專利名稱：微生物制備木糖醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種微生物制備木糖醇(xylite)的方法。
背景技術(shù)：
木糖醇是五碳多元醇，是天然存在的糖醇。由于它的甜度高且其代謝不依賴胰島素、抗齲齒等特性，是糖尿病、牙病患者理想的蔗糖代用品。木糖醇的制備可以有三條途徑(1)直接從植物中提取；(2)化學(xué)法或生物法用木糖催化加氫；(3)利用微生物的方法。由于木糖醇在植物中天然存在的含量太低，直接提取很不經(jīng)濟(jì)?，F(xiàn)有技術(shù)中木糖醇經(jīng)化學(xué)路線合成，高壓高溫下在鎳催化劑上還原木糖，平均生產(chǎn)率為所用木糖的50至60 % ，這種方法工藝復(fù)雜，成本很高，尤其是鎳催化劑的使用會導(dǎo)致環(huán)境保護(hù)方面的問題。
生物技術(shù)方法在現(xiàn)有技術(shù)中己有描述，其在將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇的過程中提供了非常高的生產(chǎn)率。但缺點是在強(qiáng)烈地表達(dá)過木糖還原酶并且同時消除了參與木糖醇天然代謝的酶的情況下，無法足夠有效地提高木糖醇的生產(chǎn)率，以便成本有效地通過生物技術(shù)的方法路線制備木糖醇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種生產(chǎn)率較高的微生物制備木糖醇的方法。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案，本發(fā)明包括如下工序 1)修飾微生物從而減少或消除除木糖還原酶以外的酶對NADH的氧化； 2)在含有木糖和5 50g/L亞硫酸鹽(例如亞硫酸氫鈣，亞硫酸鈉，亞硫酸鉀)的
底物中培養(yǎng)微生物； 3)在需氧生長期和限氧木糖醇生成期培養(yǎng)微生物；
4)自底物中富集和提取木糖醇。
本發(fā)明的有益效果 本發(fā)明使用可再生的原料并且與常規(guī)的化學(xué)方法相比，不存在因使用鎳催化劑而引起的環(huán)境損害。此外，生物技術(shù)方法自身固有反應(yīng)條件相對溫和的特點，因此通常較化學(xué)方法更易于與環(huán)境相容。 本發(fā)明與其他生物技術(shù)相比，關(guān)鍵在于還原酶可以循環(huán)使用，而不用加過量還原酶，因而木糖醇的轉(zhuǎn)化率更高。
具體實施方式
實施例1 描述表達(dá)異種木糖還原酶的制備酵母株 酵母中異種木糖還原酶的表達(dá)是現(xiàn)有技術(shù)的一部分，描述于例如W091/15588中。Pichia stipitis在100ml YPD (11培養(yǎng)基中包含10g酵母提取物，20g蛋白胨和20g葡萄
3糖，pH二6.5)中于3(TC培養(yǎng)過夜。10ml培養(yǎng)基中的細(xì)胞經(jīng)離心成團(tuán)并分離染色體DNA， 參照Kaiser等1994)的試驗設(shè)計。這一 DNA用作XYL1基因956bp無內(nèi)含子(introne — free)開放讀碼框PCR擴(kuò)增的模板(Amore等1993)。所得片斷在1%瓊脂糖凝膠中分離并 使用Genomed的"JETQUICK Gel Extraction Spin Kit"進(jìn)行純化。質(zhì)粒經(jīng)相應(yīng)的限制性 核酸內(nèi)切酶處理并經(jīng)上述方法純化。使用P425GPD作為載體以在釀酒酵母菌中的表達(dá)。此 載體是多拷貝質(zhì)粒且包含作為選擇標(biāo)記物的釀酒酵母菌LEU2基因(Mumberg等1995)。此 載體經(jīng)相同的限制性核酸內(nèi)切酶切為片斷并相應(yīng)地純化。XYLI基因的開放讀碼框扎結(jié)于 載體中，通過質(zhì)粒制備和限制性分析鑒定重組質(zhì)粒。在使用此方法制備的質(zhì)粒(p425GPD — PsXYLl)中，XYLI的轉(zhuǎn)染易于受強(qiáng)GPD啟動子的控制，并確保釀酒酵母菌中外源xR的高表 達(dá)。釀酒酵母菌株K0Y50 (MATa ;his3 A 1 ;leu2 A ;ura3 A 0)被p425GPD 一 PsXYLl轉(zhuǎn)化，參 照Schietstl和Gietz的方法(1989)。分離并分析了 Leucin —原養(yǎng)型轉(zhuǎn)化體。
實施例2通過基因NDE1和NDE2基因替換失活NADH脫氫酶 位于線粒體的細(xì)胞溶質(zhì)的NADH脫氫酶與XR競爭輔因子NADH。為了減少細(xì)胞溶 質(zhì)的NADH消耗，通過適宜的DNA片斷基因替換使得基因NDE1和NDE2失活。與NDEI起始 密碼子5'端40bp同源和終止密碼子3'端40bp同源的替換片斷經(jīng)PCR擴(kuò)增。此片斷包含 裂殖酵母屬程酒的hiss+基因和補(bǔ)充有釀酒酵母菌的his3突變(Wach等1997)。擴(kuò)增后， 如上述方法分離純化此片斷。根據(jù)Schiestl和Gietz (1989)的方法使用替換片斷轉(zhuǎn)化釀 酒酵母菌株K0YS0。分離組氨酸原養(yǎng)型轉(zhuǎn)化體。使用診斷PCR證實此片斷正確整合與NDEI 取代。這一菌株(K0Y50 Andel)經(jīng)p425GPD — PoXYLl轉(zhuǎn)化，如實施例1所述，并用于制備 木糖醇。 如上述方法構(gòu)建NDE2同源替換片斷，用以制備ndel/nde2雙突變體。此時使用 kanMX組件(Wach等1994)作為選擇性標(biāo)記物。此組件使轉(zhuǎn)化體可耐受G418 (geneticine)。 轉(zhuǎn)化后，K0Y50 Andel細(xì)胞置于包含G418的培養(yǎng)基上。杭性克隆經(jīng)診斷PCR測試以確定正 確插入了替換片斷并使NDE2失活。所得菌株(K0Y50 Andel Ande2)經(jīng)p425GPD — PsXYLl 轉(zhuǎn)化，如實施例1所述，并用于制備木糖醇。
