一種快速聯(lián)合檢測(cè)he4和ca125的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型是涉及生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種快速聯(lián)合檢測(cè)HE4和CA125的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]卵巢癌死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首。目前臨床常用的診斷方法:1)婦科三合診(陰道、直腸及腹部聯(lián)合檢查)；2)陰道彩色B超；3)計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)、正電子發(fā)射斷層掃描(PET或PET/CT)等。
[0003]與影像學(xué)檢測(cè)相比較血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)具有更敏感、更提前，操作簡(jiǎn)單結(jié)果直觀等優(yōu)勢(shì)，在腫瘤篩查，診斷，療效判斷，復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)等方面應(yīng)用廣泛。作為不完美的卵巢癌的“金標(biāo)準(zhǔn)” CA125的特異性相對(duì)較低在婦科良性疾病，尤其在子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔結(jié)核、炎癥、卵巢囊腫等甚至更高，其特異性不好；在其他系統(tǒng)惡性疾病也可出現(xiàn)CA125的升高。其敏感性低只有50%的I期卵巢癌和80%的上皮性卵巢癌出現(xiàn)CA125的升高，在卵巢癌的早期篩查中意義不大，在某些婦科惡性腫瘤患者完全不表達(dá)CA125。人附睪蛋白4 (HE4)的出現(xiàn)改變了這一情況，作為一種新型的腫瘤標(biāo)志物在卵巢癌早期診斷中具有重要意義。多數(shù)卵巢癌HE4和CA125水平會(huì)同時(shí)升高，二者的聯(lián)合檢測(cè)有利于提高卵巢癌的檢出率，有效改善了單一腫瘤標(biāo)志物陰性導(dǎo)致的卵巢癌漏診，有效降低假陰性結(jié)果，大大增加卵巢癌診斷的準(zhǔn)確性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本實(shí)用新型的目的是提供一種快速聯(lián)合檢測(cè)HE4和CA125的試劑盒，可同時(shí)定性檢測(cè)人血清中的附睪蛋白HE4和糖抗原CA125，具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。
[0005]一種快速聯(lián)合檢測(cè)HE4和CA125的試劑盒，包括劃有第一檢測(cè)線或者檢測(cè)斑點(diǎn)，第二檢測(cè)線或者檢測(cè)斑點(diǎn)和質(zhì)控線或者質(zhì)控斑點(diǎn)的硝酸纖維素膜及其其他固相材料，第一條檢測(cè)線包括或者檢測(cè)斑點(diǎn)上包被鼠抗人HE4抗體A2，第二條檢測(cè)線包括或者檢測(cè)斑點(diǎn)上包被鼠抗人CA125抗體B2，質(zhì)控線或質(zhì)控斑點(diǎn)上包被有山羊抗鼠IgG或其它與標(biāo)記物起反應(yīng)的抗原或抗體，采用膠體金、乳膠標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物或者酶標(biāo)記物及可通過(guò)肉眼或者儀器進(jìn)行檢測(cè)的分子或者顆粒物分別標(biāo)記鼠抗人HE4抗體Al和鼠抗人CA125抗體BI，本實(shí)用新型是基于免疫層析或者免疫滲濾或其他免疫學(xué)技術(shù)和膠體金或乳膠顆?；驘晒饣蚧瘜W(xué)發(fā)光或酶顯色技術(shù)開(kāi)發(fā)而成的檢測(cè)試劑盒，采用雙抗體夾心法實(shí)現(xiàn)對(duì)人血清中HE4和CA125的聯(lián)合檢測(cè)。
