專(zhuān)利名稱(chēng)：Z-l-丙氨酰-l-谷氨酰胺的酶合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶合成方法，屬于丙谷二肽合成技術(shù)。
背景技術(shù)：
谷氨酰胺(Gin)是一種條件必須氨基酸，也是人體血液循環(huán)中和機(jī)體內(nèi)游離氨基酸池中 含量最豐富的氨基酸，約占游離氨基酸總量的60%。谷氨酰胺因分子中含氮豐富，可為體內(nèi) 氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸的合成提供氮源，在機(jī)體蛋白代謝和氮的轉(zhuǎn)運(yùn)中占有十分重要的地位。 同時(shí)谷氨酰胺又是目前公認(rèn)的具有特殊功能的免疫營(yíng)養(yǎng)素之一，有減輕患者腸道受損程度、 降低高分解代謝、促進(jìn)蛋白合成、提高免疫力、促進(jìn)創(chuàng)面愈合等功能，因而谷氨酰胺在營(yíng)養(yǎng) 支持中的作用受到人們普遍重視。
谷氨酰胺的諸多功能在腸外給養(yǎng)中受到很大限制，這是因?yàn)楣劝滨０吩谒腥芙舛鹊停?在水溶液中不穩(wěn)定，加熱滅菌時(shí)會(huì)生成有毒的焦谷氨酸和氨，所以商品復(fù)方氨基酸溶液中均 不含谷氨酰胺。目前臨床上多采用含谷氨酰胺的二肽來(lái)實(shí)現(xiàn)谷氨酰胺的腸道給養(yǎng)。含谷氨酰 胺的二肽有兩種， 一是丙氨酰-谷氨酰胺(Ala-Gln)，另一種是甘氨酰-谷氨酰胺(Gly-Gln)。 臨床證明，Ala-Gln在水中溶解度為游離谷氨酰胺的20倍，不同pH下加熱滅菌無(wú)有毒的焦 谷氨酸和氨生成。Ala-Gln進(jìn)入機(jī)體后被各器官組織中的二肽酶分解成丙氨酸和谷氨酰胺，半 衰期僅為3.8min，并且僅有1~2%攝入量的Ala-Gln從尿液中排出，說(shuō)明Ala-Gln被高效利用， 同時(shí)避免了二肽積累可能產(chǎn)生的損害，是一種安全有效的提供谷氨酰胺營(yíng)養(yǎng)素的腸外藥物。
目前丙氨酰-谷氨酰胺(簡(jiǎn)稱(chēng)丙谷二肽，Ala-Gln)主要采用化學(xué)方法合成制備，如
1. 專(zhuān)利"丙-谷二肽合成方法"(CN1164611C): N端保護(hù)的氨基酸與三苯基磷、六氯乙 垸在有機(jī)溶劑中反應(yīng)生成活潑酯；活潑酯與谷氨酰胺在有機(jī)溶劑和無(wú)機(jī)堿水溶液的混合液中 進(jìn)行反應(yīng)，用無(wú)機(jī)酸酸化，然后脫去N端保護(hù)的混合基團(tuán)。
2. 專(zhuān)利"N (2) -L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法"(CN1302008C): N端保護(hù)的氨基 酸10mmo1，與三苯基氧磷、三光氣在有機(jī)溶劑中反應(yīng)形成活潑酯；活潑酯與谷氨酰胺在無(wú)機(jī) 堿水溶液中進(jìn)行反應(yīng)；用無(wú)機(jī)酸酸化，脫去N端保護(hù)基團(tuán)。
3. 專(zhuān)利"一種丙氨酰谷氨酰胺二肽化合物的制備方法"(CN1680428A):將L-谷氨酰胺 加入到甲苯與水的混合液中，待冷卻后，加氫氧化鈉，使L-谷氨酰胺溶解。滴加由a-鹵丙酰 鹵、甲苯和氫氧化鈉組成的溶液，調(diào)pH值，經(jīng)反應(yīng)后分開(kāi)有機(jī)層。加氯化鈉到分開(kāi)有機(jī)層 后的溶液中，調(diào)pH值，再加濃鹽酸調(diào)pH值、放置。經(jīng)過(guò)濾析出晶體，晶體經(jīng)干燥后與氨水
3進(jìn)行反應(yīng)，并控制溫度與壓力，然后冷卻減壓濃縮加水，滴加甲醇、放置，經(jīng)過(guò)濾析出獲得 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺粗制品，再經(jīng)提純后得精制品。
4. 專(zhuān)利"一種L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制備方法"(CN1931873A):在縮合劑存在下，在 惰性溶劑中，將D-2-鹵代丙酸和谷氨酰胺進(jìn)行縮合反應(yīng)，酸化，得到D-2-鹵代丙酰谷氨酰胺； 將得到的D-2-鹵代丙酰谷氨酰胺用氨水氨解反應(yīng)得到L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
5. 專(zhuān)利"N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制備方法"(CN101062938):包括前體酸鉀制備、 混合酸酐制備、谷氨酰胺鈉鹽制備、N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制備和精制幾個(gè)步驟。
