專利名稱：能夠同時(shí)發(fā)酵葡萄糖、甘露糖和木糖的細(xì)菌和使用該細(xì)菌生產(chǎn)生物乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠同時(shí)發(fā)酵葡萄糖、甘露糖和木糖的發(fā)酵細(xì)菌菌株和用于使用該細(xì) 菌菌株從纖維素類型或木質(zhì)纖維素類型生物質(zhì)生產(chǎn)生物乙醇的方法。背景領(lǐng)域在日本，不用的生物質(zhì)源即纖維素類型工業(yè)(一般)廢料例如森林撫育間伐 (forest thinning)、施工廢棄物(construction waste materials)、稻草禾口谷殼以及 舊紙和廢紙的產(chǎn)量達(dá)到每年5千萬噸。此類生物質(zhì)作為能源的用途被認(rèn)為是“碳中和 (carbon-neutral) ”，因?yàn)樗鼈儾粩_亂全球C02平衡，從而高度期望生物質(zhì)作為促進(jìn)溫室氣 體減少的能源。在這樣的情況下，已提出并且研究了從不用的纖維素類型或木質(zhì)素類型生 物質(zhì)源產(chǎn)生生物燃料和使用產(chǎn)生的生物乙醇作為合成用于加入汽油或化學(xué)制品的含氧化 合物的原料或作為區(qū)域熱源和電力源。然而，自然界中不存在可獲得的通過直接降解和發(fā)酵纖維素類型或木質(zhì)纖維素類 型生物質(zhì)源生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵細(xì)菌。因此，期望通過使用代謝工程技術(shù)和細(xì)胞表面呈現(xiàn)技術(shù) (cell surface presentation technology)產(chǎn)生發(fā)酵細(xì)菌，所述細(xì)菌能夠同時(shí)發(fā)酵以混合 物的形式存在于纖維素和半纖維素的酸處理糖化溶液中的纖維素部分降解產(chǎn)物(纖維素 寡糖)、木糖和甘露糖并且將其轉(zhuǎn)化成乙醇。還期望構(gòu)建新型節(jié)能高效轉(zhuǎn)化方法，在該方法 中整合了具有培育的發(fā)酵菌株作為催化劑成分的連續(xù)發(fā)酵裝置。本發(fā)明者之前通過將編碼至少一種酶(選自木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、轉(zhuǎn)醛醇酶 和轉(zhuǎn)酮醇酶)的外源基因?qū)氩荒軌蛲焯堑陌l(fā)酵細(xì)菌屬(Zymobacter)的微生物成功 地產(chǎn)生了能夠從戊糖生產(chǎn)乙醇的轉(zhuǎn)化微生物(專利文獻(xiàn)1)。為了從含有甘露糖的原料高 效地生產(chǎn)乙醇，本發(fā)明者還通過將編碼磷酸甘露糖異構(gòu)酶的外源基因整合入發(fā)酵單胞菌屬 (Zymomonas)的細(xì)菌的染色體(以為細(xì)菌提供穩(wěn)定的甘露糖發(fā)酵能力)成功能地產(chǎn)生重組 微生物(專利文獻(xiàn)2)。專利文獻(xiàn)1 JP 2005-261421A專利文獻(xiàn)2 JP 2007-14306A本發(fā)明的公開內(nèi)容有待本發(fā)明解決的問題本發(fā)明的目的是產(chǎn)生能夠同時(shí)發(fā)酵葡萄糖、甘露糖和木糖的發(fā)酵細(xì)菌，其可通過 同時(shí)將存在于糖化溶液(獲自草本來源和特別地木質(zhì)來源的纖維素類型和木質(zhì)纖維素類 型生物質(zhì)源)中的纖維寡糖、木糖和甘露糖發(fā)酵和轉(zhuǎn)化成乙醇來生產(chǎn)乙醇。本發(fā)明的另一 個(gè)目的是建立適合于實(shí)際用途的新型節(jié)能高效生物乙醇轉(zhuǎn)化方法。用于解決問題的方法發(fā)酵單胞菌屬的細(xì)菌已知為用于釀造龍舌蘭酒(tequila)的細(xì)菌，與常規(guī)釀酒酵 母相比，此類細(xì)菌在乙醇發(fā)酵的速度和生產(chǎn)率上優(yōu)良3至5倍，并且在每單位細(xì)菌細(xì)胞乙醇 的生產(chǎn)率上優(yōu)于酵母。然而，發(fā)酵單胞菌屬的細(xì)菌不能夠發(fā)酵存在于纖維素類型或木質(zhì)纖維素類型生物質(zhì)源中的麥芽糖或木糖來生產(chǎn)乙醇。本發(fā)明者的目的在于發(fā)酵單胞菌屬的細(xì)菌的優(yōu)良乙醇生產(chǎn)率，并且假定能夠同時(shí) 發(fā)酵葡萄糖、甘露糖和木糖的細(xì)菌可通過應(yīng)用由本發(fā)明者提交的上述專利文獻(xiàn)1和2中描 述的技術(shù)生成，以完成上述目的。因此，作為詳盡研究的結(jié)果，本發(fā)明者已完成了本發(fā)明。gp，本發(fā)明提供了 (1)能夠同時(shí)發(fā)酵葡萄糖、甘露糖和木糖的發(fā)酵細(xì)菌，其為包含整合入(按照同源 重組法，通過雙交換)位于染色體上的蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶(Ievansucrase)基因的大腸 桿菌(E. coli)來源的編碼磷酸甘露糖異構(gòu)酶的基因和導(dǎo)入的重組DNA的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌 (Zymomonas mobilis)，所述導(dǎo)入的重組DNA通過將包含分別編碼木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、 轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶的基因(全部都為大腸桿菌來源)的DNA片段連接至載體來形成；(2)根據(jù)上述⑴的發(fā)酵細(xì)菌，其可通過使用高蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生性菌株 作為宿主菌株而獲得；(3)根據(jù)上述(2)的發(fā)酵細(xì)菌，其中宿主菌株是運(yùn)動發(fā)酵單胞菌ZMcs(FERM BP-I1024)；(4)根據(jù)上述(3)的發(fā)酵細(xì)菌，其為運(yùn)動發(fā)酵單胞菌ZM mx42(FERMBP-11025)。(5)用于生產(chǎn)乙醇的方法，其包括使纖維素類型和/或木質(zhì)纖維素類型生物質(zhì)源 的糖化溶液和根據(jù)權(quán)利要求1的能夠同時(shí)發(fā)酵葡萄糖、甘露糖和木糖的發(fā)酵細(xì)菌(其已被 固定在固定的載體上)彼此接觸，從而發(fā)酵糖化溶液以獲得發(fā)酵溶液，以及從發(fā)酵溶液回 收乙醇；(6)根據(jù)上述(5)的生產(chǎn)乙醇的方法，其中發(fā)酵細(xì)菌是運(yùn)動發(fā)酵單胞菌ZM mx42(FERM BP-I1025)；(7)根據(jù)上述(5)的生產(chǎn)乙醇的方法，其中生物質(zhì)源是木質(zhì)生物質(zhì)源；和(8)根據(jù)上述(5)的生產(chǎn)乙醇的方法，其中將糖化溶液連續(xù)進(jìn)料入充填有固定化 發(fā)酵細(xì)菌的反應(yīng)器，從而使糖化溶液與發(fā)酵細(xì)菌彼此接觸，以獲得發(fā)酵溶液，連續(xù)收集發(fā)酵 溶液，以及從其回收乙醇。本發(fā)明的效果在從木質(zhì)和草質(zhì)生物質(zhì)源的酸處理糖化溶液高效生產(chǎn)乙醇中，為待使用的細(xì)菌提 供葡萄糖、甘露糖和木糖的同時(shí)發(fā)酵能力是非常重要的，所述葡萄糖、甘露糖和木糖來源于 纖維素和半纖維素并且作為混合物存在于糖化溶液中。然而，運(yùn)動發(fā)酵單胞菌不具有甘露 糖或木糖的發(fā)酵能力，雖然其具很強(qiáng)的葡萄糖發(fā)酵能力。至于甘露糖發(fā)酵能力，運(yùn)動發(fā)酵單胞菌不能充足地表達(dá)甘露糖激酶和磷酸甘露糖 異構(gòu)酶，特別地磷酸甘露糖異構(gòu)酶(其是甘露糖代謝不可缺少的)。根據(jù)本發(fā)明，可能通過 導(dǎo)入和表達(dá)大腸桿菌來源的磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(manA)為運(yùn)動發(fā)酵單胞菌提供甘露糖 發(fā)酵能力，以及通過將基因整合入染色體進(jìn)一步產(chǎn)生穩(wěn)定的甘露糖發(fā)酵能力。此外，雖然細(xì) 菌中木糖的代謝通常需要4種酶，即木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶以及轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶， 所述酶是磷酸戊糖途徑的必需酶，但運(yùn)動發(fā)酵單胞菌缺少木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶，從而 不能夠利用木糖。因此，根據(jù)本發(fā)明，可通過導(dǎo)入木糖異構(gòu)酶基因(xylA)、木酮糖激酶基因 (xylB)、轉(zhuǎn)醛醇酶基因(tal)和轉(zhuǎn)酮醇酶基因(tktA)(全部都為大腸桿菌來源)為運(yùn)動發(fā) 酵單胞菌提供木糖發(fā)酵能力。因此，可通過導(dǎo)入manA基因和木糖代謝的酶系統(tǒng)的基因來給運(yùn)動發(fā)酵單胞菌提供三種糖即葡萄糖、木糖和甘露糖的發(fā)酵能力?？赏ㄟ^將所產(chǎn)生的能夠同時(shí)發(fā)酵葡萄糖、甘露糖和木糖的細(xì)菌菌株固定在固定載 體上以構(gòu)建用于生物乙醇的連續(xù)產(chǎn)生的反應(yīng)器，并且將生物質(zhì)源的糖化溶液連續(xù)導(dǎo)入反應(yīng) 器以使糖化溶液與發(fā)酵細(xì)菌菌株彼此接觸來進(jìn)行乙醇發(fā)酵。附圖概述

