專利名稱：鑒定脆性組氨酸三聯(lián)體(Fhit)相互作用的方法及其用途的制作方法
鑒定脆性組氨酸三聯(lián)體(Fhit)相互作用的方法及其用途對相關(guān)申請的交叉引用和關(guān)于資助研究的聲明本發(fā)明要求2007年10月沈日提交的臨時專利申請序列第60/000，480號的權(quán)益。 本發(fā)明是在NCI資助號CA77738和CA78890的政府支持下進行的。政府在本發(fā)明中享有某 些權(quán)利。
背景技術(shù)：
ΠΠΤ基因包括染色體3pl4. 2的最具活性的常見的脆性位點(1，2)。由于等位基因 丟失、基因組重排、啟動子超甲基化或其組合fhit表達在大多數(shù)類型的人腫瘤的大部分中 是丟失的或降低的(3，4) Jhit敲除小鼠顯示對癌癥發(fā)展的增加的易感性(5，6)，并且ΠΠΤ 基因治療在暴露于致癌原的i^hit-缺陷小鼠中預(yù)防腫瘤(7，8)。癌細胞中通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 i^hit恢復(fù)在體外幾乎沒有作用，除非將細胞暴露于應(yīng)激，包括體內(nèi)裸小鼠環(huán)境應(yīng)激(9)；病 毒介導(dǎo)的i^hit恢復(fù)，一種同時提供應(yīng)激和!^hit表達的過程，在體內(nèi)遏制腫瘤發(fā)生并在體外 觸發(fā)許多類型的惡性細胞的凋亡(10-13)，所述惡性細胞包括肺癌細胞。在肺增生病變中，DNA損傷關(guān)卡基因(checkpoint gene)已經(jīng)被激活，導(dǎo)致關(guān)卡蛋 白中突變的選擇和腫瘤進展(14、15)。ΠΠΤ內(nèi)FRA 3B處的DNA改變的證據(jù)伴隨增生和關(guān) 卡激活。在其他抑制基因的表達發(fā)生病理變化或改變之前，F(xiàn)HIT等位基因的丟失發(fā)生于吸 煙者的正常外觀的支氣管上皮細胞中(16-18)。Fhit表達受到暴露于DNA損傷劑的下調(diào)(19)，并且!^hit在對此類劑的應(yīng)答中起 作用00，21)，而!^hit-缺陷細胞逃避凋亡并積累突變。雖然!^hit表達在幾種實驗?zāi)Ｐ椭型ㄟ^涉及外在和內(nèi)在凋亡途徑的半胱天冬酶 (caspase)依賴性機制觸發(fā)凋亡，但是關(guān)于此過程的早期事件以及!^hit丟失如何參與腫瘤 啟動仍知之甚少。因此，存在對在需要其的受治療者中改變FHIT表達的方法的需要。還存在對可用 于在需要其的受治療者中改變ππτ表達的組合物的需要。發(fā)明概述在廣泛的方面，提供了鑒定直接與!^hit相互作用以影響終點為凋亡的下游信號 途徑的蛋白的方法。在一個實施方案中，在用AdFHIT-His6病毒感染肺癌細胞之后，細胞內(nèi) 的蛋白被化學(xué)交聯(lián)。鑒定并表征了與i^hit連接的蛋白和受它們影響的途徑。在另一廣泛的方面，本文提供了診斷受治療者是否具有癌癥相關(guān)疾患或處于發(fā)展 所述疾患的風(fēng)險的方法，該方法包括測量受治療者的測試樣品中至少脆性組氨酸三聯(lián)體 (Fhit)基因的水平，其中相對于對照樣品中對應(yīng)的!^hit基因產(chǎn)物的水平，測試樣品中所述 !^hit基因產(chǎn)物的水平的改變指示受治療者具有癌癥相關(guān)疾患或處于發(fā)展所述疾患的風(fēng)險。當(dāng)根據(jù)附圖理解下列優(yōu)選實施方案詳述時，本發(fā)明的各種目標(biāo)和優(yōu)點將對本領(lǐng)域 技術(shù)人員是明顯的。附圖簡述本專利或申請文件含有至少一幅彩色附圖。含有彩色附圖的本專利或?qū)＠暾埞?布的拷貝將在提出請求并支付必要的費用后由美國專利商標(biāo)局提供。
圖IA-IH-Fhit蛋白在胞質(zhì)溶膠和線粒體中的亞細胞定位。

圖1A，以抗!^hit血清對用PonA處理48h的H1299細胞(Dl)進行免疫熒光顯微 術(shù)；使用異硫氰酸熒光素(綠色)_軛合的抗兔免疫球蛋白(IgG)檢測!^hit染色；鑒定線粒 體的Mito-Tracker Red染色顯示與!^hit的部分共定位。第四個圖(右下方)中的黃色顯 示共定位點。圖1B，以penta-His抗體進行的A549AdFHIT (左)或AdFHIT-His6-感染的細胞 (右)的免疫電子顯微術(shù)顯示冊^的線粒體定位(右)；以AdFHIT感染的A549細胞充當(dāng) 對照并顯示僅有少量分散的粒狀物(左圖)。圖1C，使用抗!^hit對AdFHIT-感染的A549亞細胞級分的免疫印跡分析表明胞質(zhì) 溶膠、膜、細胞骨架和線粒體中的i^hit蛋白分布。圖1D，對用碳酸鈉(圖1E)和濃度增加的毛地黃皂苷(圖1F)處理后AdFHIT-His6 感染的A549細胞的線粒體蛋白的免疫印跡分析表明，！^hit主要分布于線粒體基質(zhì)中；用 Fhit和CoxIV抗血清探測濾膜；圖IF中的泳道代表用0%、0. 10%,0. 15%和0. 20%毛地 黃皂苷處理后的上清液。圖1G，使用抗Fhit對MKN74/E4和MKN74/A116細胞(穩(wěn)定表達外源Fhit)，和圖 1H，HCTl 16 (內(nèi)源!