本發(fā)明提供一種酶法合成Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，較之上述方法的優(yōu)點(diǎn)在于反應(yīng) 過(guò)程環(huán)境友好、條件溫和，反應(yīng)物系簡(jiǎn)單、副反應(yīng)少，產(chǎn)物無(wú)消旋問(wèn)題、易分離，所用酶制 劑廉價(jià)易得、生產(chǎn)成本低廉，且制備流程簡(jiǎn)便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶合成方法，該方法具有合成條件溫 和、環(huán)境友好，副產(chǎn)物少、無(wú)消旋，過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的， 一種Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶合成方法，其 特征在于包括以下過(guò)程
1. 將谷氨酰胺(Gln)溶于質(zhì)量濃度為0.1mol/L的氯化鉀水溶液中，配制成濃度為 120 800mmol/L的谷氮酰胺溶液，按酶質(zhì)量與谷氨酰胺質(zhì)量比為1:10 1:20向該溶液中加入木 瓜蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、菠蘿蛋白酶或羧肽酶Y中的一種，再添加氫氧 化鈉顆粒調(diào)節(jié)溶液pH為7.0~10.0，于溫度35 60'C下電磁攪拌，并保溫5-10min，制得谷氨 酰胺與酶的混合液。
2. 將Z-丙氨酸甲酯(Z-Ala-OMe)、 Z-丙氨酸乙酯(Z-Ala-OEt)或Z-丙氨酸節(jié)酯 (Z-Ala-OBz)中的一種溶于無(wú)水乙醇中，配制成濃度為800~1200mmol/L的溶液。
3. 將步驟2制備的溶液，按Z-丙氨酸甲酯或Z-丙氨酸乙酯或Z-丙氨酸芐酯與谷氨酰胺 的摩爾比為1:2 1:20，逐滴加入步驟1制備的混合液中，在溫度30 60。C和系統(tǒng)pH值為 7.0 10.0下電磁攪拌，反應(yīng)3 8小時(shí)，得到含有Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的溶液。
4. 將步驟3中反應(yīng)后所得溶液在沸水浴中加熱5 8min,經(jīng)孔徑為0.45~0.8pm的濾膜或 中速定性濾紙過(guò)濾，除去沉淀物，濾液于溫度-50~ 4(TC下冷凍干燥或在加料流量 5 10mL'min—1，入口溫度160 180。C下噴霧干燥，得到Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺粉末。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
1.采用蛋白酶合成Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，酶來(lái)源廣泛，且對(duì)酶的純度要求不高，故 制備成本低廉；2. 反應(yīng)歷程與體系組成簡(jiǎn)單，僅有一種副產(chǎn)物生成(Z-Ala-OH)，且反應(yīng)條件溫和，最 佳pH及最佳溫度選擇范圍較廣，并始終在水溶液中進(jìn)行反應(yīng)，無(wú)有毒試劑參與；
3. 采用酶法合成的二肽不會(huì)發(fā)生再次水解，產(chǎn)物采用反向色譜分析，方法簡(jiǎn)便、快捷， 短時(shí)內(nèi)即可將體系中所有組分完全分離鑒定。


圖1為實(shí)施例1中用于制備Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的物系在反應(yīng)結(jié)束時(shí)的色譜圖。 圖2為圖1色譜圖中譜峰1對(duì)應(yīng)物質(zhì)的質(zhì)譜圖。 圖3為圖1色譜圖中譜峰2對(duì)應(yīng)物質(zhì)的質(zhì)譜圖。 圖4為圖1色譜圖中譜峰3對(duì)應(yīng)物質(zhì)的質(zhì)譜圖。 圖5為圖1色譜圖中譜峰4對(duì)應(yīng)物質(zhì)的質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:
谷氨酰胺(Gln)1.5mmol溶于3mL0.1mol/L的氯化鉀水溶液中，配制成濃度為500mmol/L 的谷氨酰胺溶液，加入0.015g木瓜蛋白酶(即酶與Gln的質(zhì)量比為1:15)，用氫氧化鈉調(diào)節(jié) pH=10.0，于35。C下電磁攪拌，保溫10min;將Z-丙氨酸甲酯(Z-Ala掘e) 0.15mmo1溶于 0.15mL無(wú)水乙醇，配制成濃度100Ommol/L的溶液；按體積比1:20 (即Z-Ala-OMe與Gln的 摩爾比為1:10)將Z-Ala-OMe的無(wú)水乙醇溶液0.15ml逐滴加入3mL的Gln與酶的混合液中， 體系溫度始終保持35'C，氫氧化鈉滴定使pH維持IO.O恒定，電磁攪拌反應(yīng)6h;隨后迅速置 于沸水浴中加熱5min，再經(jīng)孔徑為0.45pm的膜過(guò)濾，除去沉淀物，濾液于-50'C冷凍干燥， 得到Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺粉末；同時(shí)對(duì)濾液中各組分進(jìn)行HPLC-MS檢測(cè)鑒定，色譜條件 為C18色譜柱，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)2Hnm，流動(dòng)相為含0.1 %TFA的35%乙腈-水溶液，等度洗 脫，流速lmL/min;質(zhì)譜條件為電噴霧離子化，正離子檢測(cè)，鞘氣流速35arb，噴霧電壓 5kv，毛細(xì)管電壓2.1kv，毛細(xì)管溫度300'C，掃描范圍m/z 50 500。檢測(cè)結(jié)果如圖1所示； Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的產(chǎn)率為33.6%。 實(shí)施例2:
谷氨酰胺(Gln)16mmo1溶于20mL O.lmol/L的氯化鉀水溶液中，配制成濃度為80Ommol/L 的谷氨酰胺溶液，加入0.12g無(wú)花果蛋白酶(即酶與Gln的質(zhì)量比為1:20)，用氫氧化鈉調(diào)節(jié) pH=8.0，于60。C下電磁攪拌，保溫5min;將Z-丙氨酸乙酯(Z-Ala-OEt) 0.8mmo1溶于lmL 無(wú)水乙醇，配制成濃度800mmol/L的溶液；按體積比1:20 (即Z-Ala-OEt與Gln的摩爾比為 1:20)將Z-Ala-OEt的無(wú)水乙醇溶液lml逐滴加入20mL的Gln與酶的混合液中，體系溫度始 終保持60'C，氫氧化鈉滴定使pH維持8.0恒定，電磁攪拌反應(yīng)8h;隨后迅速置于沸水浴中
5加熱8min，再經(jīng)孔徑為0.8pm的膜過(guò)濾，除去沉淀物，濾液于-4(TC冷凍干燥得到Z-L-丙氨 酰-L-谷氨酰胺粉末；同時(shí)對(duì)濾液中各組分進(jìn)行HPLC-MS檢測(cè)鑒定，色譜條件為C18色譜 柱，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，流動(dòng)相為含O.l %TFA的35%乙腈-水溶液，等度洗脫，流速lmL/min; 質(zhì)譜條件為電噴霧離子化，正離子檢測(cè)，鞘氣流速35arb，噴霧電壓5kv，毛細(xì)管電壓2.1kv， 毛細(xì)管溫度30(TC，掃描范圍m/z50 500。 Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的產(chǎn)率為27.5% 。 實(shí)施例3
谷氨酰胺(Gln) 24mmo1溶于200mL O.lmol/L的氯化鉀水溶液中，配制成濃度為 120mmol/L的谷氨酰胺溶液，加入0.35g菠蘿蛋白酶(即酶與Gln的質(zhì)量比為1:10)，用氫氧 化鈉調(diào)節(jié)pf^7.0，于55"C下電磁攪拌，保溫10min;將Z-丙氨酸芐酯(Z-Ala-OBz) 12mmo1 溶于10mL無(wú)水乙醇，配制成濃度1200mmol/L的溶液；按體積比1:20 (即Z-Ala-OEt與Gln 的摩爾比為l:2)將Z-Ala-OBz的無(wú)水乙醇溶液10ml逐滴加入200mL的Gln與酶的混合液中， 體系溫度始終保持55'C，氫氧化鈉滴定使pH維持7.0恒定，電磁攪拌反應(yīng)3h;隨后迅速置 于沸水浴中加熱8min，再經(jīng)中速定性濾紙過(guò)濾，除去沉淀物，濾液在加料流量5ml/min"， 入口溫度180。C下噴霧干燥，得到Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺粉末；同時(shí)對(duì)濾液中各組分進(jìn)行 HPLC-MS檢測(cè)鑒定，色譜條件為C18色譜柱，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，流動(dòng)相為含0.1XTFA 的35%乙腈-水溶液，等度洗脫，流速lmL/min;質(zhì)譜條件為電噴霧離子化，正離子檢測(cè)， 鞘氣流速35arb，噴霧電壓5kv，毛細(xì)管電壓2.1kv，毛細(xì)管溫度30(TC，掃描范圍m/z 50 500。 Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的產(chǎn)率為23.3%。 實(shí)施例4