圖1是舉例說明用于將manA整合入染色體DNA的方法的圖解。圖2是舉例說明用于克隆大腸桿菌來源的manA的方法的圖解。圖3是舉例說明用于構(gòu)建用于染色體DNA的整合的重組質(zhì)粒pUZE2d’ -manA的方 法的限制性圖譜。圖4是舉例說明用于構(gòu)建pUC118-xylAB的方法的限制性圖譜。圖5是舉例說明用于構(gòu)建pUC118-tal的方法的限制性圖譜。圖6是舉例說明用于構(gòu)建pUC118-tkt的方法的限制性圖譜。圖7是舉例說明用于構(gòu)建pUC118-tal+tkt的方法的限制性圖譜。圖8是舉例說明用于構(gòu)建pZA22_xt的方法的限制性圖譜。圖9是舉例說明實(shí)施例2(4)中木糖的發(fā)酵測試的結(jié)果的圖。圖10是舉例說明為細(xì)菌菌株提供葡萄糖、甘露糖和木糖的同時(shí)發(fā)酵能力的方法 的圖解。圖11a是舉例說明實(shí)施例3中培育的菌株的發(fā)酵測試的結(jié)果的圖解。圖lib是舉例說明實(shí)施例3中培育的菌株的發(fā)酵測試的結(jié)果的圖。圖12a是舉例說明實(shí)施例4中廢木料糖化溶液的發(fā)酵測試的結(jié)果的圖。圖12b是舉例說明實(shí)施例4中廢木料糖化溶液的發(fā)酵測試的結(jié)果的圖。圖13是舉例說明用于實(shí)施例5中的連續(xù)發(fā)酵的條件的反應(yīng)器的示意圖。圖14是舉例說明實(shí)施例6中模型酸處理糖化溶液的連續(xù)發(fā)酵的結(jié)果的圖。圖15是舉例說明實(shí)施例6中初始培養(yǎng)基pH在模型酸處理糖化溶液的連續(xù)發(fā)酵中 的影響的圖。圖16是舉例說明實(shí)施例6中廢木料的酸處理糖化溶液的連續(xù)發(fā)酵的結(jié)果的圖。圖17是舉例說明實(shí)施例中6中使用酸處理糖化溶液進(jìn)行連續(xù)乙醇生產(chǎn)的結(jié)果的 圖。用于進(jìn)行本發(fā)明的最佳模式宿主菌株根據(jù)本發(fā)明已向其提供了甘露糖發(fā)酵能力的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌可以是通常用于乙 醇生產(chǎn)的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌，但從增加木糖發(fā)酵能力的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選的是在下文中描述的 高蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生性菌株，其作為天然突變的結(jié)果而發(fā)生并且產(chǎn)生比野生型菌 株所產(chǎn)生的更大量的蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶。為細(xì)菌菌株提供甘露糖發(fā)酵能力編碼用于提供甘露糖發(fā)酵能力的磷酸甘露糖異構(gòu)酶(manA)的基因可從大腸桿菌 獲得，所述大腸桿菌是能夠降解甘露糖的供體微生物。分離和純化編碼供體微生物的磷酸甘露糖異構(gòu)酶的DNA，然后通過各種方法切割 DNA以獲得DNA片段。此外，利用例如DNA連接酶將DNA片段連接至可根據(jù)相同方式獲得的載體DNA片段以形成含有磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因的重組DNA。可以例如通過使用可商 購獲得的DNA提取試劑盒，按照相關(guān)領(lǐng)域中的已知方法例如Molecular Cloning，第3版 (J. Sambrook，等人，Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中描述的方法進(jìn)行技術(shù)例如 DNA的分離和純化、DNA片段的制備和利用DNA連接酶進(jìn)行的連接?？梢园凑找阎耐粗亟M方法，通過雙交換進(jìn)行至染色體內(nèi)的整合。即，將蔗糖 6-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因克隆為運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的染色體靶基因，然后將編碼磷酸甘露糖異構(gòu) 酶的外源基因插入已在體外克隆的染色體靶基因來制備其中靶基因的部分分別連接至外 源基因的上游和下游的DNA，接著將該DNA整合入位于運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的染色體上的靶基 因。例如，如圖1中所示，使蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因(在下文中稱為E2)與運(yùn)動發(fā)酵單 胞菌的染色體DNA上的轉(zhuǎn)化酶(在下文中稱為E3)協(xié)同作用。這兩種酶存在于運(yùn)動發(fā)酵單 胞菌的細(xì)胞表面上，利用蔗糖作為底物釋放果糖，從而催化轉(zhuǎn)移反應(yīng)以形成果聚糖。靶向E2 位點(diǎn)，使用同源重組方法通過雙交換將磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因整合入其中以缺失E2。作為 結(jié)果，可能從形成果聚糖的果糖生產(chǎn)乙醇。在另一方面，與導(dǎo)入載體的菌株不同，導(dǎo)入的基 因的穩(wěn)定性增加。因此，不需要試劑例如標(biāo)記。用于提供木糖發(fā)酵能力的重組載體的構(gòu)建作為能夠降解木糖的微生物，大腸桿菌用作DNA供體，將編碼木糖異構(gòu)酶、木酮糖 激酶、轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶的DNA從其分離并且進(jìn)行純化。然后，通過各種方法切割DNA以 制備編碼酶的片段。通過例如DNA連接酶將此類DNA片段連接至合適的載體DNA片段。從 而形成含有木糖異構(gòu)酶基因、木酮糖激酶基因、轉(zhuǎn)醛醇酶基因和轉(zhuǎn)酮醇酶基因的重組DNA?？赏ㄟ^本身已知的方法，例如由Saito和Miura (Biochem. Biophys. Acta,第72卷， 619-629，1963)提出的方法或其改良方法，或使用商業(yè)DNA提取試劑盒的方法從供體分離 和純化DNA。通過例如限制性內(nèi)切酶切割獲得的供體微生物的DNA，通過蔗糖密度梯度方法除 去短于Ikbp的DNA片段。然后，可將剩余的片段用作供體DNA片段。此時(shí)使用的限制性內(nèi) 切酶不受特別限制，除了上述酶促方法外，還可能通過使用例如超聲或物理剪力切割DNA。 此時(shí)，優(yōu)選，使用例如Klenow片段或酶例如DNA聚合酶或綠豆核酸酶處理供體DNA片段的 末端，因?yàn)殡S后與載體DNA結(jié)合的效率增加。此外，通過使用供體微生物的DNA或其片段作 為模板獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物也可直接用作供體DNA片段或在應(yīng)用上述處理后用作供體DNA 片段。載體DNA片段不受特別限定，但是例如可適當(dāng)?shù)厥褂么┧筝d體pZA22?？稍谂c供體DNA片段結(jié)合反應(yīng)前使用堿性磷酸酶處理獲得的載體DNA片段，從而， 增強(qiáng)片段與供體DNA片段的連接效率。此外，在通過PCR擴(kuò)增制備供體DNA片段的情況下， 還可通過預(yù)先使用引物(其在擴(kuò)增片段的兩個(gè)末端上提供限制性位點(diǎn)例如EcoRI)來增加 連接效率，同時(shí)通過用與用于切割擴(kuò)增片段的限制性內(nèi)切酶相同的限制性內(nèi)切酶切割載體 來制備待使用的載體片段。供體DNA片段和載體DNA片段的連接反應(yīng)可通過使用常規(guī)方法 例如使用已知的DNA連接酶的方法來進(jìn)行。例如，在將供體DNA片段和載體DNA片段退火 后，可在適當(dāng)?shù)腄NA連接酶的作用下離體產(chǎn)生重組DNA。需要時(shí)，在退火后，可將片段導(dǎo)入宿 主微生物，可通過利用體內(nèi)DNA修復(fù)能力產(chǎn)生重組DNA。具有葡萄糖、甘露糖和木酮的同時(shí)發(fā)酵能力的細(xì)菌菌株的產(chǎn)生
