專利名稱：海參腸道組織蛋白酶b的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于從海洋動(dòng)物提取蛋白酶，同時(shí)涉及采用離子交換層析技術(shù)、凝 膠層析技術(shù)、高效液相色譜技術(shù)、冷凍干燥的技術(shù)等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
溶酶體中存在多種組織蛋白酶，目前已從魚(yú)貝類肌肉和內(nèi)臟中純化并鑒定 IO種組織蛋白酶，即組織蛋白酶A、 B、 C、 D、 E、 H、 L、 L-like、 X及S。
對(duì)組織蛋白酶B的研究主要集中在魚(yú)類。目前，已從gray mullet、 tilapia mossambica、鯖魚(yú)、common Mackerel、 chun salmon、鯉魚(yú)肌肉中純化了組織蛋 白酶B，并對(duì)其進(jìn)行了鑒定。
組織蛋白酶B(Cathepsin B,CB)是一種溶酶體半胱氨酸蛋白水解酶，具有內(nèi) 肽酶活及羧肽酶活，對(duì)肌肉蛋白質(zhì)有廣泛的降解作用。研究表明，在pH5.0時(shí)， CB能夠水解肌球蛋白、肌鈣蛋白、原肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白。CB的催化作用由 Cys， His實(shí)現(xiàn)，易被巰基試劑抑制，又稱巰基酶，屬于木瓜蛋白酶家族。近年 來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶也參與細(xì)胞凋亡過(guò)程，其中組織蛋白酶B、 C等能直 接或間接地激活Caspase (天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶)而觸發(fā)細(xì)胞凋亡， 從而加速組織自溶。
目前，尚未有海參腸道組織蛋白酶B的相關(guān)提取方法，也未見(jiàn)到相關(guān)的文 獻(xiàn)合信息報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)海參貯存十分困難，因?yàn)槠潴w內(nèi)存在的酶類的協(xié)同催化作用可將自身 體內(nèi)的蛋白質(zhì)水解，引發(fā)海參神奇的自溶現(xiàn)象。本發(fā)明旨在研究海參自溶相關(guān) 的組織蛋白酶B，對(duì)海參自溶酶系的研究，將有助于延長(zhǎng)海參貯存期、優(yōu)化加工 條件及其開(kāi)發(fā)出更有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的功能性食品。
本發(fā)明的技術(shù)方案是在低溫條件下，對(duì)海參腸勻漿破碎，緩沖液浸提， 采用硫酸銨分級(jí)沉淀提取組織蛋白酶B粗酶。并依次利用離子交換樹(shù)脂、凝膠 層析技術(shù)使粗酶達(dá)到純化。
具體操作步驟為1. 海參的處理
取新鮮活海參，去體壁后將海參腸清洗，去除泥沙和雜質(zhì)。
2. 粗酶的提取
將其用1 20倍海參腸體積的0"C的含5 200mmol/LL-Cys (L-半胱氨酸) 的5 200mmol/LpH3.0 6.8的醋酸鈉緩沖液勻漿破碎；在4"C下浸提4 18h， 采用6000 20000Xg (4°C)冷凍離心5 60min，取上層清液。選擇硫酸銨飽 和度為10% 卯％，對(duì)所得上層清液進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，經(jīng)6000 20000Xg (4°C)冷凍離心20 60min后，取沉淀，并用上述醋酸鈉緩沖液溶解沉淀，透 析除鹽后濃縮，即得到組織蛋白酶B粗酶。
所述硫酸銨分級(jí)沉淀目的是在不同的硫酸銨飽和度下使不同的蛋白質(zhì)從溶 液中沉淀析出，選擇目的蛋白的最大飽和度作為硫酸銨的最終飽和度。本實(shí)驗(yàn) 選用5 200mmol/L pH 3.0 6.8的醋酸鈉緩沖液作為提取海參腸組織蛋白酶B 的浸提液。具體操作如下取新鮮海參腸用上述浸提液浸提，勻漿搗碎后經(jīng)冷 凍離心5 60min后，取上清液，平均分成6份后并在4'C和磁力攪拌下依次向 上清液中加入研磨后的硫酸銨，使其飽和度分別達(dá)到0%、 20%、 40%、 60%、 80%、 90% ，靜置4h后，冷凍離心20 60min，取上清液測(cè)定酶活力。選取酶 活力最大所在的硫酸銨飽和度作為分級(jí)沉淀的條件。
