被加工為發(fā)酵木糖和阿拉伯糖的啤酒酵母的遺傳修飾菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供微生物能將阿拉伯糖發(fā)酵為期望的產(chǎn)物諸如乙醇。在一些實施方式中，生物也能發(fā)酵木糖。在一些實施方式中，生物能發(fā)酵阿拉伯糖和木糖，及表達(dá)一種或更多纖維素酶。
【專利說明】被加工為發(fā)酵木糖和阿拉伯糖的啤酒酵母的遺傳修飾菌株
【【背景技術(shù)】】
[0001]能量轉(zhuǎn)變，利用及獲取成為我們的時代的許多大挑戰(zhàn)(包括與可持續(xù)性，環(huán)境質(zhì)量，安全及貧困關(guān)聯(lián)的那些)的基礎(chǔ)。需要新出現(xiàn)技術(shù)的新應(yīng)用，以應(yīng)對這些挑戰(zhàn)。生物技術(shù)，最有力的新出現(xiàn)技術(shù)之一，可引起重要新能量轉(zhuǎn)變過程。植物生物質(zhì)和其衍生物是將能量生物學(xué)轉(zhuǎn)變?yōu)閷θ说烙杏玫男问降馁Y源。
[0002]在植物生物質(zhì)形式之中，木質(zhì)纖維素生物質(zhì)(“生物質(zhì)”)特別良好適合于能量應(yīng)用，因為其大規(guī)模利用度，低成本和環(huán)境上良性生產(chǎn)。尤其是，基于纖維素生物質(zhì)的許多能量產(chǎn)生和利用循環(huán)在整個生命周期具有接近O的溫室氣體排放。阻礙自生物質(zhì)原料更廣泛產(chǎn)生能量的主要障礙是克服反抗生物質(zhì)物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)橛杏玫漠a(chǎn)物的低-成本技術(shù)的一般性缺失。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)含有碳水化合物級分(例如，纖維素和半纖維素)包括戊糖(例如，木糖和阿拉伯糖)，其可轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖蓟蚱渌a(chǎn)物諸如乳酸和乙酸。為了轉(zhuǎn)變木質(zhì)纖維素級分，必需將纖維素，半纖維素和戊糖最終轉(zhuǎn)變?yōu)閱翁?；此轉(zhuǎn)變步驟歷來是個問題。
[0003]涉及酶促或微生物水解的生物質(zhì)處理方案通常涉及4個生物學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化:(I)產(chǎn)生解糖酶(纖維素酶和半纖維素酶)；(2)將存在于預(yù)處理的生物質(zhì)中的碳水化合物組分水解為糖；(3)發(fā)酵己糖(例如，葡萄糖，甘露糖和半乳糖)；及(4)發(fā)酵戊糖(例如，木糖和阿拉伯糖)。這4個轉(zhuǎn)化在被稱為鞏固生物處理(CBP)的工藝配置中在單步驟發(fā)生，其區(qū)別于其他欠高度整合的配置在于其不涉及用于纖維素酶和/或半纖維素酶產(chǎn)生的專門的加工步驟。
[0004]CBP提供相 比特征為專門的纖維素酶產(chǎn)生的過程更低成本和更高效率的潛力。益處部分來自避免的資本成本，底物和其他原材料，及與纖維素酶產(chǎn)生關(guān)聯(lián)的實用性。此外，幾個因素支持使用CBP更高速度的水解的實現(xiàn)，及因此減少的反應(yīng)器體積和資本投資，包括酶-微生物協(xié)同和嗜熱生物和/或復(fù)合的纖維素酶系統(tǒng)的使用。而且，纖維素-附著的解纖維素微生物是可能與非-粘附的微生物，例如，混雜物成功地就纖維素水解的產(chǎn)物進(jìn)行競爭。期望微生物的成功的競爭基于微生物纖維素利用增加工業(yè)過程的穩(wěn)定性。開發(fā)致使CBP的微生物中的進(jìn)展通過以下2個策略進(jìn)行:加工天然存在的解纖維素微生物，以改善產(chǎn)品-相關(guān)的性質(zhì)，諸如產(chǎn)率和滴度；及加工呈現(xiàn)高產(chǎn)物產(chǎn)率和滴度的非-解纖維素生物，以表達(dá)致使纖維素和半纖維素利用的異源纖維素酶和半纖維素酶系統(tǒng)。
[0005]應(yīng)對乙醇生產(chǎn)的需求的一種方式轉(zhuǎn)變生物質(zhì)，即，材料諸如農(nóng)業(yè)廢棄物，玉米殼，玉米芯，纖維素材料，等中發(fā)現(xiàn)的糖而產(chǎn)生乙醇。大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用中的有效生物質(zhì)轉(zhuǎn)變需要能耐受高濃度的糖和乙醇，且能同時發(fā)酵多于一種糖的微生物。
