專利名稱：鑒定花椰菜抗黑腐病的特異引物i及鑒定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術中的鑒定花椰菜抗黑腐病的特異引物序列I及其利用該引物序列鑒 定花椰菜抗黑腐病的方法。
背景技術：
隨著人們生活水平的不斷提高和對自身健康的高度關注，花椰菜的營養(yǎng)價值和抗病的功 效逐漸被人們所認識。己經(jīng)成為人們喜食的保健蔬菜之一，全世界種植的范圍也在逐年增加。 花椰菜黑腐病由野油菜黃單胞菌(^w^ww0"aycfl附;7e的;spv. Ca附; ^^,Zcc)引起的，該病分 布很廣，尤其對甘藍類蔬菜(Sra^o/o/eracM)的生產(chǎn)是破壞性的，導致產(chǎn)量和品質大幅下 降，給蔬菜生產(chǎn)造成巨大損失?；ㄒ撕诟≈饕獮楹θ~片或花球。在高溫、高濕的環(huán)境條 件下，從植物葉緣的排水器中侵入，通過植物的維管束迅速感染，致使植物葉片產(chǎn)生萎蔫、 壞死、腐爛，出現(xiàn)典型的"V"字型黑斑，因此稱其為"黑腐病"，生產(chǎn)上對該病的控制很困難。 因此，植物本身所具有的抗性為控制十字花科的黑腐病提供了有效而廉價的手段。
在常規(guī)的抗病育種中需要對分離世代的大量植株進行抗病性鑒定。每一步的抗性檢出都 要經(jīng)歷接種和選育的過程，這種鑒定不僅費時曠日，且容易受環(huán)境影響。分子標記技術的應用， 顯示出獨特的優(yōu)越性，由于DNA分子標記不存在表達與否的問題，可以直接以DNA的形式 表現(xiàn)，在植物體的各個組織、各發(fā)育時期均可檢測到，不受取材部位、時間、發(fā)育時期和環(huán) 境的影響，信息量大，準確率高，為分子標記輔助育種和抗病育種在生產(chǎn)上的應用帶來前景。 根據(jù)抗病基因的已知序列設計特異性引物，通過PCR反應對抗病基因的有關區(qū)域進行特異性 擴增，可以對植株的基因型進行準確的和快速的選擇,成倍地提高抗病育種的效率，大大縮短 抗性優(yōu)良育種的選育的周期。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服常規(guī)的抗病育種中需要對分離世代的大量植株進行抗病性鑒定的繁
瑣過程。提供一對快速早期篩選花椰菜抗黑腐病的特異引物序列，及利用該序列通過分子生
物學手段在苗期快速對未知花椰菜品種或植株是否抗黑腐病進行篩査的方法。
本發(fā)明的技術方案概述如下
鑒定花椰菜抗黑腐病的特異引物序列對I，它是由引物序列
5， CTTTGAATCTTGTGGGCTATGC3'和5， TTTGCCTCCTTTAGGTTAGACT3 ，組成。
一種使用上述引物序列鑒定花椰菜抗黑腐病的方法，它包括如下步驟(l)提取花椰菜
基因組DNA; (2)基因組DNA的0.8。/。瓊脂糖凝膠電泳檢領ij; (3)特異引物PCR擴增，在PCR擴增專用的離心管中加入PCR緩沖溶液、dNTP 、引物序列對 5'CTTTGAATCTTGTGGGCTATGC3，和5TTTGCCTCCTTTAGGTTAGACT3'、花椰菜基因 組DNA、 Taq聚合酶、無菌水補至25微升，將裝有上述液體的PCR專用薄壁離心管放入 PCR擴增儀中，擴增條件為94'C變性180秒，后進行94"C變性30秒，55—48'C梯度退火 40秒(每循環(huán)降rC), 72匸延伸60秒的擴增循環(huán),循環(huán)數(shù)為7，隨后再進入94'C變性30秒， 5(TC退火40秒，72。C延伸60秒的擴增循環(huán)，循環(huán)數(shù)為28，最后在72。C延伸480秒，擴增 完成。(4) PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測配置1.2%的瓊脂糖凝膠，在凝膠中加入 溴化乙錠(0.5微克/毫升)；在5微升擴增產(chǎn)物及5微升標準陽性Marker中分別加入1微升 6x上樣緩沖液，混勻，用移液器將上述混合液分別加入浸沒0.5xTBE電泳緩沖液液的瓊脂 糖凝膠的點樣孔中，80V恒電壓，電泳1800秒后停止電泳。凝膠直接在紫外燈下(紫外波 長265nm)或在凝膠成像儀上進行觀察。(5)結果判讀依照標準陽性Marker帶在凝膠上 的遷移位置和PCR產(chǎn)物的遷移位置判斷花椰菜抗、感黑腐病情況。上述方法的鑒定結果與 田間的吻合率達95%。


圖1是特異引物序列對I鑒定花椰菜抗、感黑腐病的標準電泳圖 圖2是利用特異引物序列對I進行田間隨機檢測的電泳圖
具體實施例方式
下面結合實施例子和附圖對本發(fā)明做進一步的說明 實施例1
利用引物序列5'CTTTGAATCTTGTGGGCTATGC3，和5， TTTGCCTCCTTTAGGTTAGACT3，對已知
抗黑腐病和感黑腐病花椰菜植株進行檢測方法，包括以下步驟
