專利名稱：一種短棒狀桿菌制劑或無(wú)細(xì)胞短棒狀桿菌制劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種短棒狀桿菌制劑或者無(wú)細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCPP)在制備抗纖維化藥物方面的用途，特別是在制備抗肝纖維化、肺纖維化、心肌纖維化、血管纖維化、腫瘤組織纖維化、腫瘤的放療、化療產(chǎn)生的纖維化病變、腎纖維化、骨髓纖維化或者老年性癡呆等藥物方面的用途，所述的NCPP是由短棒狀桿菌(CP)經(jīng)破碎制備的無(wú)細(xì)胞納米級(jí)制劑，屬于生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肝纖維化(Hepatic fibrosis，HF)是多種致病因素引起的慢性肝病的共同病理基礎(chǔ)，是進(jìn)一步向肝硬化發(fā)展的主要中間環(huán)節(jié)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，我國(guó)為乙型肝炎病毒感染的高流行地區(qū)，已有六億人感染過(guò)乙肝病毒，約1.2億人攜帶乙肝病毒，其中約1/4的病人最終發(fā)展為慢性肝病，包括慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝癌。因此，在“肝炎-肝纖維化-肝硬化”疾病進(jìn)展過(guò)程中，肝纖維化的防治是治療肝病的關(guān)鍵。
特發(fā)性肺纖維化(IPF)為原因不明的進(jìn)行性纖維化的肺泡壁慢性炎癥，尋常性間質(zhì)性肺炎(UIP)，也稱肺纖維化(IPE)、纖維性肺泡炎(CFA)作為一個(gè)間質(zhì)性肺炎特殊組織病理類型，是在IPF肺活檢中發(fā)現(xiàn)的典型類型.在低倍鏡下，組織表現(xiàn)異質(zhì)性，在正常肺組織中夾雜病變區(qū)域，間質(zhì)炎癥，纖維化和蜂窩樣改變，這些改變?cè)谛啬は峦庵芊螌?shí)質(zhì)最為嚴(yán)重。
特發(fā)性肺纖維化是一種至今還沒(méi)有查明病因的慢性肺間質(zhì)性疾病。起病隱襲、進(jìn)行性加重、最終導(dǎo)致肺、心功能衰竭。本病成為不可預(yù)防、不易早期發(fā)現(xiàn)、不好治療、進(jìn)行性損害的″絕癥″。目前尚無(wú)有效的治療藥物。急性肺纖維化后，纖維組織代替正常的組織，肺泡結(jié)構(gòu)變形失去呼吸功能，最終導(dǎo)致呼吸衰竭，不得不依賴呼吸機(jī)、甚至死亡。
心肌纖維化是由于心肌長(zhǎng)期供血不足，或高血壓、病毒性心肌炎等因素?fù)p傷心肌，導(dǎo)致部分心肌死亡，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，損傷修復(fù)過(guò)度以致纖維組織增生，代替了正常的心肌組織，心室肥厚，形成心肌纖維化。纖維化形成后，心臟收縮舒張功能障礙，泵血能力降低；纖維瘢痕形成，心肌電傳導(dǎo)障礙，引起心律失常，甚至猝死；心臟順應(yīng)性降低，心室內(nèi)壓力增高，嚴(yán)重時(shí)可引起心臟破裂；纖維化最終可發(fā)展成心力衰竭，組織器官缺血缺氧，全身器官功能衰竭，最終死亡。心肌纖維化是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，涉及神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)，其中免疫系統(tǒng)起重要的作用。
血管纖維化，是由于感染、高血脂、高血糖等慢性損傷因素導(dǎo)致血管壁發(fā)生炎癥損傷，激活免疫系統(tǒng)，在損傷--修復(fù)的反復(fù)過(guò)程中，促纖維化因子生成增多，促進(jìn)血管壁發(fā)生組織纖維化，從而導(dǎo)致管壁變厚、管腔狹窄，在其他因素的參與下進(jìn)一步形成動(dòng)脈粥樣硬化。血管纖維化以后，管壁增厚，管腔變細(xì)，血流也難以通暢。既然血管遍布全身，血管纖維化的危害也是極大的。累及心臟冠狀動(dòng)脈，造成心臟供血不足，繼而誘發(fā)心肌纖維化等心臟??；累及腦動(dòng)脈，造成腦供血不足、缺血，誘發(fā)中風(fēng)、猝死；累及下肢動(dòng)脈(脈管炎)，造成下肢局部缺血、營(yíng)養(yǎng)障礙、甚至壞死，如不及時(shí)治療只有選擇截肢。