^hit陽性克隆癌細胞系)的亞細胞級分的免疫印跡分析證實了 ！^hit的 線粒體定位；GAPDH和CoxIV抗血清充當(dāng)對照。圖2A-F-外源和內(nèi)源!^hit與內(nèi)源Hsp60、HsplO和Fdxr蛋白形成復(fù)合體。將用 重組!^hit-Hi%蛋白分離的蛋白復(fù)合體在聚丙烯酰胺凝膠上分離，并用針對Hsp60 (圖2A)、 HsplO (圖2B)和Fdxr (圖2C)的抗血清探測；在后一圖中，其于線粒體分離后制備，顯示 Fhit在線粒體中以時間依賴性方式募集Fdxr。以有或無DSP下用AdFHIT-His6感染A549 細胞后分離的蛋白對濾膜進行上樣。圖2D，用AdFHIT感染A549細胞后以抗Hsp60進行的免疫共沉淀；以Hsp60、!^hit 和HsplO抗血清探測濾膜。圖2E，用V5標(biāo)簽的FD)(R基因和HlIT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549細胞；用抗V5進行免疫沉 淀并用Fdxr和!^hit抗血清進行檢測。圖2F，來自DSP處理的!^hit陽性HCT116細胞的內(nèi)源相互作用物蛋白(Fdxr和 HsplO)的免疫沉淀和免疫印跡檢測。以針對每種靶蛋白的抗血清探測濾膜。內(nèi)源!^hit與 Hs plO和Fdxr共沉淀。圖3A-D-Hsp60/Hspl0的敲低降低了線粒體中的!^hit水平。圖3A，使用H6抗體對AdFHIT-His6感染的A549細胞的亞細胞級分(胞質(zhì)溶膠和 線粒體)進行的鎳-H6下拉(pull down)實驗；將溶胞產(chǎn)物與鎳珠孵育以分離DSP交聯(lián)的 !^hit-Hk6蛋白復(fù)合體并上樣至4-20%聚丙烯酰胺凝膠。感染后Mh，Hsp60-Fhit復(fù)合體 存在于兩個區(qū)室中；感染后48h，復(fù)合體在兩個區(qū)室中同樣是可檢測的，并且!^hit復(fù)合體蛋 白的增加顯示與AdFHIT-Hk6感染后48h !^hit蛋白的增加相關(guān)，線粒體中有輕微增加(對 輸入樣品進行光密度法分析)。圖 3B，對 Hsp60/Hspl0 沉默 72h 后 Fhit 陽性 Dl 細胞中的 Hsp60、HsplO、Fhit 和 GAPDH的免疫印跡分析，其顯示CHX追蹤(30 μ g/ml) l_12h后的Fhit、Hsp60和HsplO水平。圖 3C，用 Hsp60 和 HsplO siRNA 轉(zhuǎn)染后 72h 和 m. o. i. 1 的 AdFHIT 感染后 24h，使用Hsp60、Hspl0、!^hit、GAPDH和CoxIV抗血清，對A549細胞的胞質(zhì)溶膠/線粒體蛋白級分 的免疫印跡分析。Hsp60/10沉默未顯示影響!^hit胞質(zhì)溶膠水平，但與線粒體級分中!^hit 的下降有關(guān)。零亂(Scrambled) (Scr) siRNA用作對照。圖3D，“內(nèi)源"Fhit復(fù)合體蛋白的亞細胞分級和免疫沉淀。將有和無過氧化物處理 的PonA-誘導(dǎo)的Dl和El細胞分級為胞質(zhì)溶膠和線粒體，并評估誘導(dǎo)后4 亞細胞級分中 Fhit和相互作用物(左側(cè))的存在；每個泳道上樣25 μ g蛋白。內(nèi)源Hsp60共沉淀!^hit和 Fdxr0圖4A-F_Fhit表達誘導(dǎo)用過氧化物處理細胞后胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。圖4A，在有和無5小時H2A處理下，用ΠΠΤ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后4 的A549細胞中ROS 評估的熒光激活細胞分選儀(FACS)分析?？蛰d體轉(zhuǎn)染的細胞充當(dāng)對照。根據(jù)氫化乙啡啶 (hydroethidine)被化氧化產(chǎn)生的乙啡啶的熒光確定胞內(nèi)超氧化物。M2指ROS陽性細胞 的分?jǐn)?shù)。圖4B，通過Dl和El細胞中氫化乙啡啶氧化產(chǎn)生的熒光進行ROS評估的FACS分 析；PonA處理后48h，將細胞用0. 5和1. OmM H2O2處理5h，并測量氧化應(yīng)激；％陽性指指示 ROS的熒光細胞的分?jǐn)?shù)。重復(fù)這些實驗三次，得到了相似的結(jié)果。圖4C，應(yīng)激條件下H1299!^hit表達細胞(Dl)中增加的綠色熒光DCF信號。！^hit 誘導(dǎo)后4 和H2O2處理El和Dl細胞5小時后，將細胞與2' ,7' - 二氯二氫熒光素二乙 酸酯孵育，2' ,7' -二氯二氫熒光素二乙酸酯是在ROS存在下可被氧化為高度綠色熒光染 料DCF的ROS指示物(放大率x40)。圖4D，對El和Dl細胞進行MTS細胞存活測定。將細胞用PonA處理48h，然后用 濃度增加的H2O2 (0. 125,0. 25和0. 5mM)處理4h。在H2O2處理后24h進行分析。柱報告四 個實驗的平均值士S. E。每個點測量四個重復(fù)，并計算標(biāo)準(zhǔn)偏差 ’認(rèn)為ρ < 0. 05是顯著的。