(1)提取抗、感黑腐病花椰菜基因組DNA:采用CTAB方法提取基因組DNA，取幼嫩花 椰菜葉片200mg，在液氮里研成粉末，移入10ml離心管中，加入4mlCTAB裂解液，56。C保溫 30分鐘，加入等體積的酚、氯仿，充分混勻后，離心，取上清加入4ml氯仿、異戊醇，混勻 后離心，取上清加入等體積的異丙醇，-20。C靜置2小時后，10000g離心20分鐘，去上清， 沉淀用75%的乙醇漂洗后風干后，加入50微升無菌水溶解DNA沉淀，取5微升電泳檢測DNA 質量；(2) DNA濃度的測定利用自制的己知標準濃度的凝膠平板測量， 一般的濃度要求 在200ng以上/y L即可，或者采用紫外分光光度計測量其濃度；(3)進行PCR擴增在PCR 擴增專用的離心管中加入10XPCR緩沖溶液2.5uL、 1Ommol/L dNTP 0.5pL 、 1Onmol/L 引物各1 u L 、花椰菜基因組DNA 200ng、 Taq聚合酶2單位、無菌水補至25 " L，將裝有 上述液體的PCR專用離心管放入PCR擴增儀中，擴增條件為94t變性180秒，后進行94'C變性30秒，55—48。C梯度退火40秒(每循環(huán)降rC)， 72。C延伸60秒的擴增循環(huán)，循環(huán)數(shù) 為7，隨后再進入94'C變性30秒，5(TC退火40秒，72'C延伸60秒的擴增循環(huán)，循環(huán)數(shù)為 28，最后在72。C延伸480秒，擴增完成。(4) PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測配置1. 2% 的瓊脂糖凝膠，在凝膠中加入溴化乙錠(0. 5微克/毫升)；在5微升擴增產(chǎn)物及5微升標準 陽性Marker中分別加入l微升6X上樣緩沖液，混勻，用移液器將上述混合液分別加入浸沒 0. 5XTBE電泳液的瓊脂糖凝膠的點樣孔中，80V恒電壓，電泳1800秒后停止電泳。凝膠直 接在紫外燈下(紫外波長265nm)或在凝膠成像儀上進行觀察。(5)結果判讀依照標準陽 性Marker帶在凝膠上的遷移位置和PCR產(chǎn)物的遷移位置判斷花椰菜抗、感黑腐病情況。 如圖1所示泳道1為DNA標準的分子量箭頭示1500bp; 2-11為抗黑腐病植株的檢測，具 有1200bp條帶，12-21為不抗黑腐病植株的檢測，沒有1200bp條帶；泳道22為試劑盒提供 的標準陽性Marker分子量為1200bp，圖2是田間隨機取材檢測的結果，隨機取樣的單株隨 后進行大田抗黑腐病性狀觀察大田觀察結果證實，凡是具有1200bp條帶的表示為抗黑腐病 植株，沒有1200bp條帶的為不抗黑腐病植株。
權利要求
1. 鑒定花椰菜抗黑腐病的特異引物序列I，其特征在于它由引物序列5’ACCTAAAGGAGGCAAAGTCAAGC3’和5’AATGGCAAGGGTTCAAGGGTAGG3’組成。
2. —種使用權利要求1的鑒定花椰菜抗黑腐病的方法，它包括如下步驟(1)提取花椰菜基因組DNA; (2)基因組DNA的0.8e/。瓊脂糖凝膠電泳檢測；G)特異引物PCR擴增，在PCR擴增專用的離心管中加入 PCR緩沖溶液、dNTP 、特異引物序列5， ACCTAAAGGAGGCAAAGTCAAGC3'和5， AATGGCAAGGGTTCAAGGGTAGG3，、花椰菜基因組DNA、Taq聚合酶、無菌水補至25微升，將裝有上述液體的PCR專用薄壁離心管放入PCR擴增儀中，擴增條件為94'C變性180秒，后進行94'C變性30秒，55—48'C梯度退火40秒(每循環(huán)降rC)， 72'C延伸60秒的擴增循環(huán)，循環(huán)數(shù)為7，隨后再進入94'C變性30秒，5(TC退火40秒，72'C延伸60秒的擴增循環(huán)，循環(huán)環(huán)數(shù)為28，最后在72'C延伸480秒，擴增完成。(4) PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測配置1.2%的瓊脂糖凝膠，在凝膠中加入溴化乙錠(0.5微克/毫升)；在5微升擴增產(chǎn)物及5微升標準陽性Marker中分別加入1微升6x上樣緩沖液，混勻，用移液器將上述混合液分別加入浸沒TBE電泳液的瓊脂糖凝膠的點樣孔中，80V恒電壓，電泳1800秒后停止電泳。凝膠直接在紫外燈下(紫外波長265nm)或在凝膠成像儀上進行觀察。(5)結果判讀依照標準陽性Marker帶在凝膠上的遷移位置和PCR產(chǎn)物的遷移位置判斷花椰菜抗、感黑腐病情況。
全文摘要
本發(fā)明公開了一對用于花椰菜抗黑腐病鑒定的特異引物和鑒定方法，引物序列由5’ACCTAAAGGAGGCAAAGTCAAGC3’和5’AATGGCAAGGGTTCAAGGGTAGG3’組成。使用上述引物鑒定花椰菜抗黑腐病的方法包括4個步驟(1)花椰菜基因組DNA的提取及檢測；(2)特異引物對的PCR擴增；(3)PCR產(chǎn)物的凝膠電泳檢測；(4)結果判讀依據(jù)被檢測花椰菜基因組DNA的PCR擴增結果鑒定被檢花椰菜是否抗黑腐病。采用上述方法鑒定的結果與田間吻合率達95％以上。該方法在花椰菜抗黑腐病的篩選上具有重要的應用價值。
文檔編號C12Q1/68GK101475979SQ20081015401
公開日2009年7月8日 申請日期2008年12月12日 優(yōu)先權日2008年12月12日
發(fā)明者瑜 古, 孫德嶺, 宋文芹, 王春國, 擘 郝, 陳成彬 申請人:南開大學