[0006]戊糖在自然界極其豐富。多至40%的木質(zhì)纖維素材料可包含戊糖(Ladisch etal., “Process considerat1ns in the enzymatic hydrolysis of b1mass.，’Enz.Microb.Technol., 5:82-100.(1983))。通過發(fā)酵，戊糖可轉(zhuǎn)化為可用作液體燃料或化學(xué)原料的乙醇。盡管許多微生物具有發(fā)酵簡單己糖的能力，戊糖，木糖和阿拉伯糖是生物質(zhì)中最難代謝的糖。一些微生物可將戊糖發(fā)酵為乙醇和其他副產(chǎn)物，且已遺傳加工具有改善的自戊糖產(chǎn)生乙醇的微生物。但 是，已在敏感于低pH和高濃度的乙醇的細(xì)菌中進(jìn)行許多這些研究。因此，發(fā)酵中它們的使用相關(guān)于不期望的副產(chǎn)物形成，及它們能產(chǎn)生的乙醇水平仍低。
[0007]面包酵母(啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae))是產(chǎn)生乙醇的優(yōu)選的微生物
(Hahn-Hagerdal, B.,等人，Adv.B1chem.Eng.B1technol.73, 53 - 84 (2001))。此微
生物的有利屬性是(i)接近理論產(chǎn)率的高產(chǎn)率(0.51g產(chǎn)生的乙醇/g使用的葡萄糖)，(ii)高滲透-及乙醇耐受性，(iii)工業(yè)加工中天然的穩(wěn)健性，也(iv)由于其長期與葡萄酒及面包制造，及啤酒釀造相關(guān)而通常被認(rèn)為安全(GRAS)。此外，啤酒酵母(S.cerevisiae)對通常在自生物質(zhì)預(yù)處理的得到的水解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的抑制物呈現(xiàn)耐受性。但是，啤酒酵母(S.cerevisiae)天然地不斷裂纖維素組分,也不有效使用戍糖。
[0008]已在加工啤酒酵母(S.cerevisiae)而致使其表達(dá)斷裂纖維素的異源酶中獲得進(jìn)展。(見例如美國申請N0.13/130，549和PCT/US2011/039192，在本文通過引用以它們的整體合并)。但是，未在酵母中展示為工業(yè)產(chǎn)乙醇發(fā)酵而利用阿拉伯糖。此外，對也能斷裂纖維素的能有效利用阿拉伯糖和木糖的產(chǎn)乙醇生物有需求。當(dāng)全部纖維素和半纖維素斷裂為單體糖及發(fā)酵為期望的產(chǎn)物時獲得最高產(chǎn)物產(chǎn)率。
[0009]因此，本領(lǐng)域?qū)δ芤詫τ谏虡I(yè)可應(yīng)用性足夠的量發(fā)酵戊糖的產(chǎn)乙醇生物有需求。也需要將有效 戊糖利用與纖維素消化組合，以便最大化纖維素原料使用效率及產(chǎn)生產(chǎn)物的
最高產(chǎn)率。
[0010]【發(fā)明概述】
[0011]本發(fā)明提供能將阿拉伯糖發(fā)酵為期望的產(chǎn)物諸如乙醇的微生物。在一些實施方式中，生物也能發(fā)酵木糖。在一些實施方式中，生物能發(fā)酵阿拉伯糖和木糖，及表達(dá)一種或更多纖維素酶。
[0012]在一些實施方式中，本發(fā)明提供重組真核生物宿主細(xì)胞，其包含:編碼阿拉伯糖轉(zhuǎn)運子(AraT)的異源多核苷酸，編碼阿拉伯糖異構(gòu)酶(Al)的異源多核苷酸，編碼核酮糖激酶(RK)的異源多核苷酸和編碼核酮糖5-磷酸差向異構(gòu)酶(R5PE)的異源多核苷酸。
[0013]在一些實施方式中，本發(fā)明提供重組真核生物宿主細(xì)胞，其包含:編碼阿拉伯糖異構(gòu)酶(Al)的異源多核苷酸，編碼核酮糖激酶(RK)的異源多核苷酸和編碼核酮糖5-磷酸差向異構(gòu)酶(R5PE)的異源多核苷酸，其中Al，RK和R5PE之一種或更多源于多形擬桿菌(B.theta1tamicron)的 Al, RK 和 R5PE。
[0014]在一些實施方式中，重組真核生物宿主含有源于選自下列的生物的AraT的AraT:單抱神食酵母(Ambros1zyma monospora) (LAT2)，阿拉伯糖發(fā)酵假絲酵母(Candida arabinofermentans),單抱神食酵母(Ambros1zyma monospora)(LATl)，馬克思克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus) (LATl)，季也蒙氏畢赤酵母(Pichiagui I lermondii) (LATl)，季也蒙氏畢赤酵母(Pichia gui I lermondii) (LAT2)，具柄畢赤酵母(Pichia stipites),單抱神食酵母(Ambros1zyma monospora) (LAT2),漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hensenii),黃曲霉(Apergillus flavus), 土曲霉(Aspergillusterreus),費希新薩托菌(Neosartorya fischeri),黑曲霉(Aspergillus niger),馬尼弗氏青霉(Penicillium