谷氨酰胺(Gln) 240mmo1溶于2000mL O.lmol/L的氯化鉀水溶液中，配制成濃度為 120mmol/L的谷氨酰胺溶液，加入2.923g木瓜凝乳蛋白酶(即酶與Gln的質(zhì)量比為1:12)， 用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH^7.5，于40'C下電磁攪拌，保溫8min;將Z-丙氨酸甲酯(Z-Ala-OMe) 120mmo1溶于100mL無(wú)水乙醇，配制成濃度1200mmol/L的溶液；按體積比1:20(即Z-Ala-OEt 與Gln的摩爾比為1:2)將Z-Ala-OMe的無(wú)水乙醇溶液100ml逐滴加入2000mL的Gln與酶 的混合液中，體系溫度始終保持4(TC，氫氧化鈉滴定使pH維持7.5恒定，電磁攪拌反應(yīng)7h; 隨后迅速置于沸水浴中加熱8min，再經(jīng)中速定性濾紙過(guò)濾，除去沉淀物，濾液在加料流量 10mL'min—1，入口溫度16(TC下噴霧干燥，得到Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺粉末；同時(shí)對(duì)濾液中 各組分進(jìn)行HPLC-MS檢測(cè)鑒定，色譜條件為C18色譜柱，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，流動(dòng)相 為含0.1XTFA的35X乙腈-水溶液，等度洗脫，流速lmL/min;質(zhì)譜條件為電噴霧離子化， 正離子檢測(cè)，鞘氣流速35arb，噴霧電壓5kv，毛細(xì)管電壓2.1kv，毛細(xì)管溫度30(TC，掃描范
圍m/z 50-500。 Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的產(chǎn)率為24.6% 。
權(quán)利要求
1. 一種Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶合成方法，其特征在于包括以下過(guò)程(1)將谷氨酰胺溶于質(zhì)量濃度為0.1mol/L的氯化鉀水溶液中，配制成濃度為120～800mmol/L的谷氨酰胺溶液，按酶質(zhì)量與谷氨酰胺質(zhì)量比為1∶10～1∶20向該溶液中加入木瓜蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、菠蘿蛋白酶或羧肽酶Y中的一種，再添加氫氧化鈉顆粒調(diào)節(jié)溶液pH為7.0～10.0，于溫度35～60℃下電磁攪拌，并保溫5～10min，制得谷氨酰胺與酶的混合液；(2)將Z-丙氨酸甲酯、Z-丙氨酸乙酯或Z-丙氨酸芐酯中的一種溶于無(wú)水乙醇中，配制成濃度為800～1200mmol/L的溶液；(3)將步驟(2)制備的溶液，按Z-丙氨酸甲酯或Z-丙氨酸乙酯或Z-丙氨酸芐酯與谷氨酰胺的摩爾比為1∶2～1∶20，逐滴加入步驟1制備的混合液中，在溫度30～60℃和系統(tǒng)pH值為7.0～10.0下電磁攪拌，反應(yīng)3～8小時(shí)，得到含有Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的溶液；(4)將步驟(3)中反應(yīng)后所得溶液在沸水浴中加熱5～8min，經(jīng)孔徑為0.45～0.8μm的濾膜或中速定性濾紙過(guò)濾，除去沉淀物，濾液于溫度-50～-40℃下冷凍干燥或在加料流量5～10mL·min-1，入口溫度160～180℃下噴霧干燥，得到Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的粉末。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶合成方法。該合成步驟包括分別配制一定濃度的谷氨酰胺的水溶液和Z-丙氨酸甲酯或Z-丙氨酸乙酯或Z-丙氨酸芐酯的乙醇溶液，將兩溶液混合，以木瓜蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、菠蘿蛋白酶或羧肽酶Y中的一種為催化劑，在酶的最適條件下，恒溫、恒pH反應(yīng)一定時(shí)間，所得溶液沸水浴滅酶，過(guò)濾除去沉淀物，濾液經(jīng)干燥后得到Z-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺粉末。本發(fā)明提供的酶合成方法具有反應(yīng)過(guò)程環(huán)境友好、條件溫和，反應(yīng)物系簡(jiǎn)單、副反應(yīng)少，產(chǎn)物無(wú)消旋問(wèn)題、易分離，所用酶制劑廉價(jià)易得、生產(chǎn)成本低廉，且制備流程簡(jiǎn)便等諸多優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12P21/02GK101423857SQ200810153908
公開(kāi)日2009年5月6日 申請(qǐng)日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者何志敏, 王夢(mèng)凡, 蘇榮欣, 崴 齊 申請(qǐng)人:天津大學(xué)