3. 組織蛋白酶的純化
將得到的組織蛋白酶B粗酶用離子交換層析色譜、凝膠色譜、高效液相色 譜中的2 3種方法達(dá)到純化的目的，其中離子交換層析色譜是必須使用的。凝 膠色譜可以用 一種或兩種不同的層析方法先后進(jìn)行純化。
(1) 離子交換色譜采用DEAE Sepharose CL-6B，采用含0.01 10 mmol/L 的NaCl的5 200mmol/LL-Cys的pH5.0 6.5的磷酸鈉緩沖液線性洗脫，流速 為0.5ml/min,將有酶活力的部分收集，透析除鹽后濃縮。
(2) 凝膠色譜采用G-75或/和Sephacryl 100HR方法
G-75凝膠層析采用含0.01 10 mmol/L的NaCl的5 200mmol/L L-Cys 的pH5.0 6.5的磷酸鈉緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集， 透析除鹽后濃縮。
Sephacryl 100 HR凝膠層析采用含0.01 10 mmol/L的NaCl的5 200mmol/LL-Cys的pH5.0 6.5的磷酸鈉緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集，透析除鹽后濃縮。
(3)高效液相色譜技術(shù)采用凝膠色譜柱TSK-3000 SWxl (日本東洋曹達(dá) TOSOH 7.8 mmX 300 mm 5 u m)，用0.01 10 mmol/L的Na2S04洗脫，流速 為0.1 0.5ml/min，將有酶活力的部分收集，透析除鹽后濃縮。 在酶的濃縮部分可以采用以下三種方法之一進(jìn)行
(1) 采用超濾濃縮法
選擇1000 10000分子量的超濾膜，將小分子蛋白和金屬離子去除，達(dá)到 濃縮的目的。
(2) 采用聚乙二醇濃縮法 將所需濃縮的酶液裝于分子量為10000的透析袋內(nèi)后，置于4'C條件下的燒
杯中，向其中添加聚乙二醇，直到透析袋被覆蓋，當(dāng)透析袋內(nèi)溶劑滲出即被聚 乙二醇迅速吸去，從而達(dá)到濃縮的目的。
(3) 采用冷凍干燥技術(shù)
將得到的粗酶冷凍干燥得到干粉，將干粉復(fù)溶于l 2ml浸提液中，形成溶 液，以達(dá)到濃縮的目的。 本發(fā)明突出的優(yōu)點(diǎn)是
1. 首次從海參腸分離純化得到組織蛋白酶B。
2. 對(duì)組織蛋白酶B的研究為海參自溶過(guò)程生理生化變化機(jī)制和代謝途徑的研 究奠定基礎(chǔ)，為海參深加工研究提供理論依據(jù)。
3. 豐富了酶學(xué)理論，對(duì)海參自溶酶系的研究，將有助于延長(zhǎng)海參貯存期、優(yōu) 化加工條件及其開(kāi)發(fā)出更有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的功能性食品。
具體實(shí)施例方式
實(shí)例一
取新鮮活海參，去體壁后將海參腸清洗，去除泥沙和雜質(zhì)。將其用5倍海 參腸體積的0。C的含5mmol/LL-Cys (L-半胱氨酸)的5mmol/LpH 3.0的醋酸鈉 緩沖液勻漿破碎；在4。C下浸提4h，采用6000Xg (4°C)冷凍離心60min，取 上層清液。選擇硫酸銨飽和度為65%，進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，經(jīng)20000Xg(4"C) 冷凍離心60min后，取沉淀，將沉淀用50ml上述醋酸鈉緩沖液溶解，透析除鹽 后，超濾濃縮，即得到組織蛋白酶B粗酶。將得到的組織蛋白酶B粗酶過(guò)DEAE Sepharose CL-6B離子交換色譜柱，采用含0.5 2.0mmol/L的NaCl的50mmol/L
6L-Cys pH6.5的磷酸鈉緩沖液線性洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收 集。收集的酶液透析除鹽后，超濾濃縮，過(guò)SephacryllOOHR凝膠層析色譜柱， 將有酶活力的部分收集，透析除鹽，超濾濃縮。 實(shí)例二