marneffei),波薩達(dá)球抱子菌(Coccid1ides posadasii),玉米赤霉(Gibberella zeae)，稻梨抱(Magnaporthe oryzae)，裂裙菌(Schizophyllum commune)，具柄畢赤酵母(Pichia stipites),糖酵母屬(Saccaharomyces)HXT2,棒曲霉(Aspergillusclavatus)(ACLA_032060)，油菜核盤菌(Sclerotinia sclerot1rum)(SS1G_01302)，苯黑米節(jié)皮菌(Arthroderma benhamiae) (ARB—03323)，馬發(fā)癬菌(Trichophytonequinum) (TEQG—03356)，削斷發(fā)癬菌(Trichophyton tonsurans) (G—04876)，粗球抱子菌(Coccid1ides immitis) (CIMG—09387)，波薩達(dá)球抱子菌(Coccid1ides posadasii)(CPSG—03942)，波薩達(dá)球孢子菌(Coccid1ides posadasii) (CPC735—017640)，富氏葡萄抱盤菌(Botryotinia fuckeliana) (BC1G—08389)，偃麥草核腔菌(Pyrenophoratr it ic1-repent is) (PTRG—10527)，玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis) (UM03895.1)，葡萄牙棒抱酵母(Clavispora lusitaniae) (CLUG—02297)，季也蒙氏畢赤酵母(Pichiagui I lermondii) (LATl)，季也蒙氏畢赤酵母(Pichia gui I lermondii) (LAT2)，漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii) (DEHA2E01166g)，具柄畢赤酵母(Pichia stipites)，白色假絲酵母(Candida albicans)，漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)(DEHA2B16082g)，馬克思克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus) (LATl)，乳克魯維酵母(Kluyveromyces lactis) (KLLA-0RF10059)，耐熱克魯維酵母(Lachanceathermotolerans)(KLTH0H13728g)，多抱范氏酵母(Vanderwaltozyma polyspora) (Kpol—281p3)，魯氏結(jié)合酵母(Zygosaccharomyces rouxii) (ZYR00E03916g)，巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)(0.1833)，阿拉伯糖發(fā)酵假絲酵母(Candida arabinofermentans) (0.1378)，單抱神食酵母(Ambros1zyma monospora) (LATl)，棒曲霉(Aspergillus clavatus) (ACLA—044740)，費希新薩托菌(Neosartorya fischeri) (NFIA—094320)，黃曲霉(Aspergillus flavus)(AFLA—116400)，土曲霉(Aspergillus terreus) (ATEG—08609)，黑曲霉(Aspergillusniger) (ANI—I—1064034)，密集踝節(jié)菌(Telaromyces stipitatus) (TSTA—124770)，產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum) (Pc20g01790)，產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)(Pc20g01790) #2，玉米赤霉(Gibberella zeae) (FG10921.1)，赤球叢赤殼菌(Nectriahematococco)及禾生病霉(Glomerellagraminicola) (GLRG—10740)。
[0015]在一些實施方式中，重組真核生物宿主細(xì)胞包含編碼與SEQ ID N0:9~20的氨基酸序列之任一個具有至少80%同一性的氨基酸序列的AraT。在一些實施方式中，重組真核生物宿主包含異源Al，RK和R5PE，其中Al，RK和R5PE之一種或更多源于多形擬桿菌(B.theta1tamicron)的 Al，RK 和 R5PE。