圖4E，氧化應(yīng)激處理后48h，Dl和El細胞周期動力學(xué)的FACS分析。將細胞用PonA 處理48h，然后用濃度增加的H2A (0. 25和0. 5mM)處理4h。在H2A處理后4 進行分析。 所有實驗以三個重復(fù)進行兩次。圖4F，5mM PonA刺激和所示濃度下的5小時H2A處理后H1299/D1和H1299/E1細 胞的集落形成測定。圖5A-H. -Fhit病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)觸發(fā)的凋亡可通過其與Fdxr的相互作用介導(dǎo)。圖5A，使用針對FdxrJhit和GAPDH的抗血清的免疫印跡分析。蛋白是在用PonA 處理后4 從El (對照)和Dl細胞提取的。圖5B，用25 μ M蛋白酶體抑制劑MG132進行4小時處理后，Dl和El細胞中Fdxr 表達的免疫印跡分析。GAPDH檢測顯示相等的蛋白上樣。圖5C，Dl細胞和El細胞中Fdxr、Fhit和GAPDH的免疫印跡分析顯示CHX追蹤 (30 μ g/ml) 4-12h后的Fdxr水平，所述Dl細胞表達!^hit。基于GAPDH水平的光密度法顯 示!^hit存在下增強的Fdxr穩(wěn)定性。圖5D，用AdFHIT m. o. i. 50和100感染后FDXRvv+和FDXRv+細胞周期動力學(xué)的 FACS分析。實驗在感染后4 進行，并重復(fù)三次，得到相似結(jié)果。Ad GFP-感染細胞的譜圖 與非感染的細胞的譜圖(未顯示)相似。圖 5E,顯示用 AdFHIT m. o. i. 50 和 100 感染 FDXR+/+/+ 和 FDXR+"-后 Fdxr、Fhit 和
8GAPDH的表達的免疫印跡分析。蛋白質(zhì)在感染后4 提取。圖5F，AdFHIT m. o. i. 50后48h的FDXR表達的實時RT-PCR分析。將PCR產(chǎn)物對 GADPH和肌動蛋白表達進行標(biāo)準(zhǔn)化，并且每個點重復(fù)四次；對照和!^hit陽性樣品之間的差 異不顯著。圖5G，半胱天冬酶3和Parpl激活。使用i^hit、半胱天冬酶3、Parpl抗血清，對 m. ο. i. 50的AdFHIT和Ad GFP感染后48,72和96h的HCTl 16 FDXR+/+/+細胞的總細胞溶胞 產(chǎn)物的免疫印跡分析。GAPDH和CoxIV充當(dāng)內(nèi)部蛋白標(biāo)志物。圖5H，使用Fhit和細胞色素c抗血清，對m. o. i. 50的AdFHIT和Ad GFP感染后 48,72和96h的HCTl 16 FDXRvv+細胞的胞質(zhì)溶膠/線粒體級分的免疫印跡分析。GAPDH和 β-肌動蛋白充當(dāng)內(nèi)部蛋白標(biāo)志物。圖6A-E_Fhit增強癌細胞對紫杉醇和順鉬的敏感性。對El和Dl細胞進行MTS測定。將細胞用PonA處理48h，然后用紫杉醇(50_500ng/ ml)(圖6A)或順鉬(0. 05-0. 2mM)(圖6B)處理24或4他。條報告四個實驗的平均值士 S. E。 每個點測量四個重復(fù)并計算標(biāo)準(zhǔn)偏差；圖6A和圖6B中方括號旁邊的星號指示Dl和El細 胞對藥物應(yīng)答的統(tǒng)計學(xué)顯著的差異，P < 0. 05。圖6C和圖6D，圖顯示El和Dl細胞的流式細胞術(shù)分析的代表性結(jié)果。將細胞用 PonA處理48h，然后用紫杉醇(50-500ng/ml)(圖6C)或順鉬(0. 05-0. 2mM)(圖6D)處理。 每個數(shù)據(jù)點在對、48和7 測量三個重復(fù)(顯示了 4 的數(shù)據(jù))。圖6E，半胱天冬酶3和Parpl切割使用i^hit、半胱天冬酶3和Parpl抗血清，對 用紫杉醇(50和100ng/ml)或順鉬(0. 05和0. ImM)處理48h后PonA誘導(dǎo)的Dl細胞的總 細胞溶胞產(chǎn)物的免疫印跡分析。GAPDH充當(dāng)上樣對照。圖7.表1通過質(zhì)譜法分離的候選!^hit蛋白配偶體。在A549AdFHIT-H6感染的細 胞樣品中選擇性捕獲的蛋白質(zhì)。列出了鑒定的肽的氨基酸序列、Mascot評分和蛋白質(zhì)序列
覆蓋率。圖 8A-8C. Ad-His6 生物活性與 AdFHIT 相當(dāng)。圖8A，用Ad_His6、M0I 20感染的A549細胞的蛋白質(zhì)印跡分析。通過抗pentaHis 和抗Fhit血清檢測Fhit-His蛋白。Ad ΠΠΤ和Ad-His6 二者均攜帶通過ΠΠΤ下游的內(nèi)部 核糖體進入序列受到CMV5啟動子調(diào)控的GFP cDNA。使用Y -微管蛋白對樣品上樣進行標(biāo) 準(zhǔn)化。圖8B，用Ad-His 6、MOI 15感染后96hr的A549細胞的流式細胞術(shù)分析。上圖 指示感染細胞的subGl DNA含量(實驗重復(fù)三次；subGl級分的平均值A(chǔ)d FHIT為22% +/-4. 3，Ad-HisB為+/"5 ；差異不是統(tǒng)計學(xué)顯著的；下圖顯示具有指示凋亡的成熟半 胱天冬酶-3的細胞的百分比。