取新鮮活海參，去體壁后將海參腸清洗，去除泥沙和雜質(zhì)。將其用3倍海 參腸體積的(TC的含1Ommol/L L-Cys (L-半胱氨酸)的5mmol/L pH 6.0的醋酸 鈉緩沖液勻漿破碎；在4t:下浸提6h，采用15000Xg (4°C)冷凍離心30min， 取上層清液。選擇硫酸銨飽和度為40%，進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，經(jīng)15000Xg(4°C) 冷凍離心60min后，取沉淀，將沉淀用50ml上述醋酸鈉緩沖液溶解，透析除鹽， 采用聚乙二醇法濃縮后，即得到組織蛋白酶B粗酶。將得到的組織蛋白酶B粗 酶過(guò)DEAE Sepharose CL-6B離子交換色譜柱，采用含0.01 1.0 mmol/L的NaCl 的20mmol/LL-Cys的pH6.0的磷酸鈉緩沖液線性洗脫，流速0.5ml/min，將有 酶活力的部分收集。收集的酶液透析除鹽，采用聚乙二醇法濃縮后，過(guò)G-75凝 膠色譜柱，采用含3.0mmol/L的NaCl的40mmol/L L-Cys的pH6.0的磷酸鈉緩 沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集，透析除鹽，采用聚乙二 醇法濃縮。
實(shí)例三
取新鮮活海參，去體壁后將海參腸清洗，去除泥沙和雜質(zhì)。將其用20倍海 參腸體積的(TC的含20mmol/L L-Cys (L-半胱氨酸)的150mmol/L pH 6.8的醋 酸鈉緩沖液勻漿破碎；在4。C下浸提15h，采用18000 Xg(4'C)冷凍離心10min， 取上層清液。選擇硫酸銨飽和度為卯％，進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，經(jīng)18000 Xg
(4°C)冷凍離心30min后，取沉淀，將沉淀用50ml上述醋酸鈉緩沖液溶解， 透析除鹽后，采用聚乙二醇法濃縮，即得到組織蛋白酶B粗酶。將得到的組織 蛋白酶B粗酶過(guò)DEAE Sepharose CL-6B離子交換色譜柱，采用含0.5 8.0 mmol/L的NaCl的20mmol/L L-Cys的pH6.5的磷酸鈉緩沖液線性洗脫，流速為 0.5ml/min，將有酶活力的部分收集。收集的酶液透析除鹽，采用聚乙二醇法濃 縮后，過(guò)Sephacryl 100 HR凝膠層析色譜柱，采用含5.0mmol/L的NaCl的 20mmol/LL-Cys的pH6.5的磷酸鈉緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力 的部分收集，透析除鹽，采用聚乙二醇法濃縮。
實(shí)例四取新鮮活海參，去體壁后將海參腸清洗，去除泥沙和雜質(zhì)。將其用15倍海 參腸體積的(TC的含100mmol/L L-Cys (L-半胱氨酸)的80mmol/L pH 5.5的醋 酸鈉緩沖液勻漿破碎；在4"C下浸提12h，采用20000 X g (4°C )冷凍離心40min， 取上層清液。選擇硫酸銨飽和度為85%，進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，經(jīng)20000 Xg(4'C ) 冷凍離心40min后，取沉淀，將沉淀用50ml上述醋酸鈉緩沖液溶解，透析除鹽 后，采用冷凍干燥技術(shù)濃縮，即得到組織蛋白酶B粗酶。將得到的組織蛋白酶 B粗酶過(guò)DEAE Sepharose CL-6B離子交換色譜柱，采用含0. 01 0.5 mmol/L的 NaCl的100mmol/LL-CyspH5.5的磷酸鈉緩沖液線性洗脫，流速為0.5ml/min， 將有酶活力的部分收集。收集的酶液透析除鹽，采用冷凍干燥技術(shù)濃縮后，過(guò) G-75凝膠色譜柱，采用含5mmol/L的NaCl的10Ommol/L L-Cys pH5.5的磷酸 鈉緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集。收集的酶液透析除 鹽，采用冷凍干燥技術(shù)濃縮后，上樣于高效液相凝膠色譜柱TSK-3000 SWxl， 用0.5mmol/L的Na2SO4洗脫，流速為0.1ml/min，將有酶活力的部分收集，透析 除鹽，采用冷凍干燥技術(shù)濃縮。
實(shí)例五
