已經(jīng)被眾多學(xué)者所認(rèn)知，例如CN102004103、快速尿液?jiǎn)瘟u酚代謝物檢測(cè)在惡性腫瘤中的診斷價(jià)值(檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2016第6期，李興翠等)、尿液?jiǎn)瘟u酚類代謝物檢測(cè)在惡性腫瘤早期預(yù)測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值(檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2015年第16期，黃學(xué)梅等)。
目前這些檢測(cè)方法均為無(wú)機(jī)化學(xué)試劑檢測(cè)法，無(wú)機(jī)化學(xué)檢測(cè)法的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)試劑制備簡(jiǎn)單。但是，尿液中的單羥酚類代謝物的含量是及其微量的，并且尿液中還存在多種其他多種成分會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，因此，開(kāi)發(fā)一種更為精密、特異性更高的檢測(cè)方法迫在眉睫。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，本申請(qǐng)人提供了一種檢測(cè)尿液中單羥酚類代謝物的試劑盒及其制備方法。本發(fā)明對(duì)尿液中微量的單羥酚類代謝物具有特異性檢測(cè)功能，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速，準(zhǔn)確率高。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
檢測(cè)尿液中單羥酚類代謝物的試劑盒，包括盛裝有檢測(cè)試劑的安瓿瓶，所述檢測(cè)試劑為吸附有顯色混合物的殼聚糖復(fù)合纖維素氣凝膠。其制備方法為：
(1)將天然纖維素進(jìn)行溶解，得到纖維素溶液，再將纖維素溶液流延或涂覆成膜狀，通過(guò)凝固再生和水洗，制備成厚度為20～25微米的纖維素膜；
(2)在步驟(1)制備得到的纖維素膜上流延或涂覆一層殼聚糖溶液，凝固后得到一層厚度為20～25微米的殼聚糖膜；
(3)用無(wú)水乙醇對(duì)步驟(2)得到的纖維素-殼聚糖復(fù)合膜進(jìn)行置換，去除其中的水分，然后將纖維素-殼聚糖復(fù)合膜反轉(zhuǎn)放置，使纖維素膜位于上方；
(4)在步驟(3)得到的纖維素-殼聚糖復(fù)合膜的纖維素膜上流延或涂覆一層殼聚糖溶液，凝固后得到一層厚度為20～25微米的殼聚糖膜，得到殼聚糖-纖維素-殼聚糖復(fù)合膜；
(5)用無(wú)水乙醇對(duì)步驟(4)得到的殼聚糖-纖維素-殼聚糖復(fù)合膜進(jìn)行置換，去除其中的水分，然后經(jīng)冷凍干燥或臨界干燥，得到殼聚糖-纖維素-殼聚糖復(fù)合氣凝膠；
(6)將酪氨酸酶和色氨酸酶按照2:1的質(zhì)量比混合均勻得到酶混合物，并且將高碘酸鈉和2,4-二硝基苯阱、氫氧化鈉按照2:1:0.5的質(zhì)量比混合均勻得到標(biāo)記混合物；
(7)將酶混合物和標(biāo)記混合物按照2～3:1的質(zhì)量比混合，然后置于去離子水配制成固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15～20％的混懸液，然后將步驟(5)得到的復(fù)合氣凝膠放入該混懸液中，在水浴振蕩器中振蕩固定3～5小時(shí)，即得。
所述酪氨酸酶和色氨酸酶為市售哺乳動(dòng)物酪氨酸酶和色氨酸酶。優(yōu)選的，所述酪氨酸酶和色氨酸酶為市售人酪氨酸酶和色氨酸酶或大鼠酪氨酸酶和色氨酸酶。