用Ad-His6感染的A549細胞中細胞死亡的程度與在用Ad ΠΠΤ感染后獲得的結(jié)果相當(dāng)。圖8CJhit-His6的體內(nèi)交聯(lián)。His6下拉和交聯(lián)逆轉(zhuǎn)條件后的細胞溶胞產(chǎn)物通過 4-20%梯度SDS-PAGE分離的凝膠的銀染色。內(nèi)部陰性對照包括Ad FHIT感染的細胞(交 聯(lián)的，CL)和Ad-His6感染的細胞(未交聯(lián)的，NT)的His6下拉。圖9A-9F.通過納米孔(nanobore) LC-MS/MS鑒定的候選Fhit蛋白配偶體的初步 驗證。顯示了 AdFHIT-His6和對照樣品的選擇離子色譜圖(Selected ion chromatograms,SIC)。六個SIC對報告了下列六個m/z值的離子電流1)672. 8 (保留時間為30min的峰鑒 定為屬于Hsp60的胰蛋白酶肽TVIIEQSffGSPK[SEQ ID NO 5]), 2) 685. 4 (保留時間為32min 的峰鑒定為屬于Aldh2的胰蛋白酶肽LGPALATGNVVVMK[SEQ ID NO :22])，3) 617. 3 (保留時 間為39min的峰鑒定為屬于Mdh的胰蛋白酶肽IFGVTTLDIVR[SEQ ID NO 10])，4)658. 4(保 留時間為26min的峰鑒定為屬于HsplO的胰蛋白酶肽VLQATVVAVGSGSK[SEQ ID NO :19])， 5)551. 7 (保留時間為^min的峰鑒定為屬于Kfb的胰蛋白酶肽EIDGGLETLR[SEQ ID NO 15]),6) 598. 3 (保留時間為2;3min的峰鑒定為屬于Fdxr的胰蛋白酶肽FGVAPDHPEVK[SEQ ID NO :23])。用紅色箭頭指示的感興趣的肽專一地存在于Ad-His6樣品中。圖10.表2，冊^在^(町4胃癌細胞中誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生。ROS評估使用攜帶p53突變 等位基因并表達外源I^hit的人胃癌細胞系MKN74A116進行Jhit陰性MKN74E4細胞用作 對照。為了誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，我們用0.5、1.0和2. OmM H2O2處理MKN74細胞證！·。結(jié)果表明與 對照相比，表達外源i^hit的細胞中有顯著更高的ROS產(chǎn)生率；2mM H2O2處理后，在!^hit-表 達細胞中觀察到毒性。數(shù)字報告四個實驗的平均值士S.E.。優(yōu)選實施方案詳述應(yīng)理解，上面的一般描述和下面的詳細描述僅是示例性的和解釋性的，并不意圖 限制本文的教導(dǎo)的范圍。在本申請中，除非另外指明，否則使用單數(shù)時包括復(fù)數(shù)。在權(quán)利要求和/或說明書中，當(dāng)與術(shù)語“包含(comprising)”聯(lián)合使用時，詞“一 種(a)”或“一種(an)”的使用可意指“一種(one) ”，但其也與“一種或多種”、“至少一種”
和“一種或多于一種” 一致。另外，“包含(comprise) ”、“含有(contain) ”和“包括(include) ”或這些根詞的 修飾形式，例如但不限于“包含(comprises) ”、“含有(contained) ”和“包括(including)”， 并不意圖是限制性的。術(shù)語“和/或”意指前后的術(shù)語可以是一起的或單獨的。出于例證 目的，但不是作為限制，“X和/或Y”可意指“X”或“Y”或“X和Y”。 如本文所用的術(shù)語“其組合”指在該術(shù)語之前所列的條目的所有排列和組合。例 如，“A、B、C或其組合”意圖包括以下的至少一種A、B、C、AB、AC、BC或ABC，以及，如果在具 體環(huán)境中順序是重要的，還包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。如本文可交換使用的，“基因產(chǎn)物”、“DNA”和“基因”在本文可交換使用。本文可使用以下縮寫詞GAPDH，甘油醛_3_磷酸脫氫酶；DSP，二硫代二(琥珀酰 亞胺丙酸酯)；LC-MS/MS，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；Fdxr，鐵氧還蛋白還原酶；PonA，松留酮A ； m. ο. i.，感染復(fù)數(shù)；R0S，活性氧簇(reactive oxygen species) ；FU，5_ 氟尿嘧啶；DCFH-DA, 二氯熒光素二乙酸酯；DCF，2'，7' - 二氯熒光素；CHX，環(huán)己酰亞胺；siRNA，小干擾RNA; RT，反轉(zhuǎn)錄酶；MTS，3- G，5- 二甲基噻唑-2-基)-5- (3-羧基甲氧基苯基)-2- (4-磺苯 基)-2H-四唑。本文使用的各部分的標(biāo)題僅是為了組織目的，而不應(yīng)以任何方式視為限制所描述 的主題。本申請中引用的所有文獻和相似材料，包括專利、專利申請、文章、專著、論文和互 聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)頁，出于任何目的而通過引用明確地整體并入。如果所并入的文獻和相似材料中的 一種或多種以與本申請中的術(shù)語定義矛盾的方式定義或使用了該術(shù)語，則以本申請為準(zhǔn)。!^hit蛋白在大多數(shù)癌癥中是丟失的，其恢復(fù)抑制腫瘤發(fā)生，并且病毒介導(dǎo)的ΠΠΤ 基因治療在臨窗前模型中誘導(dǎo)凋亡并抑制腫瘤。使用蛋白質(zhì)交聯(lián)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法表征參