將含有木糖異構(gòu)酶基因、木酮糖激酶基因、轉(zhuǎn)醛醇酶基因和轉(zhuǎn)酮醇酶基因的重組 DNA載體導(dǎo)入上面獲得的已為其提供了甘露糖發(fā)酵能力的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌。用于導(dǎo)入重組DNA載體的方法不受特別限定，但通過利用電刺激的方法例如電穿 孔適當(dāng)?shù)貙?dǎo)入重組DNA。將已向其中導(dǎo)入重組DNA載體的菌株培養(yǎng)在木糖平板培養(yǎng)基上，將在其上形成的 集落培養(yǎng)在含有木糖和甘露糖作為碳源的液體培養(yǎng)基中。監(jiān)控生長，選擇在木糖和甘露糖 的碳源中都展示高生長的轉(zhuǎn)化菌株以獲得能夠同時(shí)發(fā)酵葡萄糖、甘露糖和木糖的期望的細(xì) 菌株。用于來自生物質(zhì)源的糖化溶液的連續(xù)發(fā)酵反應(yīng)器的構(gòu)建本發(fā)明的發(fā)酵細(xì)菌可用于從木質(zhì)類型或草質(zhì)類型的任何生物質(zhì)源的糖化溶液生 產(chǎn)乙醇，但考慮到其高乙醇生產(chǎn)率，細(xì)菌可適合用于從木質(zhì)生物質(zhì)源的糖化溶液生產(chǎn)乙醇。例如，通過化學(xué)或物理處理水解原料木材來制備糖化溶液，該溶液用作用于發(fā)酵 的原料。該木材的糖化溶液包含來源于作為木材的組成成分的纖維素和半纖維素的葡萄 糖、木糖和甘露糖的混合物。迄今，一直通過使用酵母(所述酵母用作常規(guī)啤酒釀造者的真菌)的木材的糖化 溶液的分批類型或連續(xù)類型發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇。在這樣的生產(chǎn)方法中，木材的糖化溶液中 包含的木糖或甘露糖(大約20%)不能被轉(zhuǎn)化成生物乙醇。因此，從木材的糖化溶液回收 生物乙醇只限定于來自葡萄糖組分的生物乙醇(大約50%)。這是增加生物乙醇的成本的因素。在本發(fā)明中，可通過使用上述發(fā)酵細(xì)菌菌株，通過將木材的糖化溶液連續(xù)補(bǔ)料至 反應(yīng)器(所述反應(yīng)器充填有已固定在固定化載體上的細(xì)菌菌株，從而允許糖化溶液與發(fā)酵 細(xì)菌菌株彼此接觸)來以高回收率高速地生產(chǎn)生物乙醇。因此，可能獲得相應(yīng)于木糖和甘 露糖的量的大約20%的生物乙醇的進(jìn)一步回收和成本下降(當(dāng)與常規(guī)方法相比較時(shí))?？砂凑毡旧硪阎姆椒ɡ绨?inclusion method)、物理吸附法或共價(jià)鍵合 法進(jìn)行至固定載體的固定。適合的載體是具有例如中空形狀、凹凸形狀或多孔形狀和具有每單位體積大表面 積的載體或通過吸水膨脹的載體。適當(dāng)?shù)妮d體應(yīng)當(dāng)具有流動性和足夠的顆粒大小和比重， 以防止其容易地流出反應(yīng)系統(tǒng)。載體可以以例如板、纖維、特殊形狀例如圓柱形、海綿、顆粒 或團(tuán)塊或立方體的形式存在。在它們當(dāng)中，由于容易獲得流動性和充足的表面積，微粒劑是 優(yōu)選的?？捎玫牟牧习ǜ鞣N有機(jī)和無機(jī)材料，所述材料已常規(guī)用作用于微生物或酶的載 體的材料。其實(shí)例包括無機(jī)材料例如顆?；钚蕴肌⒎勰罨钚蕴?、木炭、沸石、云母和沙粒； 樹脂材料例如光敏樹脂(photocurable resin)、聚氨基甲酸乙酯(polyurethane)、聚乙烯 醇、聚乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚丙烯、瓊脂、海藻酸、角叉菜膠、纖維素、葡聚糖、瓊脂糖和 離子交換樹脂；多孔陶瓷例如硅膠；無煙煤(anthracite)；硅藻土 ；和樹脂材料與活性碳的 混合物。它們可單獨(dú)使用或以其兩種或更多種的組合使用。通常通過用固定載體充填生物反應(yīng)器來使用固定載體。根據(jù)機(jī)制和功能的差異， 用于發(fā)酵的生物反應(yīng)器的實(shí)例包括完全混合罐類型、填充床類型、膜類型、流化床(fluid bed type)和臥式類型(horizontal type)的反應(yīng)器。這樣的生物反應(yīng)器是適合使用的，因 為所述生物反應(yīng)器使得可能進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵而不需要微生物的進(jìn)料和回收。
當(dāng)如上所述進(jìn)行乙醇發(fā)酵時(shí)，必要時(shí)可將用于微生物的各種營養(yǎng)物來源整合入糖 化溶液中，以及可將例如，酵母提取物、玉米漿、蛋白胨、肉膏(meat extract)和鰹提取物 (bonito extract)用作氮源。在下文中，通過下列實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明，但本發(fā)明無意限定于其。實(shí)施例1磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(manA)的整合(1)大腸桿菌(E. coli)來源的磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(manA)的克隆使用表1中顯示的合成的寡核苷酸的組合，通過PCR擴(kuò)增含有靶基因的DNA片段， 所述寡核苷酸是基于已知的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Zm. mobilis)來源的3-磷酸甘油醛脫氫酶基 因序列(J. Bacteriol.第169卷(12)，5653-5662，1987)和已知的大腸桿菌來源的manA核 苷酸序列(Gene 32 (1-2)，41-48 (1984))設(shè)計(jì)的。首先，使用運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(IF013756)的野生型菌株的染色體DNA(Chr. DNA)作 為模板進(jìn)行第一 PCR以擴(kuò)增gap啟動子。類似地，使用大腸桿菌K12菌株的Chr. DNA作為 模板擴(kuò)增manA。然而，將兩個(gè)PCR產(chǎn)物用于形成異源雙鏈(hetero-double strand)。進(jìn)行 第二 PCR以構(gòu)建gap-manA片段，然后將該片段連接至載體pUC118的HincII位點(diǎn)。用所得 的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株。對插入片段進(jìn)行測序，作為結(jié)果，插入片段的核苷酸序列經(jīng)確認(rèn)與數(shù)據(jù)庫中記錄 的manA的核苷酸序列一致。因此，將產(chǎn)物稱為pUCl 18-manA.圖2概述了該克隆操作。表 1manA 引物manA(l) (SEQ ID NO 1)CGGAATTCGTTCGATCAACAACCCGAATCCTATCGmanA(2) (SEQ ID NO 2)CTTAATAAGTTAGGAGAATAAACATGCAAAAACTCATTAACTCAGTGCAAmanA(3) (SEQ ID NO 3)TTGCACTGAGTTAATGAGTTTTTGCATGTTTATTCTCCTAACTTATTAAGmanA (4) (SEQ ID NO 4)CGCGGATCCTTACAGCTTGTTGTAAACACGCGCTA(2)用于染色體整合的載體pUZE2d’ -manA的構(gòu)建圖3是舉例說明通過靶向E2位點(diǎn)來構(gòu)建用于染色體整合的載體的構(gòu)建的圖。