[0016]在其他實施方式中，本發(fā)明包含表達(dá)阿拉伯糖異構(gòu)酶(Al)，核酮糖激酶(RK)和核酮糖-5-磷酸差向異構(gòu)酶(R5PE)的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中Al包含與SEQ IDN0:6的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列；RK包含與SEQ ID NO: 7的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列 '及，R5PE包含與SEQ ID N0:8的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。在進(jìn)一步實施方式中，本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞還包含編碼木糖異構(gòu)酶(XI)的異源多核苷酸。
[0017]在一些實施方式中，一種或更多異源多核苷酸的表達(dá)給重組宿主細(xì)胞賦予發(fā)酵阿拉伯糖的能力。在一些實施方式中，重組真核生物宿主細(xì)胞還包含編碼木糖異構(gòu)酶(XI)的異源多核苷酸。在進(jìn)一步實施方式中，XI源于多形擬桿菌(B.theta1tamicron)的XI。在一些實施方式中，XI包含與SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 26的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
[0018] 在一些實施方式中，宿主細(xì)胞是選自下列的酵母細(xì)胞:啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，粟酒裂殖酵母(Schizzosaccharomyces pombe)，白色假絲酵母(Candidaalbicans),巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris),具柄畢赤酵母(Pichia stipitis),解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica),多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha),紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma)，產(chǎn)月元假絲酵母(Candida utilis)，Arxula adeninivorans,漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii),多形德巴利酵母(Debaryomyces polymorphus),粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和西方許旺氏酵母(Schwann1mycesoccidentalis)。
[0019]在一些實施方式中，酵母細(xì)胞包含編碼下列酶的異源序列:木酮糖激酶，核酮糖5-磷酸異構(gòu)酶，核酮糖5-磷酸差向異構(gòu)酶，轉(zhuǎn)酮酶和轉(zhuǎn)醛醇酶，及酵母細(xì)胞不表達(dá)能催化木糖向木糖醇的轉(zhuǎn)變的醛糖還原酶。
[0020]在一些實施方式中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括:
[0021](a)將本發(fā)明的重組真核生物宿主細(xì)胞與底物組合；
[0022](b)使宿主細(xì)胞發(fā)酵該底物；及，
[0023](C)回收一種或更多發(fā)酵產(chǎn)物，
[0024]其中底物選自:纖維素底物，生物質(zhì)原料和其組合。
[0025]在一些實施方式中，本發(fā)明涉及包含碳源和重組真核生物宿主細(xì)胞的組合物。
[0026]在一些實施方式中，本發(fā)明涉及培養(yǎng)基上清液，其通過使宿主細(xì)胞與含有碳源的
培養(yǎng)基溫育而產(chǎn)生。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0027]圖1描繪蛋白序列的相似性與阿拉伯糖轉(zhuǎn)運子活性的種系發(fā)生圖。
[0028]圖2描繪蛋白序列的相似性與可能的阿拉伯糖轉(zhuǎn)運子活性的種系發(fā)生圖。
[0029]圖3描繪自阿拉伯糖攝取測定的結(jié)果。將啤酒酵母(S.cerevisiae)株用表達(dá)源于指示的物種的阿拉伯糖轉(zhuǎn)運子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。將陰性對照株用空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。在接種之前和接種后48小時測量阿拉伯糖濃度。