10與觸發(fā)i^hit-介導(dǎo)的凋亡的!^hit蛋白復(fù)合體。該復(fù)合體包括介導(dǎo)!^hit穩(wěn)定性并可影響向 線粒體的輸入的Hsp60和HsplO，在線粒體中，該復(fù)合體與鐵氧還蛋白還原酶相互作用，鐵 氧還蛋白還原酶負(fù)責(zé)經(jīng)由鐵氧還蛋白將電子從NADPH轉(zhuǎn)移給細胞色素P450。病毒介導(dǎo)的 Fhit恢復(fù)增加胞內(nèi)活性氧簇的產(chǎn)生，然后是氧化應(yīng)激條件下肺癌細胞凋亡的增加；相反， Fhit-陰性細胞逃避了凋亡，其攜帶可促成增加的突變率的嚴(yán)重氧化型DNA損傷。！^hit相 互作用蛋白的表征鑒定了 i^hit-介導(dǎo)的凋亡途徑的直接效應(yīng)物，由于!^hit的丟失，該途徑 在大多數(shù)癌癥中是丟失的。對!^hit-相互作用蛋白的更早檢索指出了幾種候選蛋白，其中沒有一個可通 過免疫共沉淀實驗被我們確認(rèn)為相互作用物，這些候選蛋白包括Wdc9、α-微管蛋白和 Mdm2(35-37)。為了重新著手于冊^蛋白相互作用物的問題，使用了如下用于交聯(lián)后!^hit 復(fù)合體純化的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的i^hit-Hise，并鑒定了 ！^hit-連接蛋白、Hsp60、HsplO和Fdxr ； 這些蛋白的亞細胞定位暗示線粒體可能是i^hit活性的焦點。Hsp “應(yīng)激蛋白”作為分子伴 侶蛋白執(zhí)行諸如蛋白易位、折疊和裝配的功能(38)。AdFHIT感染后!^hit與Hsp60/Hspl0 相互作用的發(fā)現(xiàn)暗示，在激活凋亡途徑之前，Hsp復(fù)合體對!^hit穩(wěn)定性以及可能地對于它 的正確折疊以輸入到線粒體，可能是重要的，我們通過敲低AdFHIT-感染的肺癌細胞中的 Hsp60、HsplO或二者表達研究了這一暗示；CHX追蹤后評估了表達可誘導(dǎo)的!^hit的肺癌細 胞系H1299D1細胞中的!^hit穩(wěn)定性。敲低Hsp60和HsplO 二者后，分離的線粒體中的!^hit 蛋白降低，強化了 i^hit-Hsp60/10相互作用參與!^hit穩(wěn)定性和/或正確折疊以輸入到線粒 體的提議。HCTl 16結(jié)腸癌細胞中FD)(R基因的靶向破壞顯示其是存活必需的；基因拷貝數(shù)的 降低造成對5-氟尿嘧啶-誘導(dǎo)的凋亡的敏感性的降低09)，而FD)(R是p53家族的靶基因 (30)。Fdxr的過表達使結(jié)腸癌細胞對H202、5-氟尿嘧啶和阿霉素-誘導(dǎo)的細胞死亡敏感，表 明Fdxr通過在線粒體中產(chǎn)生氧化應(yīng)激促成p53-介導(dǎo)的凋亡。因此，激活的p53部分是通過 ROS誘導(dǎo)響應(yīng)于細胞應(yīng)激的凋亡，并且p53同時增加FD)(R基因的轉(zhuǎn)錄，這通過增加ROS-誘 導(dǎo)的凋亡依次增強了 P53功能(29，30)?，F(xiàn)在本文顯示了 ！^hit在線粒體級分中的存在；當(dāng)!^hit被過表達或!^hit-表達細 胞受到應(yīng)激時，i^hit可保護Fdxr不受蛋白體降解，導(dǎo)致Fdxr蛋白水平的增加，這與ROS的 產(chǎn)生有關(guān)并跟隨有凋亡。i^hit不影響FD)(R轉(zhuǎn)錄水平但可影響蛋白的穩(wěn)定性。在缺乏!^hit 和p53 二者的H1299細胞中，F(xiàn)dxr過表達增加對ROS-誘導(dǎo)的細胞死亡的敏感性，表達可誘 導(dǎo)的!^hit或p53的H1299細胞對ROS-誘導(dǎo)的細胞死亡敏感；缺乏^Η、ρ53或二者的癌細 胞將缺乏增加Fdxr表達的方式，并將對氧化損傷更不敏感，并將存活。!^hit在凋亡中通過與Fdxr相互作用的線粒體功能的發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在延伸了在大多數(shù) 癌癥中順序丟失的并參與對DNA損傷的應(yīng)答的重要腫瘤抑制物!^hit和ρ53的功能平行物， 并闡明它們的差異，Ρ53充當(dāng)轉(zhuǎn)錄水平的Fdxr調(diào)控物，而!^hit充當(dāng)轉(zhuǎn)錄后Fdxr調(diào)控物。對 Fhit抑制途徑的直接下游效應(yīng)物的描繪將導(dǎo)致對可影響激活!^hit途徑的預(yù)防和治療策略 的i^hit功能的機制研究。ROS產(chǎn)生對!^hit-介導(dǎo)的凋亡至關(guān)重要的發(fā)現(xiàn)強調(diào)了 !^hit丟失作為陰性預(yù)后因子 在不同臨床環(huán)境中的重要性；例如，評估腫瘤發(fā)生前或腫瘤病癥中的i^hit狀態(tài)可預(yù)測對抗 氧化劑治療的應(yīng)答。