實施例3 編碼磷酸甘油脫氫酶的基因GPD1和GPD2的基因替換 細(xì)胞質(zhì)的磷酸甘油脫氫酶GPDlp和GPD2p利用NADH作為輔因子。它們的失活優(yōu) 先導(dǎo)致通過使用XR將木糖還原為木糖醇對細(xì)胞溶質(zhì)的NADH的氧化。在基因替換時，使用 了釀酒酵母菌株K0Y50 A nde 1禾P /或KOYSO A nde 1 A nde2 。 這兩菌株均負(fù)有ura3 AO突變。為了此分裂作用，使用了含有與GPD1和GPD2同 源的片斷，如實施例2中對于NDE1的描述。包含白色假絲酵母URA3基因的片斷作為選擇 性標(biāo)記物。此選擇性標(biāo)記物側(cè)翼的DNA部分彼此相同。白色假絲酵母的URA3補(bǔ)充釀酒酵 母菌中ura3突變。 尿嘧啶代謝未受損的細(xì)胞與ura3突變細(xì)胞相反，對于5 — Forodica aid(5 — FOA)敏感。將分裂盒整合入基因組后，在重復(fù)DNA部分上生成自發(fā)同源重組并因此失去 URA3標(biāo)記物。發(fā)生這樣的重組的克隆可被簡便的分離，因為它們能耐受5 — F0A。
上述DNA片斷經(jīng)PCR擴(kuò)增并純化。CPD1基因替換片斷根據(jù)Schiestl和Cietz(1989)在釀酒酵母K0Y50 A ndel和/或K0Y50 A ndel A nde2中的方法轉(zhuǎn)化。
尿嘧啶原養(yǎng)型轉(zhuǎn)化體在相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基上分離。通過診斷PCR替換GPD1。接 著，此方法構(gòu)建的菌株經(jīng)5 — FOA耐受選擇。在5 — FOA耐受的菌株中，通過診斷PCR檢 測URA3標(biāo)記物的損失。最后，如上所述，在進(jìn)一步的工作中失活GPD2。這樣構(gòu)建的菌株經(jīng) p425GPD-PsXYLl轉(zhuǎn)化，如實施例1所述，并用于制備木糖醇。
實施例4 通過四分體分析(tetrad analysis)脫氫酶失活的菌株的制備為了制備幾種脫氫 酶失活的菌株，首先分別失活各相關(guān)基因，如實施例2中所述。隨后雜交育種各突變體并因 此形成d印loid菌株的袍子，進(jìn)行四分體分析。 雙突變體可在非親代雙型(NPD)中簡便地鑒定。K0Y50株用于失活GPD1和GPD2， 如實施例2中對于NDEI的描述，各自被基因替換。雜交相反配對型的轉(zhuǎn)化體，所得菌株在 相應(yīng)培養(yǎng)基上導(dǎo)致袍子形成(s porilate)。四分體測試組氛酸原養(yǎng)型。NPD四分體GPD1/ GPD2雙零突變體作為組氨酸一原養(yǎng)型單袍子的克隆而被分離，經(jīng)p425GPD — PsXYLl轉(zhuǎn)化， 并用于制備木糖醇。
權(quán)利要求
微生物制備木糖醇的方法，其特征在于本發(fā)明包括如下工序1)修飾微生物從而減少或消除除木糖還原酶以外的酶對NADH的氧化；2)在含有木糖和5～50g/L亞硫酸鹽的底物中培養(yǎng)微生物；3)在需氧生長期和限氧木糖醇生成期培養(yǎng)微生物；4)自底物中富集和提取木糖醇。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物制備木糖醇的方法，其特征在于所述的亞硫酸鹽可為 亞硫酸氫鈣，亞硫酸鈉，亞硫酸鉀中的一種或其混合物。
全文摘要
微生物制備木糖醇的方法屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種微生物制備木糖醇(xylite)的方法。本發(fā)明提供一種生產(chǎn)率較高的微生物制備木糖醇的方法。本發(fā)明包括如下工序1)修飾微生物從而減少或消除除木糖還原酶以外的酶對NADH的氧化；2)在含有木糖和5～50g/L亞硫酸鹽(例如亞硫酸氫鈣，亞硫酸鈉，亞硫酸鉀)的底物中培養(yǎng)微生物；3)在需氧生長期和限氧木糖醇生成期培養(yǎng)微生物；4)自底物中富集和提取木糖醇。本發(fā)明與其他生物技術(shù)相比，關(guān)鍵在于還原酶可以循環(huán)使用，而不用加過量還原酶，因而木糖醇的轉(zhuǎn)化率更高。
文檔編號C12P19/02GK101705266SQ20081013215
公開日2010年5月12日 申請日期2008年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月21日
發(fā)明者鄭春輝 申請人:鄭春輝