[0030]圖4描繪用來編譯阿拉伯糖利用通路的組分及使組件靶向用于重組進(jìn)酵母基因組的rDNA位點的DNA構(gòu)建體組件(即阿拉伯糖轉(zhuǎn)運子(AraT)，阿拉伯糖異構(gòu)酶(Al)，核酮糖激酶(RK)和核酮糖5-磷酸差向異構(gòu)酶(R5PE)，共同地，阿拉伯糖-利用構(gòu)建體)。
[0031]圖5描繪電泳凝膠圖像，其描繪共轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母而組裝為圖4中描繪的阿拉伯糖-利用構(gòu)建體，及整合進(jìn)酵母基因組的個體擴增子。
[0032]圖6描繪向轉(zhuǎn)化添加阿拉伯糖-利用構(gòu)建體的DNA組分或不向轉(zhuǎn)化添加DNA的酵母轉(zhuǎn)化的結(jié)果。在含有阿拉伯糖作為唯一糖的培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。集落僅在成功的轉(zhuǎn)化和阿拉伯糖-利用構(gòu)建體整合進(jìn)祖先細(xì)胞的基因組時生長。
[0033]圖7描繪在使用含有阿拉伯糖-利用構(gòu)建體的啤酒酵母(S.cerevisiae)株(2874+ara)對比對照株(2874)的發(fā)酵實驗中的經(jīng)時阿拉伯糖和乙醇水平。對照株不使用阿拉伯糖及不產(chǎn)生乙醇，然而含有阿拉伯糖-利用構(gòu)建體的株使用阿拉伯糖和能將阿拉伯糖發(fā)酵為乙醇。
[0034]圖8描繪使用含有阿拉伯糖-利用構(gòu)建體的啤酒酵母(S.cerevisiae)株(2874+ara)對比對照株(2874)的發(fā)酵實驗中經(jīng)時阿拉伯糖，木糖和乙醇水平。對照株不使用阿拉伯糖，但可自存在于培養(yǎng)基中的木糖產(chǎn)生乙醇。含有阿拉伯糖-利用構(gòu)建體(2874+ara)的株能將阿拉伯糖發(fā)酵為乙醇，其解釋相比對照株增加的乙醇產(chǎn)生。
[0035]圖9描繪使用含有阿拉伯糖-利用構(gòu)建體(2874+ara)的啤酒酵母(S.cerevisiae)株對比對照株(2874)的發(fā)酵實驗中經(jīng)時阿拉伯糖,葡萄糖和乙醇水平。對照株不使用阿拉伯糖，但可自存在于培養(yǎng)基中的葡萄糖產(chǎn)生乙醇。含有阿拉伯糖-利用構(gòu)建體(2874+ara)的株能將阿拉伯糖發(fā)酵為乙醇，其解釋相比對照株增加的乙醇產(chǎn)生。
[0036]圖10描繪使用含有阿拉伯糖-利用構(gòu)建體(2874+ara)的啤酒酵母(S.cerevisiae)株對比對照株(2874)的發(fā)酵實驗中經(jīng)時阿拉伯糖,木糖,葡萄糖和乙醇水平。對照株不使用阿拉伯糖，但可自存在于培養(yǎng)基中的葡萄糖和木糖產(chǎn)生乙醇。含有阿拉伯糖-利用構(gòu)建體(2874+ara)的株能將阿拉伯糖發(fā)酵為乙醇，其解釋相比對照株增加的乙醇產(chǎn)生。
[0037]圖11~13描繪獲自在表達(dá)本發(fā)明的阿拉伯糖利用基因和也表達(dá)來自梨囊鞭菌屬(Pyromyces)物種的木糖異構(gòu)酶的啤酒酵母(S.cerevisiae)株中的阿拉伯糖利用測定的結(jié)果。使酵母株在YPX上預(yù)生長，洗滌及用來接種含25ml培養(yǎng)基的150ml密封的瓶，將其用N2沖洗及于35°C以250RPM溫育。將培養(yǎng)物采樣用于在0，24和48小時HPLC。未在YPA上觀察到生長。在YPAXD中克隆I消耗3.TgY1阿拉伯糖。當(dāng)木糖和葡萄糖已被耗竭時，其一半以上(2.1gr1)在24和48h之間被消耗。圖標(biāo):0(親本株)，1(親本株+ara基因，克隆I)，2 (親本株+ara基因，克隆2)。
[0038]【發(fā)明詳述】 [0039]此說明書公開合并本發(fā)明的特征的一個或更多實施方式。公開的實施方式僅例示本發(fā)明。本發(fā)明的范圍不限于公開的實施方式。本發(fā)明被隨附的權(quán)利要求定義。
[0040]在以下說明中，為解釋的目的，設(shè)置特定數(shù)，材料和配制，以便提供本發(fā)明的充分理解。但是，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員明晰，本發(fā)明可脫離這些特定細(xì)節(jié)而實行。在一些實例中，熟知的特征可被忽略或簡化，只要不使本發(fā)明難以理解。
[0041]說明書中描述及參照實施方式為“一實施方式”，“一實施方式”，“一例實施方式”，等，指示描述的實施方式可包括特定特征，結(jié)構(gòu)或特征，但每個實施方式可不必然包括特定特征，結(jié)構(gòu)或特征。而且，該短語不是必然指稱相同的實施方式。而且，當(dāng)關(guān)聯(lián)一實施方式描述特定特征，結(jié)構(gòu)或特征時，需知，在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識之內(nèi)的是，對于其他實施方式也影響該特征，結(jié)構(gòu)或特征，無論是否明確地描述。