其檢測(cè)方法為：檢驗(yàn)時(shí)溫度20℃左右為宜，取新鮮清潔尿樣(最好是早晨第一次尿液)3ml加入裝有試劑的安瓿瓶中，搖勻后靜放3～5分鐘，然后與比色卡進(jìn)行比色，如果是無(wú)色到黃色，則是陰性；如果是粉色、紫色或者紅色、棕色，則為陽(yáng)性；如果是其他顏色，則為無(wú)效。
氣凝膠是一種具有納米結(jié)構(gòu)的多孔材料，其孔隙率高達(dá)90％以上，密度最低可至0.001g/cm3，是目前世界上最輕的固體材料之一。它明顯不同于孔洞結(jié)構(gòu)在微米和毫米級(jí)的多孔材料，具有極大的比表面積。由于其特有的納米多孔、三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使其具有許多獨(dú)特的性能。殼聚糖復(fù)合纖維素氣凝膠的微觀結(jié)構(gòu)是具有超大比表面積的三維立體網(wǎng)絡(luò)狀蜂窩結(jié)構(gòu)，每個(gè)微小蜂窩中都吸附有若干個(gè)酪氨酸酶。本發(fā)明制備得到的雙層氣凝膠的結(jié)構(gòu)更為疏松，比表面積更大，可以達(dá)到500m2/g，并且纖維素和殼聚糖都是親生物性材料，不會(huì)對(duì)酪氨酸酶產(chǎn)生影響。
酪氨酸酶和色氨酸酶通過(guò)固定酶的方法固定在雙層氣凝膠的孔隙中，這種方法可以使酪氨酸酶和色氨酸酶牢固粘結(jié)在氣凝膠孔隙中，不需要小心翼翼的搬運(yùn)，更為適合普通人購(gòu)買、運(yùn)送和使用。并且固定化酶的方法可以使酪氨酸酶和色氨酸酶更為均勻的分布，并且是單層分布。這使得在氣凝膠的空隙中，在平均單位面積上有最多的單層酪氨酸酶存在，當(dāng)其遇到酪氨酸時(shí)，可以有最高的靈敏度和反應(yīng)速度。
酪氨酸酶和色氨酸酶來(lái)自于市售的人酪氨酸酶；其他哺乳動(dòng)物如大鼠酪氨酸酶也可以用。酪氨酸酶與尿液中的酪氨酸接觸以后，迅速的將酪氨酸分解為鄰苯二酚。顯色試劑為高碘酸鈉粉末，鄰苯二酚與高碘酸鈉反應(yīng)生成鄰苯二琨，呈粉紅色，可以由肉眼觀察到。色氨酸酶與尿液中的色氨酸接觸以后可以分解為丙酮酸、吲哚等物質(zhì)，其中所含的丙酮酸可與2,4-二硝基苯阱反應(yīng)，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯蹤，其在堿性溶液中呈櫻紅色。
本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：
本發(fā)明提供的試劑盒檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，便于各種人群自測(cè)；檢測(cè)時(shí)間短，顯色效果明顯，檢測(cè)者無(wú)需專業(yè)知識(shí)即可進(jìn)行判斷；檢測(cè)效果靈敏，準(zhǔn)確率高，適于大范圍推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述。
實(shí)施例1
一種檢測(cè)尿液中單羥酚類代謝物的試劑盒，包括盛裝有檢測(cè)試劑的安瓿瓶，所述檢測(cè)試劑為吸附有顯色混合物的殼聚糖復(fù)合纖維素氣凝膠。其制備方法為：
(1)用氫氧化鈉將天然纖維素進(jìn)行溶解，得到4wt％的纖維素溶液，再將纖維素溶液流延或涂覆成膜狀，通過(guò)凝固再生和水洗，制備成厚度為20微米的纖維素膜；
(2)在步驟(1)制備得到的纖維素膜上流延或涂覆一層殼聚糖溶液，溶解殼聚糖的溶劑為乙酸，制備得到的殼聚糖濃度為5wt％；凝固后得到一層厚度為20微米的殼聚糖膜；
(3)用無(wú)水乙醇對(duì)步驟(2)得到的纖維素-殼聚糖復(fù)合膜進(jìn)行置換，去除其中的水分，然后將纖維素-殼聚糖復(fù)合膜反轉(zhuǎn)放置，使纖維素膜位于上方；