用Ndel處理載體pUZE2d(4. 8kb)，進(jìn)行平端處理，然后用BAPP處理以切取DNA。 此外，用 BamHI 和 EcoRI 從 pUC118_manA(4. 8kb)降解(digest) Pgap-manA (1. 5kb)，然后平 端化以切取manA片段。然后使用Ligation High和T4連接酶在4°C和16°C下進(jìn)行連接過 夜，通過熱激法進(jìn)行大腸桿菌JM109菌株的轉(zhuǎn)化以提取質(zhì)粒。使用表2中顯示的manA(l) 和manA(4)引物，通過PCR從提取的質(zhì)粒確認(rèn)1. 5kbp的manA片段，所述引物是基于已知的 運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的基因組 E2 序列(Biosci. Biotech. Biochem.，59 (2)，289-293 (1995) ；DNA 登錄號D17524(DDBJ，EMBL))設(shè)計(jì)的。此外，當(dāng)用EcoRV和Kpnl降解質(zhì)粒時(shí)，檢測到5. 3kbp 片段的條帶，這顯示片段由相對于E2基因以正向存在的4. 8kbp和1. 5kbp片段組成。根據(jù)該結(jié)果，將質(zhì)粒稱為質(zhì)粒pUZE2d’ -manA。表2E2 引物E2(l) (SEQ ID NO 5)ACTTAATAAGTTAGGAGAATAAACATGTTGAATAAAGCAGGCATTGCAGAE2(2) (SEQ ID NO 6)GCTCTAGATCATTATTTATTCAATAAAGACAGGGCE2(3) (SEQ ID NO 7)AGCAAATAATTTCTGGGATTTCCGCE2(4) (SEQ ID NO 8)AGGCCGCTCCGTCTGG(3)manA至運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的染色體DNA內(nèi)的整合的確認(rèn)選擇大量產(chǎn)生蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株(其來源于通過自然突變產(chǎn)生的運(yùn)動 發(fā)酵單胞菌IF013756(在下文中稱為ZM ms菌株))作為宿主菌株，使用高濃度質(zhì)粒溶液，通 過電穿孔方法進(jìn)行宿主菌株的轉(zhuǎn)化。然后，進(jìn)行3次連續(xù)傳代培養(yǎng)，將培養(yǎng)物用于2%甘露 糖-RM平板。從應(yīng)用后第3天開始，將培養(yǎng)物連續(xù)培養(yǎng)大約2周，任意地選擇生長在其中的 大集落，將其接種入2%甘露糖-RM液體培養(yǎng)基。從培養(yǎng)細(xì)胞的懸浮液收獲細(xì)菌細(xì)胞，用無 菌Mi 11 iQ水清洗細(xì)胞一次，然后將其懸浮于ImL的無菌Mi 11 iQ水中以制備用于DNA提取的 樣品。使用manA引物HianA(I)和manA (4)以及E2引物E2(l)和E2 (2)將50 μ L提取物中 的1 μ L經(jīng)歷PCR擴(kuò)增。作為結(jié)果，在使用manA引物的擴(kuò)增中檢測到manA片段(1. 5kbp)， 在使用E2引物的擴(kuò)增中在2. Skbp處檢測到條帶。該結(jié)果顯示manA插入在染色體DNA的 E2位點(diǎn)上，因?yàn)?. 8kbp相應(yīng)于通過將manA (1.5kbp)整合入E2(1.3kbp)而制備的片段的長 度。自2007年8月13日以來，菌株ZM ms由日本產(chǎn)業(yè)技術(shù)總合研究所國際專利生物 保藏所(International Patent Organism Depository,NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology), tsukuba Central6,1-1-lHigashi, Tsukuba
305-8566，Japan在布達(dá)佩斯條約的條款下于登1錄號FERM BP-11204下保藏。、實(shí)施例2為細(xì)菌菌株提供木糖的同時(shí)發(fā)酵能力為了將大腸桿菌來源的木糖代謝系統(tǒng)中的酶的基因?qū)脒\(yùn)動發(fā)酵單胞菌，首先， 使用載體PUC118將xylA、xylB、tal和tktA的基因在大腸桿菌中克隆，然后插入用于大腸 桿菌和運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的穿梭載體PZA22以構(gòu)建重組質(zhì)粒pZA22-xt。然后，將pZA22_xt導(dǎo) 入已通過將manA整合入其染色體而為其提供了甘露糖發(fā)酵能力的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌。從而， 為菌株提供了葡萄糖、木糖和甘露糖的同時(shí)發(fā)酵能力。(l)pUC118-xylAB 的構(gòu)建通過PCR從大腸桿菌基因組DNA克隆必需基因。此外，將用于控制3_磷酸甘油醛 脫氫酶的表達(dá)的啟動子基因(GAP啟動子)(據(jù)報(bào)導(dǎo)其在運(yùn)動發(fā)酵單胞菌細(xì)胞中大量表達(dá)) 用于在運(yùn)動發(fā)酵單胞菌細(xì)胞中表達(dá)導(dǎo)入的4種酶基因。
通過PCR克隆大腸桿菌來源的木糖異構(gòu)酶基因和木酮糖激酶基因。S卩，基于已 知的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌來源的3-磷酸甘油醛脫氫酶的基因序列(J. Bacteriol.，第169卷 (12), 5653-5662,1987)和已知的大腸桿菌來源的木糖異構(gòu)酶基因和木酮糖激酶基因的核 苷酸序列(Appl. Environ. Microbiol.，第47卷(1)，15-21，1984)設(shè)計(jì)表3中顯示的4種類 型的PCR引物，以制備DNA片段，其中將大腸桿菌來源的木糖異構(gòu)酶基因和木酮糖激酶基因 串連在運(yùn)動發(fā)酵單胞菌來源的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子基因的下游離，分別在 DNA片段的兩個(gè)末端上提供用于克隆的EcoRI限制性切割位點(diǎn)。表3XYL 引物XYLl (SEQ ID NO 9)CGGAATTCGTTCGATCAACAACCCGAATCCTATCGXYL2(SEQ ID NO 10)TACTGGAATAAATGGTCTTCGTTATGCAAGCCTATTTTGACCAGCCTCGATXYL3(SEQ ID NO 11)ATCGACTGGTCAAAATAGGCTTGCATAACGAAGACCATTTATTCCAGTAXYL4(SEQ ID NO 12)CGGAATTCATGCATAGTTGCCAAAAGTTGCTGTCA對于第一 PCR，通過使用從運(yùn)動發(fā)酵單胞菌細(xì)胞制備的基因組DNA (作為模板)以 及引物XYLl和XYL3來擴(kuò)增含有木糖異構(gòu)酶基因的啟動子和N末端位點(diǎn)的大約300bp的 DNA片段。在另一方面，通過使用大腸桿菌基因組DNA(作為模板)以及引物XYL2和XYL4 來擴(kuò)增含有啟動子基因的一部分、木糖異構(gòu)酶基因和木酮糖激酶基因的大約3. Okbp的DNA 片段。然后，將含有啟動子基因的DNA片段與含有木糖異構(gòu)酶基因和木酮糖激酶基因的DNA 片段混合并且在94°C下加熱20分鐘。將混合物在37°C下保持15分鐘以形成異源雙鏈體。 在TaqDNA聚合酶存在的情況下，讓異源雙鏈體在72°C下反應(yīng)3分鐘。向該反應(yīng)混合物中 加入引物XYLl和引物XYL4，進(jìn)行第二 PCR以擴(kuò)增大約3. 2kbp的片段，在該片段中，Gap啟 動子基因、木糖異構(gòu)酶基因和木酮糖激酶基因以該順序連接。在將該DNA片段的兩個(gè)末端 經(jīng)歷平端化反應(yīng)后，將DNA片段與用HincII限制性內(nèi)切酶切割的用于大腸桿菌的載體質(zhì)粒 DNA PUC118的片段混合，然后用T4連接酶連接以產(chǎn)生重組質(zhì)粒DNA。