專利名稱：一種生產(chǎn)腺苷蛋氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腺苷蛋氨酸的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
腺苷蛋氨酸(SAM)是存在于人體所有組織和體液中的一種生理活性分子。SAM主 要用于治療肝硬化前和肝硬化所致肝內(nèi)膽汁郁積，妊娠期肝內(nèi)膽汁郁積，在抗炎止痛、抗精 神抑郁、去屑、止癢、減皺、抗衰老等方面也有重要應(yīng)用。腺苷蛋氨酸在常溫條件下的吸濕 性和不穩(wěn)定性以及生產(chǎn)工藝的復(fù)雜性嚴(yán)重限制了腺苷蛋氨酸在醫(yī)療保健領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。 因此，歐美科技界在腺苷蛋氨酸的穩(wěn)定成鹽和生產(chǎn)工藝方面申報(bào)了多項(xiàng)專利。藥物原料市
場上具有代表性的一些專利有如美國專利6635615， 5102791、4028183、4369177、4764603等。 SAM的全國年需求量至少在10噸以上，全球的需求每年為50噸。SAM在我國還沒 有實(shí)現(xiàn)國產(chǎn)化，全部依賴進(jìn)口。 SAM主要生產(chǎn)廠商集中在德國和意大利，藥用原料每千克約 8000元人民幣。國內(nèi)已有開發(fā)研究工作，因發(fā)酵法的表達(dá)水平低，酶促轉(zhuǎn)化法的酶和ATP的 成本很高，所以原料生產(chǎn)至今未能大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化，主要由雅培公司進(jìn)口中國。
目前腺苷蛋氨酸工業(yè)化生產(chǎn)工藝主要有酵母發(fā)酵法(胞內(nèi)表達(dá)法)和酶促轉(zhuǎn)化法 (胞外酶促法)兩種，這兩種方法都存在著不同的技術(shù)難點(diǎn) 酵母發(fā)酵法(胞內(nèi)表達(dá)法)國外多采用特殊培育的表達(dá)SAM的釀酒酵母菌株通 過胞內(nèi)表達(dá)制備SAM。國內(nèi)有人研究出基因工程改構(gòu)的釀酒酵母，發(fā)酵表達(dá)SAM，但目前表 達(dá)最高的也只達(dá)到8g/L發(fā)酵液，而且大多只完成發(fā)酵工藝的探索，用此法生產(chǎn)是在胞內(nèi)表 達(dá)，由于SAM的前體L 一蛋氨酸需透過胞壁，且受胞內(nèi)空間的限制所以表達(dá)產(chǎn)量很難提高， 收率低，成本高，不適合大規(guī)模制備。 酶促法(胞外酶促法)酶促法多以從啤酒酵母或其他工程菌中提取純化腺苷蛋 氨酸合成酶，然后通過優(yōu)化酶促反應(yīng)條件來轉(zhuǎn)化制備SAM，該法原料轉(zhuǎn)化率高，SAM易于提 取純化，但是該法中酶的提取純化工序復(fù)雜在酵母菌的破碎、離心、過濾、濃縮上清液及上 清液上柱純化中會(huì)有酶的損失，同時(shí)影響酶活性的不確定因素較多，純化酶的周期較長，致 使酶的活性受到了影響，同時(shí)該法獲得的純化酶量較少，導(dǎo)致酶的成本很高，也不適合大規(guī) 模制備SAM。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種胞內(nèi)表達(dá)加胞外酶促合成生產(chǎn)腺苷蛋氨酸的方法。以解決酵母發(fā) 酵法(胞內(nèi)表達(dá)法)表達(dá)產(chǎn)量低，收率低，成本高，和胞外酶促法酶的成本高，不適合大規(guī)模 制備SAM的問題。本發(fā)明集中了發(fā)酵法(胞內(nèi)表達(dá)法)和胞外酶促法的優(yōu)點(diǎn)，利用一次發(fā) 酵可同時(shí)獲得胞內(nèi)表達(dá)和胞外酶促兩部分SAM產(chǎn)物，大大提高了單位發(fā)酵液SAM的產(chǎn)量，低 了生產(chǎn)成本，使SAM實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)制備。