[0006]本發(fā)明的一種快速聯(lián)合檢測(cè)HE4和CA125的試劑盒，其特征在于所述的抗體，用于標(biāo)記的抗體是鼠抗人HE4抗體Al和鼠抗人CA125抗體BI，用于包被的抗體鼠抗人HE4抗體A2和鼠抗人CA125抗體B2，用于標(biāo)記和包被的抗體可以通過(guò)或轉(zhuǎn)染小鼠后表達(dá)純化獲得。
[0007]本發(fā)明的一種快速聯(lián)合檢測(cè)HE4和CA125的試劑盒，具體工作原理如下:檢測(cè)時(shí)，血清樣本中的人附睪蛋白HE4和糖抗原CA125首先與膠體金、乳膠標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物或者酶標(biāo)記物及可通過(guò)肉眼或者儀器進(jìn)行檢測(cè)的分子或者顆粒物標(biāo)記的HE4抗體Al和鼠抗人CA125抗體BI相結(jié)合，分別形成抗原-抗體-標(biāo)記物的復(fù)合物，該復(fù)合物在毛吸或者滲濾作用下分別與包被與硝酸纖維素膜上的第一檢測(cè)線和第二檢測(cè)線上的抗體結(jié)合形成抗體-抗原-顯色物，完成顯色，形成肉眼可見(jiàn)的或者儀器可檢測(cè)到的第一檢測(cè)線第二檢測(cè)線。
[0008]本實(shí)用新型的有益效果是:提供一種快速聯(lián)合檢測(cè)HE4和CA125的試劑盒。采用膠體金、乳膠標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物或者酶標(biāo)記物及可通過(guò)肉眼或者儀器進(jìn)行檢測(cè)的分子或者顆粒物分別標(biāo)記鼠抗人HE4抗體Al和鼠抗人CA125抗體BI，包被鼠抗人HE4抗體A2和鼠抗人CA125抗體B2實(shí)現(xiàn)對(duì)人血清中HE4和CA125的聯(lián)合檢測(cè)，一次檢測(cè)獲得兩種檢測(cè)指標(biāo)，節(jié)約時(shí)間和成本，減輕患者的痛苦。具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。
[0009]本專利所述的一種快速聯(lián)合檢測(cè)HE4和CA125的試劑盒，樣本要求如下:
[0010]人體血液中的某些成分具有潛在的傳染性，操作時(shí)應(yīng)按照微生物和生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則進(jìn)行。
[0011 ] 血清樣本按照常規(guī)方法米集獲得。
[0012]如果不能立即檢測(cè)，3天以內(nèi)的樣本可以4度保存，如果放置-20度至少保存3個(gè)月。
[0013]測(cè)試前將冷凍保存的樣本慢慢恢復(fù)至室溫后混勻使用，避免樣本反復(fù)凍融。
[0014]檢測(cè)樣本中如果有明顯顆粒物或者沉淀時(shí)，離心取上清進(jìn)行檢測(cè)。
[0015]本專利所述的一種快速聯(lián)合檢測(cè)HE4和CA125的試劑盒檢測(cè)方法如下:
[0016]步驟1、將試劑盒和待測(cè)樣品取出，平衡至室溫；
[0017]步驟2、打開(kāi)密封的鋁箔袋，將試劑盒取出平放在桌面上；
[0018]步驟3、用滴管或者移液器取2-3滴或者60— 90ul血清，滴加在加樣孔中；
[0019]步驟4、計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)，15min判讀結(jié)果；
[0020]注意如果加樣后，樣本Imin未側(cè)向?qū)游龌蛘邼B濾，可能是由于樣本太粘稠，需要對(duì)血清樣本用生理鹽水進(jìn)行預(yù)處理。
【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1為本發(fā)明實(shí)施例試劑盒的Tl、T2全部陽(yáng)性結(jié)果圖
[0022]圖2為本發(fā)明實(shí)施例試劑盒的Tl陽(yáng)性、T2陰結(jié)果圖
[0023]圖3為本發(fā)明實(shí)施例試劑盒的Tl陰性、T2陽(yáng)結(jié)果圖
[0024]圖4為本發(fā)明實(shí)施例試劑盒的Tl、T2全部陰性結(jié)果圖
[0025]圖5為本發(fā)明實(shí)施例試劑盒的無(wú)效結(jié)果圖
[0026]圖6為本發(fā)明試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖
[0027]附圖序號(hào)說(shuō)明:1質(zhì)控線(或質(zhì)控斑點(diǎn))；2第一檢測(cè)線Tl (或檢測(cè)斑點(diǎn))；3第二檢測(cè)線T2(或檢測(cè)斑點(diǎn))；4硝酸纖維素膜；5標(biāo)記物墊。
【具體實(shí)施方式】
[0028]一種快速聯(lián)合檢測(cè)HE4和CA125的試劑盒
[0029]I 主要材料
[0030]1.1鼠抗人HE4抗體Al、A2和鼠抗人CA125抗體B1、B2:美國(guó)alfa公司，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染小鼠表達(dá)純化獲得，分別用標(biāo)記和包被；羊抗鼠IgG抗體:深圳菲鵬生物股份有限公司產(chǎn)品，用于硝酸纖維素膜膜質(zhì)控線或者質(zhì)控斑點(diǎn)包被；硝酸纖維素膜=Millipore公司產(chǎn)品。其它常用試劑均為分析純?cè)噭?br>[0031]1.2血清樣本由公司在天津市相關(guān)醫(yī)院獲得。
[0032]2 方法
[0033]2.1 HE4抗體A1、CA125抗體BI的標(biāo)記以膠體金、乳膠標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物或者酶標(biāo)記物及可通過(guò)肉眼或者儀器進(jìn)行檢測(cè)的分子或者顆粒物分別標(biāo)記鼠抗人HE4抗體Al和鼠抗人CA125抗體BI ;以不同濃度的酪蛋白、BSA及其他有封閉效果的蛋白或者化合物分別對(duì)標(biāo)記物進(jìn)行封閉；標(biāo)記結(jié)束后以12000 r/m離心，棄上清，沉淀按原體積復(fù)溶至不同配比的磷酸鹽緩沖工作液。然后將標(biāo)記溶液按Iml溶液鋪20cm2的比例加樣于無(wú)紡布或者玻璃纖維素膜或者聚酯膜上，在溫度20-25?，相對(duì)濕度在< 30%的干燥環(huán)境中將標(biāo)記物固相化。
[0034]2.2 HE4抗體A2、CA125抗體B2的包被用0.0lM PBS將鼠抗人HE4抗體A2、鼠抗人CA125抗體B2分別稀釋，然后用噴膜儀或者點(diǎn)樣儀在硝酸纖維素膜上進(jìn)行分別劃線或者點(diǎn)斑點(diǎn)包被檢測(cè)線Tl和檢測(cè)線T2，同時(shí)在硝酸纖維素膜上部包被羊抗鼠IgG抗體，用于產(chǎn)品的質(zhì)控，包被完成后將NC膜在在溫度20-25°C，相對(duì)濕度在< 30%的干燥間干燥將包被物進(jìn)行固相化。
[0035]2.3檢測(cè)試劑盒的組裝在干燥室內(nèi)將已包被的硝酸纖維素膜放置在塑料支撐板的中部粘貼，在硝酸纖維素膜T線一側(cè)搭接標(biāo)記物的墊(搭標(biāo)記物墊的1/3)粘貼，在標(biāo)記物墊另一側(cè)搭接粘貼上樣墊(搭標(biāo)記物墊的1/5);在硝酸纖維素膜膜C線一側(cè)搭接吸樣墊(搭吸樣墊的1/10);然后用裁剪機(jī)將貼好塑料板切成一定寬度的試紙條，再裝入塑料卡內(nèi)，形成HE4和CA125的檢測(cè)試劑盒。
[0036]2.4檢測(cè)步驟1、將試劑盒和待測(cè)樣品取出，平衡至室溫；步驟2、打開(kāi)密封的鋁箔袋，將試劑盒取出平放在桌面上；步驟3、用滴管或者移液器取2-3滴或者60—90ul血清，滴加在加樣孔中；步驟4、計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)，15min判讀結(jié)果；注意如果加樣后，樣本Imin未側(cè)向?qū)游龌蛘邼B濾，可能是由于樣本太粘稠，需要對(duì)血清樣本用生理鹽水進(jìn)行預(yù)處理。
[0037]3 結(jié)果