根據(jù)常規(guī)方法將所產(chǎn) 生的重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，然后將轉(zhuǎn)化菌株用于含有50yg/mL氨芐青霉素、 0. ImM異丙基-β -D-硫代半乳糖苷和20 μ g/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-半乳糖吡 喃糖苷的LB平板培養(yǎng)基(1% Bacto Tripton,0. 5%酵母提取物、1 % NaCl和1. 5%瓊脂) 以形成集落。從形成白色集落的轉(zhuǎn)化菌株提取的重組質(zhì)粒稱為pUC118-xylAB。圖4概述該操作。(2)pUC118_taltktA 的構(gòu)建轉(zhuǎn)醛醇酶基因和轉(zhuǎn)酮醇酶基因在大腸桿菌基因組DNA上不構(gòu)成操縱子，并且它們 的位置彼此遠(yuǎn)離。因此，分別克隆轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶，然后連接以使它們受運(yùn)動發(fā)酵單胞 菌來源的GAP啟動子控制。為此目的，基于已知的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌來源的烯醇化酶的基因 序列和已知的大腸桿菌來源的轉(zhuǎn)醛醇酶基因(Nucleic Acids Res.，第20卷，3305-3308， 1992)設(shè)計(jì)表4中顯示的4種類型的PCR引物。
表 4TAL弓丨物TAL1(SEQ ID NO 13)CGGAATTCTCGAGCTCCAGTTACTCAATACGTAACAATAATAL2(SEQ ID NO 14)AAGATTTTAAGAAAGGTTTCGATATGACGGACAAATTGACCTCCCTTCGTTAL3(SEQ ID NO 15)ACGAAGGGAGGTCAATTTGTCCGTCATATCGAAACCTTTCTTAAAATCTTTAL4(SEQ ID NO 16)CATTTTGACTACCAGATCTAGATTACAGCAGATCGCCGATCATTTTTTCC對于第一 PCR，將從運(yùn)動發(fā)酵單胞菌細(xì)胞制備的基因組DNA用作模板，將引物TALI 和TAL3用于擴(kuò)增大約300bp的DNA片段，該片段含有轉(zhuǎn)醛醇酶基因的啟動子和N末端位點(diǎn) 并且在啟動子基因的上游末端具有添加的Xhol限制性切割位點(diǎn)。在另一方面，通過使用 大腸桿菌基因組DNA (作為模板)以及引物TAL2和TAL4擴(kuò)增大約1. 2kbp的DNA片段，該 片段含有啟動子基因的一部分和轉(zhuǎn)醛醇酶基因并且在轉(zhuǎn)醛醇酶基因的C末端上具有添加 的Xbal限制性切割位點(diǎn)。然后，將含有啟動子基因的DNA片段和含有轉(zhuǎn)醛醇酶基因的DNA 片段混合并且在94°C下加熱20分鐘，然后將混合物在37°C下保持15分鐘以形成異源雙鏈 體。然后，在TaqDNA聚合酶存在的情況下，讓異源雙鏈體在72°C下反應(yīng)3分鐘。向該反應(yīng) 混合物中加入引物TALI和引物TAL4，進(jìn)行第二 PCR以擴(kuò)增大約1. 3kbp的DNA片段，在該 片段中，Eno啟動子基因和轉(zhuǎn)醛醇酶基因以該順序連接。在將該DNA片段的兩個(gè)末端經(jīng)歷 平端化反應(yīng)后，將DNA片段與用HincII限制性內(nèi)切酶切割的用于大腸桿菌的載體質(zhì)粒DNA PUC118的片段混合，然后用T4連接酶連接以產(chǎn)生重組質(zhì)粒DNA。根據(jù)常規(guī)方法將所產(chǎn)生的 重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，然后將轉(zhuǎn)化菌株用于含有50 u g/mL氨芐青霉素、0. ImM 異丙基_ 0 -D-硫代半乳糖苷和20 u g/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基-0 -D-半乳糖吡喃糖苷 的LB平板培養(yǎng)基(1% Bacto Tripton、0. 5%酵母提取物、NaCl和1. 5%瓊脂)以形成 集落。從形成白色集落的轉(zhuǎn)化菌株提取的重組質(zhì)粒稱為pUC118-tal。圖5概述了該操作。隨后，通過PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)酮醇酶基因?；谝阎霓D(zhuǎn)酮醇酶基因的核苷酸序列 (J. Bacteriol.，第174卷，1707-1708，1992)合成表5中顯示的2種類型的引物。表 5TKT 引物TKT1(SEQ ID NO 17)CGGAATTCTCGAGCTCCAGTTACTCAATACGTAACAATAATKT2(SEQ ID NO 18)CGGCATGCCTCGAGGCAAACGGACATTATCAAGGTAATAAAAAAGGTCGC對于第一 PCR，將從大腸桿菌細(xì)胞制備的基因組DNA用作模板，使用引物TKT1和 TKT2擴(kuò)增大約2. lkbp的DNA片段，所述DNA片段包含在轉(zhuǎn)酮醇酶基因的N末端的上游添 加的Xbal限制性切割位點(diǎn)和在轉(zhuǎn)酮醇酶基因的C末端的下游添加的Xhol限制性切割位 點(diǎn)。在將該DNA片段的兩個(gè)末端經(jīng)歷平端化反應(yīng)后，將DNA片段與用HincII限制性內(nèi)切酶切割的用于大腸桿菌的載體質(zhì)粒DNA PUC118的片段混合，然后用T4連接酶連接以產(chǎn) 生重組質(zhì)粒DNA。根據(jù)常規(guī)方法將所產(chǎn)生的重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，然后將轉(zhuǎn) 化菌株用于含有50 μ g/mL氨芐青霉素、0. ImM異丙基-β -D-硫代半乳糖苷和20 μ g/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基- β -D-半乳糖吡喃糖苷的LB平板培養(yǎng)基(1 % Bacto Tripton, 0.5%酵母提取物、NaCl和1.5%瓊脂)以形成集落。從形成白色集落的轉(zhuǎn)化菌株提取 的重組質(zhì)粒稱為pUC118-tkt。表6概述了該操作。然后，產(chǎn)生含有其中連接GAP啟動子基因、轉(zhuǎn)醛醇酶基因和轉(zhuǎn)酮醇酶基因的DNA片 段的重組質(zhì)粒。即，將通過在XbaI限制性切割位點(diǎn)和SphI限制性切割位點(diǎn)(所述兩個(gè)限 制性切割位點(diǎn)存在于轉(zhuǎn)醛醇酶基因的C末端的下游區(qū)域中)上切割重組質(zhì)粒pUC118-tal 獲得的DNA片段與含有通過用XbaI和SphI切割重組質(zhì)粒pUC118_tkt制備的轉(zhuǎn)酮醇酶基 因的大約2. Ikbp的DNA片段混合，然后用T4連接酶連接來產(chǎn)生重組質(zhì)粒DNA。根據(jù)常規(guī)方 法將所產(chǎn)生的重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，然后將轉(zhuǎn)化菌株用于含有50 μ g/mL氨芐 青霉素的LB平板培養(yǎng)基(1% Bacto Tripton,0. 5%酵母提取物、NaCl和1. 5%瓊脂) 以形成集落。已確認(rèn)，從形成集落的轉(zhuǎn)化菌株提取的重組質(zhì)粒具有以該順序串連的Eno啟 動子基因、轉(zhuǎn)醛醇酶基因和轉(zhuǎn)酮醇酶基因，并且該重組質(zhì)粒被稱為pUC118-tal+tkt。圖7概述了該操作。(3)pZA22_xy 的構(gòu)建為了將木糖代謝系統(tǒng)的4種酶的基因?qū)脒\(yùn)動發(fā)酵單胞菌并且在其中表達(dá)它 們，將這些基因插入穿梭載體以產(chǎn)生重組質(zhì)粒。通過用XhoI限制性內(nèi)切酶切割重組質(zhì)粒 pUC118-taltkt來產(chǎn)生含有Eno啟動子基因、轉(zhuǎn)醛醇酶基因和轉(zhuǎn)酮醇酶基因的大約3. 3kbp 的DNA片段。將該片段與用限制性內(nèi)切酶SalI切割的穿梭載體pZA22混合，然后用T4連 接酶連接以產(chǎn)生重組質(zhì)粒。根據(jù)常規(guī)方法將所產(chǎn)生的重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，然 后將轉(zhuǎn)化菌株用于含有50 μ g/mL氯霉素的LB平板培養(yǎng)基(l^Bacto TriptoruO. 