腫瘤也和組織纖維化有關(guān)系，而且這種關(guān)系在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移以及放療、化療中均存在。組織纖維化可促進(jìn)腫瘤的產(chǎn)生，長(zhǎng)期持續(xù)的纖維化反應(yīng)導(dǎo)致大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，組織破壞和修復(fù)過(guò)程同時(shí)進(jìn)行，產(chǎn)生大量促纖維化因子，刺激上皮增殖，產(chǎn)生活性氧等損傷DNA，損傷不斷積累最終導(dǎo)致細(xì)胞癌變，產(chǎn)生腫瘤。流行病學(xué)資料表明，多種纖維化反應(yīng)可顯著增加腫瘤轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)。纖維化反應(yīng)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。
腫瘤的放療、化療亦會(huì)產(chǎn)生明顯的纖維化病變。高劑量的放療可導(dǎo)致支氣管狹窄、支氣管軟化和縱膈纖維變性以及肺纖維化等，表現(xiàn)為肺收縮、胸膜增厚、氣管或縱膈偏向照射區(qū)。胸部放療和化療同時(shí)使用時(shí)，常導(dǎo)致急性食管炎綜合征，產(chǎn)生輕度到重度的纖維化，導(dǎo)致食管永久性狹窄。這些纖維化樣病變，一旦形成即難以逆轉(zhuǎn)，嚴(yán)重時(shí)明顯地影響病人的生存質(zhì)量。
腎纖維化是腎臟在對(duì)抗慢性損傷(腎炎、高血壓等)修復(fù)受損組織的過(guò)程中，細(xì)胞外基質(zhì)成分在腎臟中過(guò)度增生與沉積，纖維組織代替正常腎組織，導(dǎo)致慢性腎功能不全，最終發(fā)展為腎功能衰竭。除了變態(tài)反應(yīng)引起的炎癥和細(xì)菌感染對(duì)腎臟造成損傷引起腎纖維化以外，臨床比較常見的還有高血壓腎病、糖尿病腎病、泌尿道阻塞性腎病可引起腎纖維化。
骨髓纖維化與肝硬化病機(jī)理相似，只是纖維組織增生的部位不同，有時(shí)兩者同時(shí)存在。骨髓纖維化為一種骨髓增殖性疾病，其骨髓造血組織逐漸為纖維組織所代替而嚴(yán)重地影響了造血功能，導(dǎo)致造血功能衰竭。原發(fā)性骨髓纖維化病因未明，繼發(fā)性骨髓纖維化可由化學(xué)(化療)、物理因素(放療)、藥物(激素)、損傷及感染影響，腫瘤、白血病細(xì)胞浸潤(rùn)等引起。骨髓纖維化多數(shù)是慢性的，一般病程平均5～7年，部分可轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙园籽?。少?shù)表現(xiàn)為急性骨髓纖維化。
老年性癡呆包括血管性癡呆和阿爾茲海默癥是一種由于腦纖維化、腦萎縮引起的神經(jīng)退行性疾病。逆轉(zhuǎn)血管纖維化可有效治療血管性癡呆。防止大腦皮層和海馬的蛋白質(zhì)纖維化有可能治療阿爾茲海默癥。
短棒狀桿菌菌苗(CPV，1995版《中國(guó)生物制品規(guī)程》)或稱短棒狀桿菌制劑(CPP，2000版《中國(guó)生物制品規(guī)程》)是一種非特異性免疫調(diào)節(jié)劑。它是由短棒狀桿菌(CP)經(jīng)甲醛滅活后制成的死菌苗，其制備過(guò)程公開在1995版及2000版《中國(guó)生物制品規(guī)程》。目前應(yīng)用的CPP制劑還有法國(guó)Merleux研究所生產(chǎn)的滅活菌苗；英國(guó)Wellcome藥廠生產(chǎn)的滅活菌苗等。
為了降低CPP的副作用、提高藥效，中國(guó)專利申請(qǐng)CN02123571.6、CN02123572.4、CN02123570.8公開了一種無(wú)細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCP)、其制備方法及其在制備治療結(jié)核病藥物上的用途。是由短棒狀桿菌(CP)制備的無(wú)細(xì)胞制劑，熱原小于160EU/ml，蛋白質(zhì)含量10-40％(g/g)，核酸含量3-25％(g/g)，其余為多糖，粒度小于100nm。該NCP是將CP破碎至納米級(jí)，經(jīng)離心去除無(wú)效的上清部分，收集沉淀部分制備的，熱原低、無(wú)雜菌污染、無(wú)殘留甲醛，顆粒具有納米級(jí)，粒度均一，吸收度和擴(kuò)散度提高，有利于人體吸收并提高藥效；同時(shí)減少發(fā)燒、胸痛，注射局部紅腫、硬結(jié)等副作用，是一種有前途的免疫調(diào)節(jié)劑。