為了鑒定與!^hit相互作用以實現(xiàn)下游凋亡途徑的蛋白，本文中本發(fā)明人在肺癌 細胞中于病毒介導(dǎo)的i^hit過表達后交聯(lián)了細胞內(nèi)的蛋白，并表征了與!^hit相關(guān)的蛋白和 它們所影響的途徑。結(jié)果Fhit蛋白復(fù)合體的分離-為了鑒定!^hit-相互作用蛋白，我們產(chǎn)生了攜帶在其 3'端用編碼Hk6表位標(biāo)簽的序列修飾的raiTcDNA的腺病毒(AdFHIT-His6)。A549細胞中 表達的該標(biāo)簽的i^hit蛋白的生物活性與野生型!^hit活性相當(dāng)(圖8)。對Fhit-誘導(dǎo)的凋亡易感的A549肺癌衍生細胞(10)用AdFHIT或AdFHIT-Hk6進 行感染，并用DSP處理，DSP是橫穿膜并于體內(nèi)固定復(fù)合體中的蛋白的交聯(lián)劑。裂解細胞， 并用對Hk6表位標(biāo)簽親和的鎳珠分離蛋白。用二硫蘇糖醇處理純化蛋白以切割DSP并使 復(fù)合體解離，并通過胰蛋白酶消化；通過LC-MS/MS鑒定蛋白成分(圖7-表1和圖9)。
權(quán)利要求
1.一種能夠分離Fhit-His6的腺病毒，該腺病毒包括攜帶raiT-His6 cDNA的腺病毒。
2.一種分離外源過表達的Fhit-His6的方法，該方法包括使用攜帶raiT-His6 cDNA的 腺病毒，其中通過His標(biāo)簽分離所述Fhit-His6。
3.—種重組腺病毒，該重組腺病毒攜帶在其3’用編碼六組氨酸表位標(biāo)簽的序列修飾 的脆性組氨酸三聯(lián)體(Fhit)FHIT cDNA (AdFHIT-His6)。
4.一種在至少一個細胞中介導(dǎo)凋亡過程的方法，該方法包括使所述細胞暴露于足以在 所述細胞中介導(dǎo)所述凋亡過程的量的脆性組氨酸三聯(lián)體(Fhit)基因產(chǎn)物。
5.一種在細胞中誘導(dǎo)凋亡過程的方法，該方法包括使所述細胞暴露于足以在所述細胞 中引起活性氧簇(ROS)產(chǎn)生的量的脆性組氨酸三聯(lián)體(Fhit)基因產(chǎn)物。
6.一種在至少一個細胞中介導(dǎo)凋亡過程的方法，該方法包括使所述細胞暴露于足量 的脆性組氨酸三聯(lián)體(Fhit)基因產(chǎn)物，以允許Fhit進入所述細胞中的線粒體，與所述細胞 中的Fdxr蛋白相互作用并引起與ROS產(chǎn)生相關(guān)的Fdxr蛋白水平的增加，從而引起所述細 胞中的凋亡過程的變化。
7.一種制備野生型FDXR(鐵氧還蛋白還原酶)cDNA的方法，該方法包括使用引物序 列 5，-CTgTTCCCAgCCATggCTTCgCgCTg-3，(正向)[SEQ ID NO 28]和 5，-TCAgTggCCCAggAg gCgCAgCATC-3’ [SEQ IDNO 29]進行 PCR 擴增；和亞克隆擴增產(chǎn)物至 pcDNA3. l/V5_HisT0P0 TA載體。
8.一種制備V5標(biāo)簽的FDXR (鐵氧還蛋白還原酶)cDNA的方法，該方法包括用引物序 列正向5，-CTgTTCCCAgCCATggCTTCgCgCTg-3，[SEQ ID NO :30]，反向5，-gTggCCCAggAg gCgCAgCATC-3’ [SEQ IDNO 31]進行 PCR 擴增；和亞克隆擴增產(chǎn)物至 pcDNA3. l/V5_HisT0P0 TA載體。
9.一種產(chǎn)生重組腺病毒的方法，該方法包括制備攜帶野生型ΠΠΤ cDNA的重組腺病 毒(AdFHIT)；和使用以下列寡核苷酸進行的PCR產(chǎn)生His標(biāo)簽的HlIT cDNA 5' -ACgTggA TCCCTgTgAggACATgTCgTTCAgATTTggC-3 ‘(正向)[SEQ ID NO 26]，和 5 ‘ -TTgTggATCCTTAT CAgTgATggTgATggTgATgCgATCCTCTCTgAAAgTAgACCCgCAg-3' [SEQ ID NO :27]。
10.一種在癌癥細胞中觸發(fā)凋亡的方法，該方法包括恢復(fù)所述癌癥細胞中的Fhit蛋白 的表達。