取新鮮活海參，去體壁后將海參腸清洗，去除泥沙和雜質(zhì)。將其用10倍海 參腸體積的0。C的含50mmol/LL-Cys (L-半胱氨酸)的50mmol/L pH 5.0的醋酸 鈉緩沖液勻漿破碎；在4'C下浸提18h,采用15000Xg (4°C)冷凍離心20min， 取上層清液。選擇硫酸銨飽和度為75%，進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，經(jīng)15000Xg(4 。C)冷凍離心30min后，取沉淀。將沉淀用50ml上述醋酸鈉緩沖液溶解，透析 除鹽后，采用冷凍干燥技術(shù)濃縮，即得到組織蛋白酶B粗酶。將得到的組織蛋 白酶B粗酶過(guò)DEAE Sepharose CL-6B離子交換色譜柱，采用含0.02 1.0 mmol/L 的NaCl的80mmol/L L-Cys pH5.0的磷酸鈉緩沖液線性洗脫，流速為0.5ml/min， 將有酶活力的部分收集。收集的酶液透析除鹽，采用冷凍干燥技術(shù)濃縮后，過(guò) G-75凝膠色譜柱，采用含0.2 mmol/L的NaCl的80mmol/L L-Cys的pH5.0的磷 酸鈉緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集。收集酶液透析除 鹽，采用冷凍干燥技術(shù)濃縮后，過(guò)SephacryllOOHR凝膠層析色譜柱，將有酶活 力的部分收集，透析除鹽，采用冷凍干燥技術(shù)濃縮。
實(shí)例六
取新鮮活海參，去體壁后將海參腸清洗，去除泥沙和雜質(zhì)。將其用12倍海
8參腸體積的(TC的含60mmol/L L-Cys (L-半胱氨酸)的100mmol/L pH 5.8的醋 酸鈉緩沖液勻漿破碎；在4'C下浸提10h，采用20000Xg(4°C)冷凍離心50min， 取上層清液。選擇硫酸銨飽和度為80%，進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，經(jīng)20000Xg(4 °C)冷凍離心50min后，取沉淀，將沉淀用50ml上述醋酸鈉緩沖液溶解，透析 除鹽后，采用冷凍干燥技術(shù)濃縮，即得到組織蛋白酶B粗酶。將得到的組織蛋 白酶B粗酶過(guò)DEAE Sepharose CL-6B離子交換色譜柱，采用含1.0 1.5 mmol/L 的NaCl的60mmol/L L-Cys的pH5.8的磷酸鈉緩沖液線性洗脫，流速為 0.5ml/min，將有酶活力的部分收集。收集的酶液透析除鹽，采用冷凍干燥技術(shù) 濃縮后，過(guò)Sephacryl 100 HR凝膠色譜柱，采用含50 mmol/L的NaCl的60mmol/L L-CyspH5.8的磷酸鈉緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集。 收集的酶液透析除鹽，采用冷凍干燥技術(shù)濃縮后，上樣于高效液相凝膠色譜柱 TSK-3000 SWxl，用0.1mmol/L的Na2S04洗脫，流速為0.15ml/min，將有酶活 力的部分收集，透析除鹽，采用冷凍干燥技術(shù)濃縮。
實(shí)例七
取新鮮活海參，去體壁后將海參腸清洗，去除泥沙和雜質(zhì)。將其用10倍海 參腸體積的(TC的含50mmol/LL-Cys (L-半胱氨酸)的50mmol/LpH 5.5的醋酸 鈉緩沖液勻漿破碎；在4"下浸提8h，采用8000Xg (4°C)冷凍離心20min， 取上層清液。選擇硫酸銨飽和度為60%，進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，經(jīng)8000Xg (4 。C)冷凍離心20min后，取沉淀，將沉淀用50ml上述醋酸鈉緩沖液溶解，透析 除鹽后，采用超濾濃縮，即得到組織蛋白酶B粗酶。將得到的組織蛋白酶B粗 酶過(guò)Sephacryl 100 HR凝膠層析色譜柱，采用含50mmol/L的NaCl的20mmol/L L-Cys的pH5.5的磷酸鈉緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收 集，透析除鹽，采用超濾濃縮后，過(guò)DEAE Sepharose CL-6B離子交換色譜柱， 采用含0.5 8.0 mmol/L的NaCl的20mmol/L L-Cys的pH5.5的磷酸鈉緩沖液線 性洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集。收集的酶液透析除鹽，采 用超濾濃縮后，過(guò)G-75凝膠色譜柱，采用含50 mmol/L NaCl的20mmol/L L-Cys pH5.5的磷酸鈉緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集。收集 的酶液透析除鹽，采用超濾濃縮。