[0042]描述“a”或“an”物品在本文可指稱單物品或多物品。需知，無論何處在本文用語言“包含”描述實施方式，也提供以術(shù)語“由...組成”和/或“基本上由...組成”描述的另外類似實施方式。
[0043]【定義】
[0044]術(shù)語“異源”當(dāng)參照多核苷酸，基因，多肽，或酶使用時，指稱未正常見于宿主生物中的多核苷酸，基因，多肽，或酶?！爱愒础币舶ㄒ圆煌趯?yīng)天然基因，例如，不在生物的基因中的其天然的位置組或具有不同調(diào)控序列的形式再導(dǎo)入源生物的天然編碼區(qū)，或其部分?？蓪愒炊嗪塑账峄蚧蛴?，例如，基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入宿主生物。異源基因可包括天然編碼區(qū)，其包括再導(dǎo)入天然宿主的非-天然調(diào)控區(qū)的部分嵌合基因。外源基因可包含插入非-天然生物的天然基因，或嵌合基因。異源多核苷酸，基因，多肽，或酶可源于任何源，例如，真核生物，原核生物，病毒或合成多核苷酸片段。[0045]本文所用的術(shù)語“啟動子”是輔助特定基因的轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)。啟動子一般位于接近它們所調(diào)控的基因，在相同的鏈上和上游(向正義鏈的5’區(qū))。術(shù)語“啟動子”或“替代啟動子”旨在包括可轉(zhuǎn)錄控制其不天然轉(zhuǎn)錄控制的目標(biāo)基因的多核苷酸。在特定實施方式中，替代啟動子的轉(zhuǎn)錄控制導(dǎo)致目標(biāo)基因的表達(dá)增加。在特定實施方式中，替代啟動子被放置在目標(biāo)基因的5’側(cè)。替代啟動子可用于取代天然的啟動子，或可在天然的啟動子之外使用。替代啟動子可對于使用其的宿主細(xì)胞為內(nèi)源性的，或其可為導(dǎo)入宿主細(xì)胞的異源多核苷酸序列，例如，對于使用其的宿主細(xì)胞是外源的。
[0046]如本文所用，術(shù)語“終止子”或“轉(zhuǎn)錄終止子”是在用于轉(zhuǎn)錄的基因組DNA上標(biāo)記基因或操縱子的末端的遺傳序列部分。適合于在本發(fā)明中使用的啟動子和終止子包括，例如，見于表1的那些。
[0047] 表1.例示實施方式中使用的啟動子和終止子的序列
[0048]
【權(quán)利要求】
1.重組真核生物宿主細(xì)胞，其包含: 編碼阿拉伯糖轉(zhuǎn)運子(AraT)的異源多核苷酸， 編碼阿拉伯糖異構(gòu)酶(Al)的異源多核苷酸， 編碼核酮糖激酶(RK)的異源多核苷酸，和 編碼核酮糖5-磷酸差向異構(gòu)酶(R5PE)的異源多核苷酸。
2.權(quán)利要求1的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中AraT源于選自下列的生物的AraT:乳克魯維酵母(Kluveromyces Iactis)、耐熱克魯維酵母(Kluveromyces thermotolerans)、魯氏結(jié)合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、多抱范氏酵母(Vanderwaltozyma polyspora)、漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、黑曲霉(Aspergillus niger)、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)、季也蒙氏畢赤酵母(Pichia gui Iermondii)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、葡萄牙假絲酵母(Candida lusitaniae)、白色假絲酵母(Candidaalbicans) (SC5314)、馬克思克魯維酵母(Kluveromyces marxianus)、具柄畢赤酵母(Pichia stipites)及阿拉伯糖發(fā)酵假絲酵母(Candida arabinofermentans)。
3.權(quán)利要求1或2的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中AraT包含與SEQID NO:9~22的氨基酸序列之任一個具有至少80%同一性的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1~3之任一項的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中Al、RK和R5PE之一種或更多源于多形擬桿菌(B.theta1tamicron)的Al、RK和R5PE。
5.重組真核生物宿主細(xì)胞，其包含編碼阿拉伯糖異構(gòu)酶(Al)的異源多核苷酸，編碼核酮糖激酶(RK)的異源多核苷酸和編碼核酮糖5-磷酸差向異構(gòu)酶(R5PE)的異源多核苷酸，其中A1、RK和R5PE之一種或更多源于多形擬桿菌(B.theta1tamicron)的A1、RI^PR5PE。