本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
3
首先利用基因工程技術(shù)獲得表達(dá)SAM的高效基因工程菌 SAM合成酶基因SAM2的核苷酸編碼序列長1152bp，編碼含384氨基酸殘基的亞 基，分子量為42300。 SAM1和SAM2編碼序列的同源性為83% ，所編碼的多肽氨基酸序列的 同源性高達(dá)92%，說明SAM1和SAM2為復(fù)制基因。將SAM2基因整合至基因工程菌株中。將 帶有強(qiáng)啟動(dòng)子、SAM2基因和終止子序列的基因片段依靠SAM2兩端的同源序列臂整合在原 基因組SAM2位點(diǎn)處，依靠強(qiáng)啟動(dòng)子作用實(shí)現(xiàn)SAM2的高表達(dá)。 接著利用發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵，在工程菌中表達(dá)SAM，通過破胞提取胞內(nèi)的SAM合成酶和 SAM。 然后利用胞內(nèi)提取的SAM合成酶再在胞外進(jìn)行胞外酶促合成反應(yīng)生產(chǎn)SAM，這樣 利用一次發(fā)酵可同時(shí)獲得胞內(nèi)的表達(dá)SAM和SAM合成酶，SAM合成酶再在胞外進(jìn)行胞外酶 促合成反應(yīng)，又生產(chǎn)一部分SAM。即一次發(fā)酵可同時(shí)獲得胞內(nèi)胞外兩部分SAM產(chǎn)物，大大提 高了單位發(fā)酵液的產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本，使SAM實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)制備。
其中獲得的胞內(nèi)表達(dá)部分達(dá)到每升發(fā)酵液中為20.6g，生物量110g/L。胞外酶促 生產(chǎn)部分達(dá)到重組腺苷蛋氨酸合成酶純酶比活性高達(dá)10-501U/毫克。酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá) 95%以上。每升酶促反應(yīng)液中SAM濃度達(dá)為12.8g。 本發(fā)明中的啤酒酵母基因重組工程菌，該菌種由我公司通過基因重組工程技術(shù)構(gòu) 建選育，由我公司技術(shù)中心保藏，保藏日期2008年3月18日，本基因重組啤酒酵母菌攜帶 化學(xué)合成腺苷蛋氨酸合成酶基因。合成酶的表達(dá)受啟動(dòng)子TAC調(diào)控。 本發(fā)明中的工程菌破碎工藝是采用物理方法破碎的細(xì)胞破碎儀、高效勻質(zhì)機(jī)等。
本發(fā)明中的腺苷蛋氨酸合成酶是通過截留分子量為3000的中空纖維超濾柱超濾 濃縮提取的，收率達(dá)到90 %以上。腺苷蛋氨酸合成酶是可以回收多次重復(fù)利用的。
本發(fā)明中的腺苷蛋氨酸合成條件是磷酸二氫鉀、氯化鎂、葡萄糖、ATP、無機(jī)焦 磷酸酶使終濃度為K+濃度100-30mmol/L， Mg2+濃度5-30mmol/L，蛋氨酸為5mmol/L——
65mmol/L， ATP為5mmol/L-80mmol/L，無機(jī)焦磷酸酶0. 02mg/L， pH值為6. 0-7. 5，將
反應(yīng)缸升溫至20°C——39。C，攪拌下酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)，10小時(shí)左右。 本發(fā)明中的腺苷蛋氨酸的提取純化是利用弱酸性大孔丙烯酸陽離子交換樹脂