5%酵母 提取物、NaCl和1.5%瓊脂)以形成集落。已確認(rèn)，從形成集落的轉(zhuǎn)化菌株提取的重組 質(zhì)粒具有以該順序串連的Eno啟動子基因、轉(zhuǎn)醛醇酶基因和轉(zhuǎn)酮醇酶基因。在另一方面，通 過用EcoRI限制性內(nèi)切酶切割pUCllS-xylAxylB以切出大約3. 4kbp的DNA片段(該片段 含有Gap啟動子基因、木糖異構(gòu)酶基因和木酮糖激酶基因)，然后將兩個(gè)切割末端平端化來 制備DNA片段。然后，將制備的DNA片段與通過用EcoRV限制性內(nèi)切酶切割pZA22重組質(zhì) 粒(所述重組質(zhì)粒是通過插入轉(zhuǎn)醛醇酶基因和轉(zhuǎn)酮醇酶基因而制備的)獲得的產(chǎn)物混合， 然后用T4連接酶連接以產(chǎn)生重組DNA質(zhì)粒。根據(jù)常規(guī)方法將所產(chǎn)生的重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化 大腸桿菌JM109，然后將轉(zhuǎn)化菌株用于含有50 μ g/mL氯霉素的LB平板培養(yǎng)基(1 % Bacto TriptoruO. 5%酵母提取物、NaCl和1.5%瓊脂)以形成集落。已確認(rèn)，從形成集落的 轉(zhuǎn)化菌株提取的重組質(zhì)粒具有以該順序串連的GAP啟動子、木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶基因、 Eno啟動子、轉(zhuǎn)醛醇酶基因和轉(zhuǎn)酮醇酶基因，并且該重組質(zhì)粒被稱為pZA22-xt。圖8概述了該操作。(4)為運(yùn)動發(fā)酵單胞菌提供木糖發(fā)酵能力將具有串聯(lián)插入質(zhì)粒pZA22的xylAB和taltktA基因的重組質(zhì)粒pZA22_xt用于 研究具有木糖發(fā)酵能力的菌株的培育。
操作如下。按照常規(guī)方法將重組質(zhì)粒pZA22_xt用于轉(zhuǎn)化運(yùn)動發(fā)酵單胞菌 IF013756，通過用于葡萄糖-RM平板培養(yǎng)基(2%葡萄糖、1. 0%酵母提取物、0. 2% KH2P04、 1.5%瓊脂和10(^8/!^氯霉素，？!1 6.0)來選擇轉(zhuǎn)化菌株。將形成集落的轉(zhuǎn)化菌株接種入 木糖-RM培養(yǎng)基(2%木糖、1.0%酵母提取物、0.2^KH2PO4和100 μ g/mL氯霉素，pH 6.0) 以研究其基于木糖作為碳源的生長和用于乙醇生產(chǎn)的發(fā)酵能力。然而，轉(zhuǎn)化菌株在木糖-RM 培養(yǎng)基中只展示微弱的生長，并且未展示用于生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵能力。然后，將上述Zm ms選 擇為宿主菌株并且用pZA22-xt轉(zhuǎn)化以獲得Zm ms[pZA22-xt]菌株。將在葡萄糖-RM平板 培養(yǎng)基中生長的ZM ms[pZA22-xt]菌株接種入木糖-RM培養(yǎng)基以研究其基于木糖作為碳源 的生長和用于生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵能力。作為結(jié)果，確認(rèn)Zm ms[pZA22-xt]菌株以木糖作為碳 源為基礎(chǔ)生長。在4%的木糖培養(yǎng)基中進(jìn)行ZM ms[pZA22-xt]菌株的發(fā)酵檢測。作為對照， 將通過將pZA22-xt導(dǎo)入野生型菌株獲得的菌株(ZM[pZA22-xt])經(jīng)歷發(fā)酵測試。ZM ms[pZA22-xt]菌株以理論產(chǎn)率在48小時(shí)內(nèi)完全利用4%木糖來生產(chǎn)乙醇。在另一個(gè)方面， 在ZM[pZA22-xt]菌株中，觀察到由于微弱生長而導(dǎo)致的只有一部分木糖的降解，然而未發(fā) 現(xiàn)用于生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵能力(圖9)。實(shí)施例3為細(xì)菌菌株提供葡萄糖、甘露糖和木糖的同時(shí)發(fā)酵能力已通過將manA整合入運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的染色體DNA成功地將甘露糖和葡萄糖的 同時(shí)發(fā)酵能力提供給運(yùn)動發(fā)酵單胞菌。然后，進(jìn)行進(jìn)一步的研究以提供木糖同時(shí)發(fā)酵能力。(1)同時(shí)具有大腸桿菌來源的木糖代謝系統(tǒng)和甘露糖代謝系統(tǒng)的基因的菌株的構(gòu)
建制備實(shí)施例1中獲得的已將manA整合入染色體的ZMms[E2 :manA]的感受態(tài)細(xì)胞， 用pZA22-xt轉(zhuǎn)化細(xì)胞(圖10)?；谀咎瞧桨迮囵B(yǎng)基上集落的形成選擇轉(zhuǎn)化菌株。然后， 監(jiān)控獲得的集落在含有木糖和甘露糖作為碳源的液體培養(yǎng)基中的生長。選擇在木糖和甘露 糖的碳源中展示高度生長的轉(zhuǎn)化菌株并且用于發(fā)酵測試。(2)培育的菌株中木糖代謝系統(tǒng)和甘露糖代謝系統(tǒng)的基因的表達(dá)研究共存于將要用于發(fā)酵測試的菌株中的木糖代謝系統(tǒng)和甘露糖代謝的基因的 表達(dá)。雖然在野生型運(yùn)動發(fā)酵單胞菌菌株中發(fā)現(xiàn)內(nèi)源果糖激酶活性，但未在其中發(fā)現(xiàn)木糖 異構(gòu)酶、木酮糖激酶、轉(zhuǎn)醛醇酶和磷酸甘露糖異構(gòu)酶的酶促活性。然而，在ZM ms[E2: :manA] 菌株中確認(rèn)了磷酸甘露糖異構(gòu)酶活性的表達(dá)，并且在Zm ms[pZA22-xt]中確認(rèn)了作為導(dǎo)入 的木糖代謝系統(tǒng)的基因的表達(dá)指示的木酮糖激酶和轉(zhuǎn)醛醇酶活性的表達(dá)。此外，在共表達(dá) 菌株中確認(rèn)了木糖代謝系統(tǒng)的基因和manA基因的表達(dá)，還確認(rèn)了與大腸桿菌相比較，這些 基因的表達(dá)水平在此類菌株中更高。即，確認(rèn)了導(dǎo)入的基因是穩(wěn)定的并且高效地表達(dá)。表6顯示導(dǎo)入的基因表達(dá)的確認(rèn)結(jié)果。表6 注釋1)XK 木酮糖激酶，1U =在1分鐘內(nèi)減少1 P mol NADH的酶促活性。TA 轉(zhuǎn)醛醇酶，1U =在1分鐘內(nèi)減少1 P mol NADH的酶促活性。PMI 磷酸甘露糖異構(gòu)酶，1U =在1分鐘內(nèi)減少1 P mol NADH的酶促活性。(3) 3種糖的混合糖的發(fā)酵測試(在分批類型發(fā)酵的條件下)通過使用其中已將manA導(dǎo)入染色體并且將XylA、XylB、tal和tktA作為質(zhì)粒導(dǎo)入 的培育的菌株估計(jì)發(fā)酵能力。如圖11a和圖lib中所示，當(dāng)將2%葡萄糖、木糖或甘露糖用 作唯一碳源時(shí)，與葡萄糖的發(fā)酵率相比較，看到輕微的減少，但該菌株展示與木糖和甘露糖 的快速消耗和以理論產(chǎn)率進(jìn)行的乙醇產(chǎn)生相一致的生長。菌株對于與葡萄糖共存的木糖或 甘露糖還展示快速的乙醇產(chǎn)生。至于在葡萄糖、木糖和甘露糖共存的情況下糖的消耗，以這 樣的順序發(fā)生，即首先消耗葡萄糖，然后消耗木糖和甘露糖。從而，看到理論產(chǎn)率的乙醇產(chǎn) 生。如上所述，已成功地培育了能夠高效地將酸處理糖化溶液中含有的主要糖類葡萄 糖、木糖和甘露糖轉(zhuǎn)化成乙醇的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌菌株。培育的菌株稱為ZM mX42，并且自2007年8月13日以來一直由日本產(chǎn)業(yè)技術(shù)總
合研究所國際專利生物保藏所，tsukuba Central 6，l-l-lHigashi，Tsukuba 305-8566，
、