實(shí)例八
取新鮮活海參，去體壁后將海參腸清洗，去除泥沙和雜質(zhì)。將其用5倍海參腸體積的0r的含40mmol/LL-Cys (L-半胱氨酸)的40mmol/L pH 5.0的醋酸 鈉緩沖液勻漿破碎；在4t下浸提6h，釆用12000Xg (4°C)冷凍離心40min， 取上層清液。選擇硫酸銨飽和度為65%，進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，經(jīng)12000Xg(4 °C)冷凍離心40min后，取沉淀，將沉淀用50ml上述醋酸鈉緩沖液溶解，透析 除鹽后，超濾濃縮，即得到組織蛋白酶B粗酶。將得到的組織蛋白酶B粗酶過(guò) G-75凝膠色譜柱，采用含50 mmol/L NaCl的20mmol/L L-Cys pH5.0的磷酸鈉 緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集。收集的酶液透析除鹽， 釆用超濾濃縮后，過(guò)DEAE Sepharose CL-6B離子交換色譜柱，采用含0.5 1.0 mmol/L的NaCl的40mmol/L L-Cys pH5.0的磷酸鈉緩沖液線性洗脫，流速為 0.5ml/min，將有酶活力的部分收集。收集的酶液透析除鹽后，超濾濃縮，過(guò) SephacryllOOHR凝膠層析色譜柱，將有酶活力的部分收集，透析除鹽，超濾濃 縮。
實(shí)例九
取新鮮活海參，去體壁后將海參腸清洗，去除泥沙和雜質(zhì)。將其用10倍海 參腸體積的(TC的含100mmol/LL-Cys (L-半胱氨酸)的100mmol/LpH 5.5的醋 酸鈉緩沖液勻漿破碎；在4。C下浸提15h，采用18000Xg(4'C)冷凍離心30min， 取上層清液。選擇硫酸銨飽和度為75%，進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，經(jīng)18000Xg (4 °C)冷凍離心30min后，取沉淀，將沉淀用50ml上述醋酸鈉緩沖液溶解，透析 除鹽后，采用冷凍干燥技術(shù)濃縮，即得到組織蛋白酶B粗酶。將得到的組織蛋 白酶B粗酶過(guò)G-75凝膠色譜柱，采用含50 mmol/L的NaCl的100mmol/L L-Cys pH6.5的磷酸鈉緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集。收集 的酶液透析除鹽，采用冷凍干燥技術(shù)濃縮后，過(guò)DEAE Sepharose CL-6B離子交 換色譜柱，采用含0. 01 0.5 mmol/L的NaCl的100mmol/LL-Cys pH6.5的磷酸 鈉緩沖液線性洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集。收集的酶液透 析除鹽，采用冷凍干燥技術(shù)濃縮后，上樣于高效液相凝膠色譜柱TSK-3000 SWxl， 用0.5mmol/L的Na2SO4洗脫，流速為0.1ml/min，將有酶活力的部分收集，透析 除鹽，釆用冷凍干燥技術(shù)濃縮。
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權(quán)利要求
1.海參腸道組織蛋白酶B的分離純化方法，其特征在于操作步驟為(1)海參處理取新鮮活海參，去體壁后將海參腸清洗，去除泥沙和雜質(zhì)；(2)粗酶提取將其用1～20倍海參腸體積的0℃的含5～200mmol/L L-Cys(L-半胱氨酸)的5～200mmol/L pH 3.0～6.8的醋酸鈉緩沖液勻漿破碎；在4℃下浸提4～18h，6000～20000×g冷凍離心5～60min，取上層清液用選擇好的硫酸銨飽和度進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，后4℃下經(jīng)6000～20000×g冷凍離心20～60min，取沉淀，并用上述醋酸鈉緩沖液溶解沉淀，透析除鹽后濃縮，即得到組織蛋白酶B粗酶；(3)酶的純化將得到的組織蛋白酶B粗酶用離子交換層析色譜、凝膠色譜和高效液相色譜中的2～3種方法達(dá)到純化的目的，其中離子交換層析色譜是必須使用的。