(D113)離子交換完成的。 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果 本發(fā)明首先利用基因工程技術(shù)獲得表達(dá)SAM的高效基因工程菌，利用發(fā)酵技術(shù)發(fā) 酵，在工程菌中表達(dá)SAM和SAM合成酶，通過破胞提取胞內(nèi)的SAM和SAM合成酶，然后利用胞 內(nèi)提取的SAM合成酶再在胞外進(jìn)行胞外酶促合成反應(yīng)生產(chǎn)SAM。即一次發(fā)酵可同時(shí)獲得胞 內(nèi)胞外兩部分SAM產(chǎn)物，大大提高了單位發(fā)酵液的產(chǎn)量，工藝簡單，降低了生產(chǎn)成本，使SAM 實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)制備，使SAM能得到普遍實(shí)際應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)驗(yàn)材料和方法 1、工程菌和試劑 啤酒酵母基因重組工程菌，該菌種由我公司通過基因重組工程技術(shù)構(gòu)建選育，由 我公司技術(shù)中心保藏，保藏日期2008年3月18日，本基因重組啤酒酵母菌攜帶化學(xué)合成腺
4苷蛋氨酸合成酶基因。 試劑主要有三磷酸腺苷ATP AR ;L_蛋氨酸；99% p-巰基乙醇；1，4_ 丁烷二磺酸 鈉；四乙二胺四乙酸EDTA ;無機(jī)焦磷酸酶，弱酸性大孔丙烯酸陽離子交換樹脂(D113)。除去 離子水和對l，4-丁烷二磺酸鈉(含量95%以上)為本公司自制外，其他全部為國產(chǎn)分析純 級。 2、發(fā)酵培養(yǎng)基 發(fā)酵基石出鹽培養(yǎng)基(Fermentation Basal Salts Medium, BSM): 85%磷酸200. 25mL， CaS04 2H20 6. 975g， K2S04136. 5g， MgS04 7H20 111. 75g， KOH 30. 9g， 甘油300g， 補(bǔ)料培養(yǎng)基 補(bǔ)料1 :25 % -28 %氨水，發(fā)酵罐自動(dòng)控制其補(bǔ)加速度，使pH值控制在一定數(shù)值。
補(bǔ)料2 :L-Met 75g，蒸餾水定容至1.25L，115。C滅菌30min。再加入PTM115mL。
補(bǔ)料3 :PTM148mL補(bǔ)料4 :不含甘油的BSM培養(yǎng)基1. 25L，加入300g L-Met， 115。C滅菌30min。
3發(fā)酵工藝 3. 1發(fā)酵第一階段——適應(yīng)生長階段 3、加入發(fā)酵培養(yǎng)基后，加水至75L，發(fā)酵罐中12rC滅菌30min。降溫至37。C接種， 攪拌3h，轉(zhuǎn)速500rpm，8h后600rpm，15h后650rpm，通氣逐漸加大至1 : 1。此階段DO和 pH持續(xù)下降，發(fā)酵罐自動(dòng)補(bǔ)加氨水控制pH5. 0 ;通過提高轉(zhuǎn)速和通氣量來提高DO，使其不低 于20%。 此階段維持18-25h，時(shí)間長短根據(jù)接種量不同而有所區(qū)別。此階段生物量達(dá)
100g/L左右，HPLC檢測SAM 0. 7g/L。 3. 2發(fā)酵第二階段——急劇生長階段 當(dāng)DO突然急劇上升，由20%上升至70% _90 %時(shí)，進(jìn)入第二階段，開始補(bǔ)加補(bǔ)料
2。 補(bǔ)料速度126mL/h。轉(zhuǎn)速提高到700rpm。補(bǔ)料2加入DO即會(huì)迅速下降。該階段補(bǔ)加氨 水控制pH5. 0。 此階段菌體急劇生長，此階段時(shí)長10h，此時(shí)生物量達(dá)210-240g/L， HPLC檢測SAM
3. 22g/L。 3. 3發(fā)酵第三階段——碳源饑餓階段 當(dāng)補(bǔ)料2補(bǔ)完后，DO又會(huì)急劇上升，此時(shí)進(jìn)入第3階段。碳源饑餓1. 5h，因?yàn)楹竺?要改變碳源，為了讓菌體更好的適應(yīng)新的碳源。在此階段，D0維持在70X以上的高水平，pH
會(huì)有一定的上升。 3. 4發(fā)酵第四階段——誘導(dǎo)表達(dá)階段 碳源饑餓l. 5h后，進(jìn)入第四階段，同時(shí)補(bǔ)加補(bǔ)料3和補(bǔ)料4。補(bǔ)料3流速從10. 5mL/ h開始，每15min增加2. lmL/h，直至25. 2mL/h， D0下降到20以下。后面根據(jù)DO值，調(diào)整