11.一種診斷受治療者是否具有癌癥相關(guān)疾患或處于發(fā)展所述疾患的風(fēng)險的方法，該 方法包括測量所述受治療者的測試樣品中至少脆性組氨酸三聯(lián)體(Fhit)基因的水平，其 中所述測試樣品中Fhit基因產(chǎn)物的水平相對于對照樣品中對應(yīng)的Fhit基因產(chǎn)物的水平的 改變，指示所述受治療者具有癌癥相關(guān)疾患或處于發(fā)展所述疾患的風(fēng)險。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述至少一種Fhit基因產(chǎn)物的水平是使用RNA印 跡分析測量的。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中測試樣品中所述至少一種Fhit基因產(chǎn)物的水平小 于對照樣品中對應(yīng)的Fhit基因產(chǎn)物的水平。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中測試樣品中所述至少一種Fhit基因產(chǎn)物的水平大 于對照樣品中對應(yīng)的Fhit基因產(chǎn)物的水平。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其中Fhit水平中的至少一個高于預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)水平。
16.如權(quán)利要求11所述的方法，其中Fhit水平中的至少一個低于預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)水平。
17.—種診斷受治療者中與一種或多種預(yù)后標(biāo)志物相關(guān)的癌癥的方法，該方法包括測 量所述受治療者的樣品中至少一種i^hit基因產(chǎn)物的水平，其中測試樣品中所述至少一種 Fhit基因產(chǎn)物的水平相對于對照樣品中對應(yīng)的!^hit基因產(chǎn)物的水平的改變，指示所述受 治療者具有與所述一種或多種預(yù)后標(biāo)志物相關(guān)的癌癥。
18.—種診斷受治療者是否具有癌癥相關(guān)疾患或處于發(fā)展所述疾患的風(fēng)險的方法，該 方法包括(1)反轉(zhuǎn)錄來自從所述受治療者獲得的測試樣品的RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸；(2)使所述靶寡脫氧核苷酸與包含!^hit特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，以提供測 試樣品的雜交譜；以及(3)比較測試樣品雜交譜和由對照樣品產(chǎn)生的雜交譜，其中至少一種i^hit基因的信號的改變指示所述受治療者具有所述疾患或處于發(fā)展所 述疾患的風(fēng)險。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中至少一種!^hit基因的信號相對于由對照樣品產(chǎn)生 的信號是下調(diào)的。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中至少一種!^hit基因的信號相對于由對照樣品產(chǎn)生 的信號是上調(diào)的。
21.—種診斷受治療者是否具有與受治療者中的一種或多種有害的預(yù)后標(biāo)志物相關(guān)的 癌癥或處于發(fā)展所述癌癥的風(fēng)險的方法，該方法包括(1)反轉(zhuǎn)錄來自從所述受治療者獲得的測試樣品的RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸；(2)使所述靶寡脫氧核苷酸與包含!^hit特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交以提供測 試樣品的雜交譜；以及(3)比較測試樣品雜交譜和由對照樣品產(chǎn)生的雜交譜，其中信號的改變指示所述受治療者具有所述疾患或處于發(fā)展所述疾患的風(fēng)險。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述微陣列包含至少一種!^hit基因。
23.一種治療受治療者中癌癥相關(guān)疾患的方法，所述受治療者具有其中至少一種!^hit 基因在所述受治療者的癌細胞中相對于對照細胞下調(diào)或上調(diào)的疾患，所述方法包括(1)當(dāng)所述至少一種i^hit基因在癌細胞中被下調(diào)時，向所述受治療者施用有效量的至 少一種分離的I^hit基因產(chǎn)物，以使所述受治療者中的癌細胞增殖受到抑制；或(2)當(dāng)所述至少一種!^hit基因在癌細胞中被上調(diào)時，向所述受治療者施用有效量的用 于抑制所述至少一種i^hit基因的表達的至少一種化合物，以使所述受治療者中的癌細胞 增殖受到抑制。
24.一種治療受治療者中的癌癥相關(guān)疾患的方法，該方法包括(1)確定相對于對照樣品，患有所述疾患的受治療者的細胞樣品中至少一種冊^基因 產(chǎn)物的量；以及(2)通過以下改變樣品細胞中表達的!^hit基因產(chǎn)物的量i)如果癌細胞中表達的所述i^hit基因產(chǎn)物的量小于對照細胞中表達的所述!^hit基因 產(chǎn)物的量，向所述受治療者施用有效量的至少一種分離的i^hit基因產(chǎn)物；或 )如果癌細胞中表達的所述i^hit基因產(chǎn)物的量大于對照細胞中表達的所述!^hit基 因產(chǎn)物的量，向所述受治療者施用有效量的抑制所述至少一種i^hit基因產(chǎn)物表達的至少一種化合物，以使所述受治療者中的癌細胞增殖受到抑制。
25.一種用于治療癌癥相關(guān)疾患的藥物組合物，該藥物組合物包含至少一種分離的 Fhit基因產(chǎn)物和藥學(xué)上可接受的載體。