CN02123570.8進(jìn)一步公開了一種短棒狀桿菌制劑(CPP)或無(wú)細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCP)在制備治療HIV感染或愛滋病藥劑中的應(yīng)用。
CPP作為免疫調(diào)節(jié)劑，免疫系統(tǒng)的作用主要表現(xiàn)在激活單核巨噬細(xì)胞、使NK細(xì)胞活性增強(qiáng)、促進(jìn)機(jī)體對(duì)多種抗原產(chǎn)生IgG和IgM、誘生干擾素、白細(xì)胞介素-2等，因此具有抗腫瘤和抗感染作用。其抗腫瘤作用已為許多實(shí)驗(yàn)和臨床研究所證實(shí)。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種腫瘤前后應(yīng)用CPP，能顯著抑制某些實(shí)體瘤(如乳腺癌、黑色素瘤等)、腹水型腫瘤及白血病的生長(zhǎng)。腫瘤消退的動(dòng)物對(duì)于再次攻擊的腫瘤細(xì)胞有特異性的抵抗力。CPP對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移亦有抑制作用。
基于上述原理及臨床實(shí)踐，開發(fā)CPP及NCP的新的用途是非常有意義的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種短棒狀桿菌制劑(CPP)或無(wú)細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCP)在制備治療抗肝纖維化藥物方面的用途。
其中所述的抗肝纖維化包括肝纖維化、肺纖維化、心肌纖維化、血管纖維化、腫瘤組織纖維化、腫瘤的放療、化療產(chǎn)生的纖維化病變、腎纖維化、骨髓纖維化以及老年性癡呆等。
其中所述的短棒狀桿菌制劑是一種非特異性免疫調(diào)節(jié)劑。見2000版《中國(guó)生物制品規(guī)程》它是由短棒狀桿菌(CP)經(jīng)甲醛滅活后制成的死菌苗。
其中的無(wú)細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCP)及其制備方法見CN02123570.8、CN02123571.6、CN02123572.4和CN02123570.8。
具體地說(shuō)，本發(fā)明的NCPP是由短棒狀桿菌(CP)經(jīng)破碎制備的無(wú)細(xì)胞納米級(jí)制劑，具有低熱原、粒度均一、無(wú)甲醛殘留的特點(diǎn)。
NCPP由于具有納米級(jí)，吸收度、擴(kuò)散度明顯提高，與全菌體制劑具有相同的脾激活及抑瘤等生物學(xué)活性，并可降低發(fā)燒、胸痛、注射局部紅腫、硬結(jié)等副作用。
本發(fā)明NCPP是由CP經(jīng)破碎制備的無(wú)細(xì)胞納米級(jí)制劑，其粒度小于100nm。
其中所述的CP，學(xué)名為粉刺丙酸桿菌(propionibacterium acnes)菌號(hào)為65101(76-27或7627)、65102(H-84)或65103(77-1或771)。
本發(fā)明所述的NCPP的熱原小于160EU/ml，蛋白質(zhì)含量10-40％(g/g)，核酸含量3-25％(g/g)，其余為多糖。
優(yōu)選本發(fā)明NCPP的熱原小于60EU/ml，蛋白質(zhì)含量20-30％(g/g)，核酸含量3-10％(g/g)，其余為多糖。
本發(fā)明NCPP的粒度優(yōu)選為10-50nm。
本發(fā)明所述的NCPP是通過(guò)下述步驟制備的1)CP工作種子批菌種連續(xù)2-4次傳代后接種于大瓶或營(yíng)養(yǎng)罐，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天；2)收集無(wú)雜菌污染的菌體，加熱煮沸15-60分鐘得到菌液；3)無(wú)菌試驗(yàn)合格的菌液經(jīng)洗滌后，用破碎裝置破碎菌體；4)菌體破碎后的懸液經(jīng)離心后收集沉淀，洗滌沉淀制成懸液；5)將懸液加熱滅菌，得到NCPP。