5補(bǔ)料3的速度， 一般為25. 2mL/h-40mL/h，使DO在20-30之間至發(fā)酵結(jié)束。補(bǔ)料4流速為 12.65mL/h，恒速補(bǔ)加。甲醇的濃度太高了細(xì)胞會(huì)中毒。pH提升至6.0。 DO不低于15X，當(dāng) DO太低時(shí)，降低補(bǔ)料3的速度，提高溶氧。 誘導(dǎo)表達(dá)階段持續(xù)100h左右表達(dá)量達(dá)到最高，發(fā)酵結(jié)束，下罐。此階段結(jié)束時(shí)，生
物量達(dá)290-340g/L， SAM產(chǎn)量21. 11g/L左右。整個(gè)發(fā)酵過程130h左右。 將發(fā)酵后收集的菌液進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為4000Pm，離心10分鐘，棄去上清液，收集沉
淀的菌體，-4(TC凍存。 4、腺苷蛋氨酸合成酶的提取制備 將凍存十天以上的菌體，用20mmol/L磷酸緩沖液進(jìn)行懸浮，每克細(xì)胞泥用2毫升 緩沖液，懸浮后的菌液利用均質(zhì)機(jī)進(jìn)行破碎，操做的壓力為60MPa，溫度控制在15t:以下， 循環(huán)兩次。收集懸浮液進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為15000rpm，離心后收集含有SAM合成酶和SAM的上 清液。然后用截留分子量為3000的中空纖維超濾柱超濾濃縮，腺苷蛋氨酸合成酶被截留超 濾濃縮液中，腺苷蛋氨酸(SAM)則在濾過液中。濃縮液作為下一步酶促反應(yīng)的酶液，濾過液 移交純化工序提取純化其中的SAM。
5、酶促合成 取上步濃縮液即粗酶液，加入反應(yīng)缸，加入適量純化水，依次加入磷酸二氫鉀、氯 化鎂、葡萄糖、ATP無機(jī)焦磷酸酶使終濃度為K+濃度250mmol/L， Mg2+濃度30mmol/L，蛋氨 酸為5mmol/L 65mmol/L， ATP無機(jī)焦磷酸酶0. 02mg/L為5mmol/L 80mmol/L， pH值為 6. 0 7. 5，將反應(yīng)缸升溫至24°C 31°C ，攪拌下酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)，10小時(shí)左右，在反應(yīng)過程中 根據(jù)反應(yīng)的進(jìn)程相應(yīng)地補(bǔ)加蛋氨酸與ATP，以維持最大的酶促反應(yīng)速度。隨時(shí)做液相檢測， 直至蛋氨酸大部分轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)化率90%以上)，轉(zhuǎn)化液中SAM含量達(dá)到15g/L轉(zhuǎn)化液時(shí)，即可 加硫酸調(diào)pH3. 0終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。 轉(zhuǎn)化終止后，用反應(yīng)體積與硅藻土的比為1 : 0.005的量，加入硅藻土入反應(yīng)缸， 攪拌20分鐘，板框過濾，以去掉蛋白質(zhì)。過濾得濾液，濾液再加入強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子交 換樹脂(201x7)攪拌吸附15分鐘，使pH為4. 5，靜置20-30分鐘，真空抽濾，過濾。
6 、腺苷蛋氨酸合成酶的回收 濾液用截留分子量為3000的中空纖維超濾柱，超濾濃縮回收腺苷蛋氨酸合成酶。 腺苷蛋氨酸合成酶可重復(fù)利用。
7、纟屯4t 取破菌后的濾過液和酶促后的濾過液上弱酸性大孔丙烯酸陽離子交換樹脂 (D113)分離柱離子交換柱進(jìn)行層析提取。 將上工序?yàn)V液加水溶解成稀釋成電導(dǎo)小于5，調(diào)pH為5. 0-5. 5后緩慢地加入經(jīng)酸 堿處理后處理好的弱酸性大孔丙烯酸陽離子交換樹脂(D113)分離柱。每30分鐘檢測洗脫 液，測定其0D值，在波長254nm處溶液吸收大于0. 4時(shí)改用pH2. 0的硫酸水溶液洗滌4小 時(shí)，同時(shí)每30分鐘水洗液做液相檢測。當(dāng)流出液中只含腺苷蛋氨酸時(shí)，即可停止水洗。接著 用注射用水配制0. 3M 1 ，4- 丁二磺酸溶液，將分離柱內(nèi)的腺苷蛋氨酸洗脫下來，在洗脫的 過程中，H+置換SAM+，置換下來的SAM+與1 ， 4- 丁二磺酸根結(jié)合，生成1 ， 4- 丁二磺酸腺苷蛋 氨酸成品，洗脫液用弱堿性大孔丙烯酸陰離子交換樹脂脫除多余的1，4-丁二磺酸根使5八1+ 與1，4-丁二磺酸根的比例符合要求。洗脫液移交下一步精制工序。