Japan在布達(dá)佩斯條約的條款下于登錄號〖FERM BP-11025下保藏。j實(shí)施例4廢木料的酸處理糖化溶液的發(fā)酵測試(在分批類型發(fā)酵的條件下)通過使用廢木 料的酸處理糖化溶液進(jìn)行培育的菌株(ZMmS42[SuCZE2::manA，pZA22-xt])的發(fā)酵測試。將 按照常規(guī)方法(AppliedBiochemistry and Biotechnology，第 98-100 卷，899-807，2002) 制備的施工廢棄物的濃硫酸處理的糖化溶液用作廢木料的酸處理糖化溶液。在將1倍體積的2倍濃度的RM培養(yǎng)基(2%的碳源、的酵母提取物和0. 2% ofKH2P04,pH6. 0-6. 5)加入至1倍體積的酸處理糖化溶液的情況下或在將1倍體積的10倍 濃度的冊培養(yǎng)基加入至9倍體積的酸處理糖化溶液的情況下進(jìn)行發(fā)酵測試。結(jié)果示于圖12a和圖12b中。根據(jù)圖12a，消耗葡萄糖、甘露糖和木糖，以接近理論 產(chǎn)率的產(chǎn)率生產(chǎn)乙醇。在幾乎為未稀釋溶液的酸處理糖化溶液的情況下，如圖12b中所示， ZM ms[pZA22-xt]也快速地發(fā)酵3種類型的糖，以高產(chǎn)率生產(chǎn)乙醇。實(shí)施例5生物乙醇產(chǎn)生反應(yīng)器(1)附著的固定化細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物和反應(yīng)器的制備
下面舉例說明附著的固定化細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物的制備和用于發(fā)酵的充填有細(xì)菌細(xì) 胞的反應(yīng)器的產(chǎn)生。(a)酸處理糖化溶液培養(yǎng)基的制備1)用CaCO3將酸處理糖化溶液(大約pHl. 0)中和至接近pH5. 5。2)通過抽濾(suction filtration)從中和的酸處理糖化溶液除去沉淀，將溶液 在4°C下貯存。3)將酸處理糖化溶液在80°C下進(jìn)行巴氏滅菌，進(jìn)行1天或更長時(shí)間，同時(shí)沉積過
量的沉淀。4)為了用作用于連續(xù)發(fā)酵測試和發(fā)酵測試的培養(yǎng)基，以2倍、2. 5倍和10倍的濃 度制備不含碳源的RM培養(yǎng)基和T-培養(yǎng)基，將每一種培養(yǎng)基與經(jīng)巴氏滅菌的酸處理糖化溶 液混合。通過離心(25°C，8000rpm，60分鐘)除去任何形成的沉淀。T-培養(yǎng)基是具有2%的碳源、的酵母提取物、的KH2PO4、0. 2%的(NH4)2SO4和 0. 05%的MgSO4 · 7Η20(ρΗ6· 0)的組成的培養(yǎng)基。(b)附著的固定化細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物的制備1)為了進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，向500ml補(bǔ)充有合適的糖的RM培養(yǎng)基(T_培養(yǎng)基)中加 入表7中所示的載體，對混合物進(jìn)行高壓滅菌。表 7 2)在將混合物冷卻至室溫后，將細(xì)菌細(xì)胞接種入該培養(yǎng)基中，然后將其在30°C下 經(jīng)歷靜止培養(yǎng)，進(jìn)行2天或更長時(shí)間。此時(shí)，將使細(xì)菌細(xì)胞附著至其上的載體用作固定化細(xì) 胞。(d)使用反應(yīng)器的連續(xù)發(fā)酵測試用70%的固定化細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物充填柱子，將流體浴類型(fluidbath type)反 應(yīng)器用于上行法(ascending method)。圖13和表8分別顯示了反應(yīng)器的示意圖和用于連續(xù)發(fā)酵的條件。表8 (c)用于分析發(fā)酵溶液的方法糖和乙醇通過使用來自按時(shí)間取樣的反應(yīng)器的洗脫物來分析乙醇的產(chǎn)生和糖組分的減少。 即，將ImL柱提取物離心(4°C，15000rpm, 15分鐘)，然后通過HPLC進(jìn)行分析。 HPLC分析條件如下。條件下1使用的柱子BIO-RADAminex HPX-87P流速0.4mL/ 分鐘柱子溫度80°C提取液脫氣蒸餾水樣品量5yL條件2使用的柱子ShodexSUGAR KS-801流速0.5mL/分鐘柱子溫度50°C提取液脫氣蒸餾水樣品量5yL根據(jù)下列反應(yīng)方案測定乙醇的產(chǎn)率。葡萄糖+ADP+Pi — 2 乙醇 +2C02+ATP3 木糖 +3ADP+3Pi — 5 乙醇 +5C02+3ATP理論乙醇產(chǎn)率=0. 51%乙醇葡萄糖或木糖實(shí)施例6廢木料的酸處理糖化溶液的連續(xù)發(fā)酵(1)模型酸處理糖化溶液的連續(xù)發(fā)酵將充填有實(shí)施例5中描述的重組單胞發(fā)酵菌的固定細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物的反應(yīng)器用 于評估用于從含有葡萄糖、甘露糖和木糖(作為混合物)的模型糖溶液生產(chǎn)乙醇的連續(xù)發(fā) 酵。首先，使用6%葡萄糖+2%甘露糖+2%木糖的模型糖溶液在30°C和pH6. 5下于充填有 ZM ms42[sucZE2: :manA, pza22-xyl]的反應(yīng)器中進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵測試，D = 0. 2/小時(shí)。作為 結(jié)果，如圖14中所示，觀察到理論產(chǎn)率的乙醇產(chǎn)量，其相應(yīng)于葡萄糖和甘露糖的完全消耗。 然而，看到木糖作為殘留的糖存在于發(fā)酵溶液中，從而發(fā)現(xiàn)三種類型的糖的連續(xù)同時(shí)發(fā)酵 非常困難。因此，研究木糖的降低的發(fā)酵能力的原因，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溶液影響木糖的發(fā)酵能力。 圖15顯示通過觀察培育的菌株的糖的發(fā)酵能力與發(fā)酵溶液的初始pH之間的相互關(guān)系獲得 的結(jié)果。在ZM ms42[sucZE2: :manA，pza22-xyl]的情況下，未看出初始pH對葡萄糖和甘露 糖的發(fā)酵的影響，然而發(fā)現(xiàn)糖溶液的初始PH顯著影響木糖發(fā)酵能力。即，在pH5或更低的 PH下觀察到木糖發(fā)酵能力的降低。這些結(jié)果表明pH控制在混合糖溶液的連續(xù)發(fā)酵中是必 需的。(2)廢木料的酸處理糖化溶液的連續(xù)發(fā)酵稀釋的酸處理糖化溶液的連續(xù)乙醇產(chǎn)生按照上述附著固定法進(jìn)行ZM ms42[sucZE2::manA, pza22-xyl]的固定化細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物的制備，用細(xì)菌細(xì)胞充填柱子(內(nèi)徑25mm，長度130mm)，同時(shí)防止氣泡進(jìn)入。然 后，如上所述制備1 1的酸處理糖化溶液-RM培養(yǎng)基(PH6. 5)，在30°C下使用該培養(yǎng)基以 16mL/小時(shí)的流速和D = O. 25/小時(shí)在恒溫器中進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。結(jié)果示于圖16a中。如從這些結(jié)果所顯示的，雖然甘露糖在發(fā)酵開始時(shí)保持為殘留的糖，但最終幾乎 不存在殘留的糖。平均乙醇濃度為1.97%，產(chǎn)率為88. 79%，乙醇形成速度為5. 18g/L ·小 時(shí)。由此，以接近理論產(chǎn)率的產(chǎn)率獲得乙醇的產(chǎn)生。因而，除了增加糖濃度外，按照相同的方式進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵測試。如從圖16b的結(jié)果 所看到的，不存在殘留的糖，平均乙醇濃度為2. 45 %，此時(shí)產(chǎn)率為96. 16 %，乙醇形成速度 為6. 24g/L ·小時(shí)。由此，以理論產(chǎn)率生產(chǎn)乙醇。(3)從酸處理糖化溶液進(jìn)行的連續(xù)乙醇產(chǎn)生上述結(jié)果清楚地顯示可能通過施工廢棄物的酸處理糖化溶液的連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)乙 醇。因此，通過實(shí)際測試來研究從酸處理糖化溶液進(jìn)行的連續(xù)乙醇產(chǎn)生。S卩，在16mL/小時(shí)的流速、D = O. 25/小時(shí)和30°C的條件下在接近未稀釋的溶液 (10 1)的濃度上進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵測試。