[0038]在毛吸或者滲濾或者側(cè)向?qū)游龅淖饔孟拢?dāng)血清樣本中有HE4和CA125蛋白時(shí)，第一檢測(cè)線(或檢測(cè)斑點(diǎn))和第二檢測(cè)線(或檢測(cè)斑點(diǎn))會(huì)顯色，同時(shí)質(zhì)控線(或質(zhì)控斑點(diǎn))顯色(圖1);當(dāng)血清樣本中有HE4蛋白而沒(méi)有CA125蛋白時(shí)，第一檢測(cè)線(或檢測(cè)斑點(diǎn))顯色和第二檢測(cè)線(或檢測(cè)斑點(diǎn))不顯色，質(zhì)控線(或質(zhì)控斑點(diǎn))顯色(圖2);當(dāng)血清樣本中沒(méi)有有HE4蛋白而有CA125蛋白時(shí)，第一檢測(cè)線(或檢測(cè)斑點(diǎn))不顯色和第二檢測(cè)線(或檢測(cè)斑點(diǎn))顯色，質(zhì)控線(或質(zhì)控斑點(diǎn))顯色(圖3);當(dāng)血清樣本中HE4和CA125蛋白均沒(méi)有時(shí)，第一檢測(cè)線(或檢測(cè)斑點(diǎn))和第二檢測(cè)線(或檢測(cè)斑點(diǎn))均不顯色，但質(zhì)控線(或質(zhì)控斑點(diǎn))顯色(圖4)當(dāng)上樣血清樣本后，質(zhì)控線(或質(zhì)控斑點(diǎn))不顯色，無(wú)論第一檢測(cè)線(或檢測(cè)斑點(diǎn))和第二檢測(cè)線(或檢測(cè)斑點(diǎn))顯不顯色，均判定結(jié)果無(wú)效(圖5)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種快速聯(lián)合檢測(cè)HE4和CA125的試劑盒，其特征在于試劑盒包括劃有第一檢測(cè)線或者檢測(cè)斑點(diǎn)、第二檢測(cè)線或者檢測(cè)斑點(diǎn)和質(zhì)控線或者質(zhì)控斑點(diǎn)的硝酸纖維素膜，膠體金、乳膠標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物或者酶標(biāo)記物及可通過(guò)肉眼或者儀器進(jìn)行檢測(cè)的分子或者顆粒物分別標(biāo)記鼠抗人HE4抗體Al和鼠抗人CA125抗體BI制備的標(biāo)記物的墊，及其他固相材料，第一條檢測(cè)線包括或者檢測(cè)斑點(diǎn)上包被鼠抗人HE4抗體A2，第二條檢測(cè)線包括或者檢測(cè)斑點(diǎn)上包被鼠抗人CA125抗體B2，質(zhì)控線或質(zhì)控斑點(diǎn)上包被有山羊抗鼠IgG或其它與標(biāo)記物起反應(yīng)的抗原或抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速聯(lián)合檢測(cè)HE4和CA125的試劑盒，其特征在于所述的抗體，用于標(biāo)記的抗體是鼠抗人HE4抗體Al和鼠抗人CA125抗體BI，用于包被的抗體鼠抗人HE4抗體A2和鼠抗人CA125抗體B2，用于標(biāo)記和包被的抗體可以通過(guò)或轉(zhuǎn)染小鼠后表達(dá)純化獲得。
【專利摘要】本實(shí)用新型是一種快速聯(lián)合檢測(cè)HE4和CA125的試劑盒，包括劃有第一檢測(cè)線或者檢測(cè)斑點(diǎn)、第二檢測(cè)線或檢測(cè)斑點(diǎn)和質(zhì)控線或質(zhì)控斑點(diǎn)的硝酸纖維素膜及其他固相材料，第一條檢測(cè)線T1或者檢測(cè)斑點(diǎn)上包被鼠抗人HE4抗體A2，第二條檢測(cè)線T2或者檢測(cè)斑點(diǎn)上包被鼠抗人CA125抗體B2，所述質(zhì)控線C或質(zhì)控斑點(diǎn)上包被有羊抗鼠IgG或其它與標(biāo)記物起反應(yīng)的抗原或抗體，采用膠體金、乳膠標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物或者酶標(biāo)記物及可通過(guò)肉眼或者儀器進(jìn)行檢測(cè)的分子或者顆粒物分別標(biāo)記鼠抗人HE4抗體A1和鼠抗人CA125抗體B1制成標(biāo)記物墊，本試劑盒具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】G01N33/68, G01N33/558
【公開(kāi)號(hào)】CN204719056
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201520311623
【發(fā)明人】司英杰, 李梅, 劉琳, 殷娟娟, 向榮, 王昊, 張賢剛, 張賢強(qiáng), 朱正宇, 李亞峰
【申請(qǐng)人】德康潤(rùn)生物科技（天津）有限公司
【公開(kāi)日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2015年5月15日