8、精制 在洗脫液中，加入lg/L藥用活性炭，攪拌40分鐘脫色，過濾，收集濾液放在塑料桶 內(nèi)，按l : 6比例加入藥用酒精，放置48小時(shí)后，將藥用酒精倒出，加入用注射用水溶解沉 淀，用微孔濾膜過濾，即得腺苷蛋氨酸純品溶液。 把純品溶液冷凍干燥。即得白色粉狀的腺苷蛋氨酸(SAM)干粉成品。
實(shí)施例一
1、發(fā)酵工藝 利用100升發(fā)酵罐發(fā)酵，BSM培養(yǎng)基加發(fā)酵基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基 85%磷酸200. 25mL， CaS04 2H20 6. 975g， K2S04136. 5g， MgS04 7H20 111. 75g， K0H 30. 9g， 甘油300g， 加入發(fā)酵培養(yǎng)基后，加水至75L，發(fā)酵罐中12rC滅菌30min。降溫至37。C接種，攪 拌3h，轉(zhuǎn)速500rpm， 8h后600rpm， 15h后650rpm，通氣逐漸加大至1:1。此階段DO和pH 持續(xù)下降，發(fā)酵罐自動(dòng)補(bǔ)加氨水控制PH5. 0 ;通過提高轉(zhuǎn)速和通氣量來提高DO，使其不低于 20%。 當(dāng)DO突然急劇上升，由20%上升至70% _90 %時(shí)，進(jìn)入第二階段，開始補(bǔ)加補(bǔ)料 2。補(bǔ)料速度126mL/h。轉(zhuǎn)速提高到700rpm。補(bǔ)料2加入DO即會(huì)迅速下降。該階段補(bǔ)加氨 水控制pH5. 0。 當(dāng)補(bǔ)料2補(bǔ)完后，DO又會(huì)急劇上升，此時(shí)進(jìn)入第3階段。碳源饑餓1. 5h，同時(shí)補(bǔ)加 補(bǔ)料3和補(bǔ)料4。補(bǔ)料3流速從10. 5mL/h開始，每15min增加2. lmL/h，直至25. 2mL/h，D0 下降到20以下。 誘導(dǎo)表達(dá)階段持續(xù)100h左右表達(dá)量達(dá)到最高，發(fā)酵結(jié)束，下罐。此階段結(jié)束時(shí)，生 物量達(dá)290-340g/L， SAM產(chǎn)量21. 11g/L左右。 將發(fā)酵后收集的菌液進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為4000Pm，離心10分鐘，棄去上清液，收集沉
淀的菌體，-4(TC凍存。 2、腺苷蛋氨酸合成酶的提取制備 將凍存十天以上的菌體，用20mmol/L磷酸緩沖液進(jìn)行懸浮，每克細(xì)胞泥用2毫升 緩沖液，懸浮后的菌液利用均質(zhì)機(jī)進(jìn)行破碎，操做的壓力為60MPa，溫度控制在15t:以下， 循環(huán)兩次。收集懸浮液進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為15000rpm，離心后收集含有SAM合成酶和SAM的上 清液。然后用截留分子量為3000的中空纖維超濾柱超濾濃縮，腺苷蛋氨酸合成酶被截留超 濾濃縮液中，腺苷蛋氨酸(SAM)則在濾過液中。濃縮液作為下一步酶促反應(yīng)的酶液，濾過液 移交純化工序提取純化其中的SAM。
3、酶促合成 取上步濃縮液即粗酶液，加入反應(yīng)缸，加入適量純化水，依次加入磷酸二氫鉀、氯 化鎂、葡萄糖、ATP無機(jī)焦磷酸酶使終濃度為K+濃度250mmol/L， Mg2+濃度30mmol/L，蛋氨 酸為5mmol/L 65mmol/L， ATP無機(jī)焦磷酸酶0. 02mg/L為5mmol/L 80mmol/L， pH值為