6.權(quán)利要求4或5的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中 (a)Al包含與SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列； (b)RK包含與SEQID NO: 7的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列；以及 (c)R5PE包含與SEQID NO:8的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1~6之任一項的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中異源多核苷酸的表達(dá)給重組宿主細(xì)胞賦予發(fā)酵阿拉伯糖的能力。
8.權(quán)利要求1~7之任一項的重組真核生物宿主細(xì)胞，其還包含編碼木糖異構(gòu)酶(XI)的異源多核苷酸。
9.權(quán)利要求8的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中XI源于多形擬桿菌(B.theta1tamicron)的 XI。
10.權(quán)利要求8或9的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中XI包含與SEQID NO: 24或SEQ IDNO: 26的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
11.權(quán)利要求1~10之任一項的重組真核生物宿主細(xì)胞,其中宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
12.權(quán)利要求11的重組真核生物宿主細(xì)胞、其中酵母細(xì)胞選自:啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、白色假絲酵母(Candida alb icans)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、具柄畢赤酵母(Pichia stipitis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)、多形漢遜酵母(HansenulapoIymorpha)、紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma)、產(chǎn) I元假絲酵母(Candida utilis)、Arxula adeninivorans、漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、多形德巴利酵母(Debaryomyces polymorphus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和西方許旺氏酵母(Schwann1myces occidentalis)。
13.權(quán)利要求11或12的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中酵母細(xì)胞包含編碼下列酶的異源序列:木酮糖激酶、核酮糖5-磷酸異構(gòu)酶、核酮糖5-磷酸差向異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)酮酶和轉(zhuǎn)醛醇酶，且其中酵母細(xì)胞不表達(dá)能催化木糖向木糖醇的轉(zhuǎn)變的醛糖還原酶。
14.權(quán)利要求1~13之任一項的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞能發(fā)酵木糖、阿拉伯糖或其組合。
15.權(quán)利要求1~14之任一項的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞能發(fā)酵來自纖維素底物的阿拉伯糖。
16.權(quán)利要求14或15的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中發(fā)酵產(chǎn)物選自:乙醇、乳酸、氫、丁酸、丙酮和丁醇。
17.前述權(quán)利要求之任一項的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞是呈現(xiàn)高乙醇耐受性的工業(yè)菌株。
18.權(quán)利要求17的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞還呈現(xiàn)高溫耐受性。