26.如權(quán)利要求25所述的藥物組合物，其中所述至少一種分離的!^hit基因產(chǎn)物對應(yīng)于 相對于合適的對照細胞在樣品細胞中上調(diào)或下調(diào)的i^hit基因產(chǎn)物。
27.一種用于治療癌癥相關(guān)疾患的藥物組合物，該藥物組合物包含至少一種!^hit表達 抑制劑化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
28.如權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中所述至少一種!^hit表達抑制劑化合物是相 對于合適的對照細胞在樣品細胞中上調(diào)的i^hit基因產(chǎn)物特異性的。
29.一種鑒定抗癌劑的方法，該方法包括向細胞提供測試劑并測量與癌細胞中降低的 表達水平相關(guān)的至少一種i^hit基因產(chǎn)物的水平，其中所述細胞中所述!^hit基因產(chǎn)物的水 平相對于合適的對照細胞的增加，指示所述測試劑是抗癌劑。
30.一種鑒定抗癌劑的方法，該方法包括向細胞提供測試劑并測量與癌細胞中增加的 表達水平相關(guān)的至少一種i^hit基因產(chǎn)物的水平，其中所述細胞中所述!^hit基因產(chǎn)物的水 平相對于合適的對照細胞的降低，指示所述測試劑是抗癌劑。
31.一種鑒定!^hit表達和疾病或病癥之間的關(guān)聯(lián)的方法，該方法包括鑒定與正常樣品 相比疾病或病癥的代表性樣品中i^hit的差異表達。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中鑒定包括a)標(biāo)記樣品中的!^hit；和b)將所述標(biāo) 記的Fhit與Fhit陣列雜交。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述樣品中的!^hit是在標(biāo)記之前或之后分離的。
34.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述樣品是生物樣品。
35.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述生物樣品是來自患者。
36.如權(quán)利要求31所述的方法，其中!^hit譜是通過包括以下的過程產(chǎn)生的a)標(biāo)記樣 品中的i^hihb)將所述!^hit與!^hit陣列雜交；以及，c)確定與所述陣列的!^hit雜交，其 中產(chǎn)生Fhit譜。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述!^hit陣列包含!^hit探針，所述!^hit探針具 有包括完整加工的i^hit序列的!^hit編碼序列。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述!^hit編碼序列還包括位于所述加工的!^hit 序列上游和/或下游的編碼序列的至少2-5個核苷酸。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述!^hit編碼序列包括位于所述加工的!^hit序 列上游和下游的編碼序列的4個核苷酸。
40.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述!^hitNA陣列包含!^hit探針，所述!^hit探針 進一步包含c)側(cè)翼于所述i^hit編碼序列的至少第一連接體序列。
41.一種介導(dǎo)凋亡過程的方法，該方法包括使用鐵氧還蛋白還原酶三聯(lián)體Phit)通過 與鐵氧還蛋白還原酶(Fdxr) —起參與活性氧簇(R0Q產(chǎn)生來介導(dǎo)所述凋亡過程。
42.一種鑒定!^hit相互作用物的方法，所述方法如本文所述。
43.Fhit丟失作為陰性預(yù)后因子的用途。
44.Fhit丟失作為陰性預(yù)后因子在評估腫瘤發(fā)生前病癥或腫瘤病癥中的!^hit狀態(tài)中的用途。
45.Fhit丟失作為預(yù)測因子預(yù)測對抗氧化劑治療的應(yīng)答的用途。
46.靶向Hsp伴侶蛋白的組合物，！^hit可通過所述Hsp伴侶蛋白進入線粒體并啟動其凋亡途徑。
47.具有效力的組合物在與早期!^hit丟失相關(guān)的病癥中的用途。
48.具有效力的組合物在與早期!^hit丟失相關(guān)的腫瘤發(fā)生前病癥中的用途。
49.具有效力的組合物在與早期!^hit丟失相關(guān)的腫瘤或其他病癥中的用途。
全文摘要
本文提供使用Fhit基因診斷、預(yù)后和治療癌癥相關(guān)疾患的方法和組合物。
文檔編號C12N15/00GK102137927SQ200880119206
公開日2011年7月27日 申請日期2008年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月26日
發(fā)明者C·M·克羅斯, F·特拉帕索 申請人:俄亥俄州立大學(xué)研究基金會