76. 0 7. 5，將反應(yīng)缸升溫至24°C 31°C ，攪拌下酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)，10小時(shí)左右，在反應(yīng)過程中 根據(jù)反應(yīng)的進(jìn)程相應(yīng)地補(bǔ)加蛋氨酸與ATP，以維持最大的酶促反應(yīng)速度。隨時(shí)做液相檢測， 直至蛋氨酸大部分轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)化率90%以上)，轉(zhuǎn)化液中SAM含量達(dá)到15g/L轉(zhuǎn)化液時(shí)，即可 加硫酸調(diào)pH3. 0終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。 轉(zhuǎn)化終止后，用反應(yīng)體積與硅藻土的比為1 : 0.005的量，加入硅藻土入反應(yīng)缸， 攪拌20分鐘，板框過濾，以去掉蛋白質(zhì)。過濾得濾液，濾液再加入強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子交 換樹脂(201x7)攪拌吸附15分鐘，使pH為4. 5，靜置20-30分鐘，真空抽濾，過濾。
4、純化 取破菌后的濾過液和酶促后的濾過液上弱酸性大孔丙烯酸陽離子交換樹脂 (D113)分離柱離子交換柱進(jìn)行層析提取。 將上工序?yàn)V液加水溶解成稀釋成電導(dǎo)小于5，調(diào)pH為5. 0-5. 5后緩慢地加入經(jīng)酸 堿處理后處理好的弱酸性大孔丙烯酸陽離子交換樹脂(D113)分離柱內(nèi)進(jìn)行吸附。每30分 鐘檢測洗脫液，測定其OD值，在波長254nm處溶液吸收大于0. 4時(shí)改用pH2. 0的硫酸水溶液 洗滌4小時(shí)，當(dāng)流出液中只含SAM時(shí)，即可停止水洗。然后用注射用水配制0. 3M 1，4- 丁 二磺酸溶液，將分離柱內(nèi)的腺苷蛋氨酸洗脫下來，在洗脫的過程中，^置換SAM+，置換下來 的SAM+與1，4- 丁二磺酸根結(jié)合，生成1，4- 丁二磺酸腺苷蛋氨酸成品，洗脫液用弱堿性大 孔丙烯酸陰離子交換樹脂脫除多余的1，4- 丁二磺酸根使SAM+與1，4- 丁二磺酸根的比例 符合要求，用潔凈的塑料桶盛裝洗脫液移交下一步精制工序。
5、精制 在洗脫液中，加入lg/L藥用活性炭，攪拌40分鐘脫色，過濾，收集濾液放在塑料桶 內(nèi)，按l : 6比例加入藥用酒精，放置48小時(shí)后，將藥用酒精倒出，加入用注射用水溶解沉 淀，用微孔濾膜過濾，即得腺苷蛋氨酸純品溶液。 把腺苷蛋氨酸純品溶液進(jìn)行冷凍干燥。即得白色粉狀的腺苷蛋氨酸成品。
實(shí)施例二酶催化腺苷蛋氨酸合成反應(yīng)及純化精制。
以10升的反應(yīng)體系為例， 將凍存十天以上的菌體，用20mmol/L磷酸緩沖液進(jìn)行懸浮，每克細(xì)胞泥用2毫升 緩沖液，懸浮后的菌液利用均質(zhì)機(jī)進(jìn)行破碎，操做的壓力為60MPa，溫度控制在15t:以下， 循環(huán)兩次。收集懸浮液進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為15000rpm，離心后收集含有SAM合成酶和SAM的上 清液。然后用截留分子量為3000的中空纖維超濾柱超濾濃縮，腺苷蛋氨酸合成酶被截留超 濾濃縮液中，腺苷蛋氨酸(SAM)則在濾過液中。濃縮液作為下一步酶促反應(yīng)的酶液，濾過液 移交純化工序提取純化其中的SAM。 取含有SAM合成酶超濾濃縮液，加入反應(yīng)缸，加入適量純化水，依次加入磷酸二氫 鉀、氯化鎂、葡萄糖、ATP、無機(jī)焦磷酸酶使終濃度為K+濃度250mmol/L，Mg"濃度30mmol/L， 蛋氨酸為35mmol/L， ATP為60mmol/L，無機(jī)焦磷酸酶0. 02mg/L， pH值為6. 5，將反應(yīng)缸升溫 至3rC，攪拌下酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)，10小時(shí)左右，直至蛋氨酸大部分轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)化率90%以上)， 轉(zhuǎn)化液中SAM含量達(dá)到15g/L轉(zhuǎn)化液時(shí)，即可加硫酸調(diào)pH3. 0終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