19.前述權(quán)利要求之任一項的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞在自含有20g/l木糖和21g/l阿拉伯糖的培養(yǎng) 基24小時的發(fā)酵后產(chǎn)生至少約10g/l乙醇的乙醇產(chǎn)率。
20.前述權(quán)利要求之任一項的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞在自含有20g/l葡萄糖和21g/l阿拉伯糖的培養(yǎng)基24小時的發(fā)酵后產(chǎn)生至少約13g/l乙醇的乙醇產(chǎn)率。
21.前述權(quán)利要求之任一項的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞在自含有10g/l葡萄糖，10g/l木糖和21g/l阿拉伯糖的培養(yǎng)基24小時的發(fā)酵后產(chǎn)生至少約15g/l乙醇的乙醇產(chǎn)率。
22.前述權(quán)利要求之任一項的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞還包含一種或更多編碼纖維素酶的異源多核苷酸。
23.權(quán)利要求22的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中一種或更多纖維素酶選自:內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶。
24.權(quán)利要求23的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞包含: (a)編碼內(nèi)切葡聚糖酶的第I異源多核苷酸； (b)編碼β-葡萄糖苷酶的第2異源多核苷酸； (c)編碼第I纖維二糖水解酶的第3異源多核苷酸'及 (d)編碼第2纖維二糖水解酶的第4異源多核苷酸。
25.權(quán)利要求24的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中 (a)編碼內(nèi)切葡聚糖酶的第I異源多核苷酸源于煙曲霉(A.fumigatus)； (b)編碼β-葡萄糖苷酶的第2異源多核苷酸源于肋狀復(fù)膜孢糖酵母(S.fibuliger)； (c)編碼第I纖維二糖水解酶的第3異源多核苷酸源于愛默生踝節(jié)菌(T.emersonii)；及 (d)編碼第2纖維二糖水解酶的第4異源多核苷酸源于Lucknowense金孢子菌(C.1ucknowense)。
26.重組酵母細(xì)胞，其包含編碼阿拉伯糖轉(zhuǎn)運子(AraT)的異源多核苷酸，其中酵母細(xì)胞能在24小時內(nèi)攝取至少約5g/l的阿拉伯糖。
27.權(quán)利要求26的重組酵母細(xì)胞，其中AraT源于選自下列的生物的AraT:乳克魯維酵母(Kluveromyces lactis)、耐熱克魯維酵母(Kluveromyces thermotolerans)及黑曲霉(Aspergillus niger)。
28.權(quán)利要求26或27的重組酵母細(xì)胞，其中AraT包含與SEQID NO:9~22的氨基酸序列之任一個具有至少80%同一性的氨基酸序列。
29.前述權(quán)利要求之任一項的重組宿主細(xì)胞，其中異源多核苷酸中的至少一種整合到宿主細(xì)胞的基因組。
30.產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括: (a)使權(quán)利要求1~29之任一項的重組真核生物宿主細(xì)胞與底物組合； (b)使宿主細(xì)胞發(fā)酵該底物；及， (c)回收一種或更多發(fā)酵產(chǎn)物， 其中底物是纖維素底物和發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率依靠宿主細(xì)胞發(fā)酵阿拉伯糖的能力增加。
31.組合物，其包含碳源和權(quán)利要求1~29之任一項的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中碳源是含有至少約I%阿拉伯糖的纖維素底物。
32.培養(yǎng)基上清液，其通過使權(quán)利要求1~29之任一項的重組真核生物宿主細(xì)胞與包含含有至少約1%阿拉伯糖的碳源的培養(yǎng)基溫育來產(chǎn)生。
33.組合物，其包含至少第I和第2權(quán)利要求1~29之任一項的重組真核生物宿主細(xì)胞，其中第I和第2重組真核生物宿主細(xì)胞遺傳上不同。
【文檔編號】C12N1/00GK104039806SQ201280062514
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月10日
【發(fā)明者】D·A·阿基羅斯, N·卡亞薩, T·F·巴雷特, A·K·瓦內(nèi)爾 申請人:馬斯科馬公司