作為結(jié)果，存在更少的殘留的糖，并且以理論產(chǎn)率 生產(chǎn)乙醇。平均乙醇濃度為3. 73%，產(chǎn)率為92. 20%，乙醇形成的速度為10. 27g/L ·小時(shí) (圖17a)。此外，為了研究用于生產(chǎn)乙醇的高速連續(xù)發(fā)酵，通過以32ml/小時(shí)的流速和D = 0. 50/小時(shí)維持酸處理糖化溶液的上述糖濃度在30°C下于恒溫器中進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。作為結(jié) 果，葡萄糖和木糖被消耗，只有痕量甘露糖殘留。平均乙醇濃度為3. 83%，產(chǎn)率為86. 56%, 乙醇形成的速度為20. 88g/L ·小時(shí)(圖17b)。由此，以接近理論產(chǎn)率的產(chǎn)率生產(chǎn)乙醇，即 使種稀釋率為0. 50/小時(shí)亦如此。工業(yè)適用性 如上所論述的，根據(jù)本發(fā)明，可通過使用能夠同時(shí)發(fā)酵葡萄糖、甘露糖和木糖的發(fā) 酵細(xì)菌菌株建立節(jié)能高效的生物乙醇轉(zhuǎn)化方法，所述發(fā)酵細(xì)菌菌株可通過發(fā)酵纖維素類型 和木質(zhì)纖維素類型的生物質(zhì)源來生產(chǎn)乙醇。序列表自由正文SEQ ID NO=I 擴(kuò)增編碼大腸桿菌manA的DNA的經(jīng)設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物；SEQ ID NO 2 擴(kuò)增編碼大腸桿菌manA的DNA的經(jīng)設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物；SEQ ID NO 3 擴(kuò)增編碼大腸桿菌manA的DNA的經(jīng)設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物；SEQ ID NO 4 擴(kuò)增編碼大腸桿菌manA的DNA的經(jīng)設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物；SEQ ID NO 5 擴(kuò)增編碼運(yùn)動發(fā)酵單胞菌基因組E2基因部分的DNA的經(jīng)設(shè)計(jì)的寡 核苷酸引物；SEQ ID NO 6 擴(kuò)增編碼運(yùn)動發(fā)酵單胞菌基因組E2基因部分的DNA的經(jīng)設(shè)計(jì)的寡 核苷酸引物；SEQ ID NO 7 擴(kuò)增編碼運(yùn)動發(fā)酵單胞菌基因組E2基因部分的DNA的經(jīng)設(shè)計(jì)的寡 核苷酸引物；SEQ ID NO 8 擴(kuò)增編碼運(yùn)動發(fā)酵單胞菌基因組E2基因部分的DNA的經(jīng)設(shè)計(jì)的寡 核苷酸引物；SEQ ID NO 9 擴(kuò)增編碼大腸桿菌xylA、B的DNA的經(jīng)設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物；SEQ ID NO 10 擴(kuò)增編碼大腸桿菌xylA、B的DNA的經(jīng)設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物；
SEQIDNO11擴(kuò)增編碼大腸桿菌xylA、B的DNA的經(jīng)設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物
SEQIDNO12擴(kuò)增編碼大腸桿菌xylA、B的DNA的經(jīng)設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物
SEQIDNO13擴(kuò)增編碼大腸桿菌tal的DNA的經(jīng)設(shè)計(jì)的3S核苷酉1引物；
SEQIDNO14擴(kuò)增編碼大腸桿菌tal的DNA的經(jīng)設(shè)計(jì)的3S核苷酉1引物；
SEQIDNO15擴(kuò)增編碼大腸桿菌tal的DNA的經(jīng)設(shè)計(jì)的3S核苷酉1引物；
SEQIDNO16擴(kuò)增編碼大腸桿菌tal的DNA的經(jīng)設(shè)計(jì)的3S核苷酉1引物；
SEQIDNO17擴(kuò)增編碼大腸桿菌tkt的DNA的經(jīng)設(shè)計(jì)的3S核苷酉1引物；
SEQIDNO18擴(kuò)增編碼大腸桿菌tkt的DNA的經(jīng)設(shè)計(jì)的3S核苷酉1引物。
權(quán)利要求
能夠同時(shí)發(fā)酵葡萄糖、甘露糖和木糖的發(fā)酵細(xì)菌，其為包含按照同源重組方法通過雙交換而被整合入位于染色體上的蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的編碼大腸桿菌來源的磷酸甘露糖異構(gòu)酶的基因和導(dǎo)入的重組DNA的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌，所述導(dǎo)入的重組DNA是通過將包含全部都為大腸桿菌來源的分別編碼木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶的基因的DNA片段連接至載體形成的。
2.權(quán)利要求1的發(fā)酵細(xì)菌，其可通過使用高蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生性菌株作為宿主 菌株而獲得。
3.權(quán)利要求2的發(fā)酵細(xì)菌，其中所述宿主菌株為運(yùn)動發(fā)酵單胞菌ZMcs(FERM BP-I1024)。
4.權(quán)利要求3的發(fā)酵細(xì)菌，其為運(yùn)動發(fā)酵單胞菌ZMmx42(FERMBP-11025)。
5.用于生產(chǎn)乙醇的方法，其包括使纖維素類型和/或木質(zhì)纖維素類型生物質(zhì)源的糖化 溶液與已被固定在固定化載體上的權(quán)利要求1的能夠同時(shí)發(fā)酵葡萄糖、甘露糖和木糖的發(fā) 酵細(xì)菌彼此接觸，從而發(fā)酵糖化溶液以獲得發(fā)酵溶液，以及從發(fā)酵溶液回收乙醇。
6.權(quán)利要求5的用于生產(chǎn)乙醇的方法，其中所述發(fā)酵細(xì)菌是運(yùn)動發(fā)酵單胞菌ZM mx42(FERM BP-I1025)。
7.權(quán)利要求5的用于生產(chǎn)乙醇的方法，其中所述生物質(zhì)源是木質(zhì)生物質(zhì)源。
8.權(quán)利要求5的用于生產(chǎn)乙醇的方法，其中將所述糖化溶液連續(xù)地進(jìn)料入充填有固定 化發(fā)酵細(xì)菌的反應(yīng)器，從而使糖化溶液和發(fā)酵細(xì)菌彼此接觸，以獲得發(fā)酵溶液，連續(xù)地收集 發(fā)酵溶液，以及從其回收乙醇。
全文摘要
目的是開發(fā)能夠同時(shí)發(fā)酵葡萄糖、甘露糖和木糖的細(xì)菌，其可發(fā)酵纖維素類型或木質(zhì)纖維素類型的生物質(zhì)源的糖化溶液以生產(chǎn)乙醇，和構(gòu)建節(jié)能高效的生物乙醇轉(zhuǎn)化方法。因此，公開了運(yùn)動發(fā)酵單胞菌，該細(xì)菌是通過將來源于大腸桿菌的編碼磷酸甘露糖異構(gòu)酶的基因整合入(利用同源重組方法，通過雙交換)位于染色體上的蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因，然后導(dǎo)入通過將含有分別編碼木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶的基因(全都來源于大腸桿菌)的DNA片段連接至載體制備的重組DNA制備的。還公開了用于通過在系統(tǒng)(將運(yùn)動發(fā)酵單胞菌細(xì)菌固定在所述系統(tǒng)上)中連續(xù)發(fā)酵纖維素類型生物質(zhì)源的糖化溶液來生產(chǎn)乙醇的方法。
文檔編號C12P7/08GK101889078SQ20088011945
公開日2010年11月17日 申請日期2008年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月5日
發(fā)明者岡本賢治, 簗瀨英司 申請人:國立大學(xué)法人鳥取大學(xué)