轉(zhuǎn)化終止后，用反應(yīng)體積與硅藻土的比為1 : 0.005的量，加入硅藻土入反應(yīng)缸， 攪拌20分鐘，板框過濾，以去掉蛋白質(zhì)。過濾得濾液，濾液再加入強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子交 換樹脂(201x7)攪拌吸附15分鐘，使pH為4.5，靜置20-30分鐘，真空抽濾，過濾。濾液用截留分子量為3000的中空纖維超濾柱，超濾，得濾過液。 取破菌后的濾過液和酶促后的濾過液上弱酸性大孔丙烯酸陽離子交換樹脂 (D113)分離柱。每30分鐘檢測洗脫液，測定其0D值，在波長254nm處溶液吸收大于0.4時(shí) 改用pH2. 0的硫酸水溶液洗滌4小時(shí)，停止水洗。 水洗停止后，用注射用水配制0. 3M 1 ， 4- 丁二磺酸溶液，將分離柱內(nèi)的腺苷蛋氨 酸洗脫下來，即得1，4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸成品。在洗脫液中，加入lg/L藥用活性炭，攪 拌40分鐘脫色，過濾，收集濾液，按1 : 6比例加入藥用酒精，放置48小時(shí)后，將藥用酒精 倒出，加入用注射用水溶解沉淀，用微孔濾膜過濾，即得腺苷蛋氨酸純品溶液。
把腺苷蛋氨酸純品溶液放入冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。即得白色粉狀的腺苷蛋氨 酸(SAM)干粉成品。
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權(quán)利要求
一種生產(chǎn)腺苷蛋氨酸(SAM)的方法。其特征在于首先利用基因工程技術(shù)獲得表達(dá)SAM的高效基因工程菌，利用發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵，在工程菌中表達(dá)SAM和SAM合成酶，通過破胞提取胞內(nèi)的SAM和SAM合成酶，然后利用胞內(nèi)提取的SAM合成酶再在胞外進(jìn)行胞外酶促合成反應(yīng)生產(chǎn)SAM。即一次發(fā)酵可同時(shí)獲得胞內(nèi)胞外兩部分SAM產(chǎn)物，大大提高了單位發(fā)酵液的產(chǎn)量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)腺苷蛋氨酸(SAM)的方法，屬于腺苷蛋氨酸的生產(chǎn)方法。其特征在于首先利用基因工程技術(shù)獲得表達(dá)SAM的高效基因工程菌，利用發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵，在工程菌中表達(dá)SAM和SAM合成酶，通過破胞提取胞內(nèi)的SAM和SAM合成酶，然后利用胞內(nèi)提取的SAM合成酶再在胞外進(jìn)行胞外酶促合成反應(yīng)生產(chǎn)SAM。即一次發(fā)酵可同時(shí)獲得胞內(nèi)胞外兩部分SAM產(chǎn)物，大大提高了單位發(fā)酵液的產(chǎn)量。即本發(fā)明為低成本大規(guī)模生產(chǎn)藥用腺苷蛋氨酸提供一種新方法。
文檔編號C12P13/00GK101736048SQ20081022588
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月5日
發(fā)明者劉迎, 吳彥卓, 徐明波, 秦富景, 趙晶晶, 陳獻(xiàn)華 申請人:北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司