(4)在步驟(3)得到的纖維素-殼聚糖復(fù)合膜的纖維素膜上流延或涂覆一層殼聚糖溶液，凝固后得到一層厚度為20微米的殼聚糖膜，得到殼聚糖-纖維素-殼聚糖復(fù)合膜；
(5)用無(wú)水乙醇對(duì)步驟(4)得到的殼聚糖-纖維素-殼聚糖復(fù)合膜進(jìn)行置換，去除其中的水分，然后經(jīng)冷凍干燥或臨界干燥，得到殼聚糖-纖維素-殼聚糖復(fù)合氣凝膠；
(6)將酪氨酸酶和色氨酸酶按照2:1的質(zhì)量比混合均勻得到酶混合物，并且將高碘酸鈉和2,4-二硝基苯阱、氫氧化鈉按照2:1:0.5的質(zhì)量比混合均勻得到標(biāo)記混合物；所述酪氨酸酶和色氨酸酶為市售人酪氨酸酶和色氨酸酶；
(7)將酶混合物和標(biāo)記混合物按照2:1的質(zhì)量比混合，然后置于去離子水配制成固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％的混懸液，然后將步驟(5)得到的復(fù)合氣凝膠放入該混懸液中，在水浴振蕩器中振蕩固定5小時(shí)，即得。
其檢測(cè)方法為：檢驗(yàn)時(shí)溫度20℃左右為宜，取新鮮清潔尿樣(最好是早晨第一次尿液)3ml加入裝有試劑的安瓿瓶中，搖勻后靜放3～5分鐘，然后與比色卡進(jìn)行比色，如果是無(wú)色到黃色，則是陰性；如果是粉色、紫色或者紅色、棕色，則為陽(yáng)性；如果是其他顏色，則為無(wú)效。這一方法的檢測(cè)準(zhǔn)確率在99.2％以上，并且無(wú)效狀態(tài)的檢出率在0.001％以下。
實(shí)施例2
一種檢測(cè)尿液中單羥酚類代謝物的試劑盒，包括盛裝有檢測(cè)試劑的安瓿瓶，所述檢測(cè)試劑為吸附有顯色混合物的殼聚糖復(fù)合纖維素氣凝膠。其制備方法為：
(1)用氫氧化鈉和尿素將天然纖維素進(jìn)行溶解，得到6wt％的纖維素溶液，再將纖維素溶液流延或涂覆成膜狀，通過(guò)凝固再生和水洗，制備成厚度為25微米的纖維素膜；
(2)在步驟(1)制備得到的纖維素膜上流延或涂覆一層殼聚糖溶液，溶解殼聚糖的溶劑為乙酸，制備得到的殼聚糖濃度為3wt％；凝固后得到一層厚度為25微米的殼聚糖膜；
(3)用無(wú)水乙醇對(duì)步驟(2)得到的纖維素-殼聚糖復(fù)合膜進(jìn)行置換，去除其中的水分，然后將纖維素-殼聚糖復(fù)合膜反轉(zhuǎn)放置，使纖維素膜位于上方；
(4)在步驟(3)得到的纖維素-殼聚糖復(fù)合膜的纖維素膜上流延或涂覆一層殼聚糖溶液，凝固后得到一層厚度為25微米的殼聚糖膜，得到殼聚糖-纖維素-殼聚糖復(fù)合膜；
(5)用無(wú)水乙醇對(duì)步驟(4)得到的殼聚糖-纖維素-殼聚糖復(fù)合膜進(jìn)行置換，去除其中的水分，然后經(jīng)冷凍干燥或臨界干燥，得到殼聚糖-纖維素-殼聚糖復(fù)合氣凝膠；
(6)將酪氨酸酶和色氨酸酶按照2:1的質(zhì)量比混合均勻得到酶混合物，并且將高碘酸鈉和2,4-二硝基苯阱、氫氧化鈉按照2:1:0.5的質(zhì)量比混合均勻得到標(biāo)記混合物；所述酪氨酸酶和色氨酸酶為市售大鼠酪氨酸酶和色氨酸酶；
(7)將酶混合物和標(biāo)記混合物按照3:1的質(zhì)量比混合，然后置于去離子水配制成固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的混懸液，然后將步驟(5)得到的復(fù)合氣凝膠放入該混懸液中，在水浴振蕩器中振蕩固定3小時(shí)，即得。
其檢測(cè)方法為：檢驗(yàn)時(shí)溫度20℃左右為宜，取新鮮清潔尿樣(最好是早晨第一次尿液)3ml加入裝有試劑的安瓿瓶中，搖勻后靜放3～5分鐘，然后與比色卡進(jìn)行比色，如果是無(wú)色到黃色，則是陰性；如果是粉色、紫色或者紅色、棕色，則為陽(yáng)性；如果是其他顏色，則為無(wú)效。這一方法的檢測(cè)準(zhǔn)確率在99％以上，并且無(wú)效狀態(tài)的檢出率在0.002％以下。