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述海參腸道組織蛋白酶B的分離純化方法，其特征在 于步驟(2)粗酶提取中所述用選擇好的硫酸銨飽和度進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀是 在不同的硫酸銨飽和度下使不同的蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出，選擇目的蛋白的 最大飽和度作為硫酸銨的最終飽和度；具體步驟是取新鮮海參腸用5 200mmol/L pH 3.0 6.8的醋酸鈉緩沖液浸提，勻漿搗碎后經(jīng)冷凍離心5 60min，取上清液，平均分成6份后并在4'C和磁力攪拌下依次向上清液中加入 研磨后的硫酸銨，使其飽和度分別達(dá)到0%、 20%、 40%、 60%、 80%、 90% ， 靜置4h后，冷凍離心20 60min，取上清液測(cè)定酶活力,選取酶活力最大所在 的硫酸銨飽和度作為分級(jí)沉淀的條件。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述海參腸道組織蛋白酶B的分離純化方法，其特征在 于步驟(3)酶的純化中所述組織蛋白酶B粗酶用離子交換層析色譜進(jìn)行純化的 具體步驟為采用DEAESepharoseCL-6B離子交換層析色譜柱，以含0.01 10 mmol/L的NaCl的5 200mmol/L L-Cys的pH5.0 6.5的磷酸鈉緩沖液線性洗 脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集，透析除鹽后濃縮。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述海參腸道組織蛋白酶B的分離純化方法，其特征在 于步驟(3)酶的純化中所述組織蛋白酶B粗酶用凝膠色譜進(jìn)行純化，可以采用 G-75凝膠層析柱或/和SephacryllOOHR凝膠層析柱進(jìn)行純化，具體步驟為均采用含0.01 10 mmol/L的NaCl的5 200mmol/L L-Cys的pH5.0 6.5的磷酸 鈉緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集，透析除鹽后濃縮。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述海參腸道組織蛋白酶B的分離純化方法，其特征在 于步驟(3)酶的純化中所述組織蛋白酶B粗酶用高效液相色譜技術(shù)進(jìn)行純化是 采用TSK-3000 SWxl凝膠色譜柱，用0.01 10 mmol/L的Na2S04洗脫，流速為 0.1 0.5ml/min，將有酶活力的部分收集，透析除鹽后濃縮。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述海參腸道組織蛋白酶B的分離純化方 法，其特征在于所述的濃縮采用以下三種方法之一進(jìn)行(1) 超濾濃縮法選擇1000 10000分子量的超濾膜，將小分子蛋白和金屬離子去除，達(dá)到 濃縮的目的；(2) 聚乙二醇濃縮法將所需濃縮的酶液裝于分子量為10000的透析袋內(nèi)后，置于4t:條件下的燒 杯中，向其中添加聚乙二醇，直到透析袋被覆蓋，當(dāng)透析袋內(nèi)溶劑滲出即被聚 乙二醇迅速吸去，從而達(dá)到濃縮的目的；(3) 采用冷凍干燥技術(shù)將得到的粗酶冷凍干燥得到干粉，將干粉復(fù)溶于l 2ml浸提液中，形成溶 液，以達(dá)到濃縮的目的。
全文摘要
海參腸道組織蛋白酶B的分離純化方法，在4℃下用含L-Cys的醋酸鈉緩沖液對(duì)海參腸勻漿破碎緩沖液浸提，采用硫酸銨分級(jí)沉淀，沉淀再用上述醋酸鈉緩沖液溶解沉淀，透析除鹽后濃縮得到組織蛋白酶B粗酶。將得到的組織蛋白酶B粗酶用離子交換層析色譜、凝膠色譜和高效液相色譜中的2～3種方法達(dá)到純化的目的。
文檔編號(hào)C12N9/64GK101565696SQ20091001189
公開(kāi)日2009年10月28日 申請(qǐng)日期2009年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月5日
發(fā)明者蕾 于, 晶 劉, 吳海濤, 周大勇, 孫黎明, 宮國(guó)君, 朱蓓薇, 董秀萍 申請(qǐng)人:大連工業(yè)大學(xué)