其中步驟1)中所述的CP學(xué)名為粉刺丙酸桿菌，菌號(hào)為65101(76-27或7627)、65102(H-84)或65103(77-1或771)。
培養(yǎng)基為選自硫乙醇酸鹽、蛋白胨、肝或酵母透析液培養(yǎng)基中的一種，且為低熱原培養(yǎng)基。
步驟1)中培養(yǎng)條件為36-37℃培養(yǎng)。
優(yōu)選所述培養(yǎng)基為不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。
其中步驟3)中所述的菌體是滅活菌，菌體濃度為50-500億/ml。
所述破碎裝置是將菌體破碎到小于100nm，優(yōu)選粒度為10-50nm的超高壓射流對(duì)撞機(jī)。
其中所述菌體破碎是在無(wú)菌條件下進(jìn)行。
其中步驟3)中所述的洗滌是將沉淀物用無(wú)菌生理鹽水離心洗滌至少2次；步驟4)中所述的洗滌是將沉淀物用無(wú)菌生理鹽水離心洗滌1-5次。
步驟4)菌體破碎后懸液的離心條件是在4℃-室溫，6000-12000rpm離心30-150分鐘。
步驟5)中所述的加熱為在60-65℃加熱0.5-2小時(shí)。
本發(fā)明的制備方法中，進(jìn)一步包括將步驟5)得到的NCP分裝后，安瓿在60±2℃加熱30分鐘。
本發(fā)明中所述培養(yǎng)基優(yōu)選為經(jīng)過(guò)0.22μm或μm0.45μm膜過(guò)濾的低熱原培養(yǎng)基。
本發(fā)明所述的制備方法中，還包括將步驟5)得到的NCP冷凍干燥，得到NCPP的凍干制劑。
上述方法制備的NCPP熱原小于160EU/ml，蛋白質(zhì)含量10-40％(g/g)，核酸含量3-25％(g/g)，其余為多糖。
優(yōu)選上述方法制備的NCPP熱原小于60EU/ml，蛋白質(zhì)含量20-30％(g/g)，核酸含量3-10％(g/g)，其余為多糖。
上述方法制備的NCPP粒度小于100nm，優(yōu)選粒度為10-50nm。
本發(fā)明中所述的無(wú)菌檢驗(yàn)合格是指按照《中國(guó)生物制品規(guī)程》規(guī)定的方法檢驗(yàn)不得有任何細(xì)菌生長(zhǎng)。
本發(fā)明中由于采用低熱原培養(yǎng)基，特別是硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，并結(jié)合嚴(yán)格的質(zhì)控，以及整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中無(wú)菌低熱原操作，保證了最終產(chǎn)品低熱原和無(wú)雜菌的污染。
本發(fā)明通過(guò)超高壓射流對(duì)撞機(jī)將CP破碎至納米級(jí)，通過(guò)選擇不同的離心力(轉(zhuǎn)速)，確定了離心提取條件，獲得的沉淀部分為NCP，經(jīng)多次動(dòng)物試驗(yàn)證明，該制劑與全菌體具有相同的脾激活及抑瘤等生物學(xué)活性，上清部分則無(wú)脾激活及抑瘤作用，表明本發(fā)明的NCPP具有良好的生物學(xué)活性。
為了消除CPP中殘留甲醛對(duì)機(jī)體的刺激性，尤其是對(duì)敏感胸膜的刺激性，本發(fā)明中采用加熱滅活替代了甲醛滅活。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，加熱滅活的NCPP、CPP較甲醛滅活的CPP具有相同的脾激活及抑瘤等生物學(xué)活性。
超高壓射流對(duì)撞機(jī)的工作原理是將混有被加工物的液體用高壓泵(工作壓力為10-3000kgf/cm2)加壓后分成兩股，以高速射流進(jìn)入兩片直徑為8MM人造金剛石芯片組成的信道中，相向?qū)ψ埠罅鞒?。由于液體的速度很高，流體相向?qū)ψ矔r(shí)產(chǎn)生很強(qiáng)的沖擊波，使金剛石芯片產(chǎn)生高頻、高強(qiáng)超聲波。大功率高頻超聲波使被加工物顆粒瞬間粉碎、超微化。
本發(fā)明的制備過(guò)程中，為更好地破碎菌體，采用超高壓射流對(duì)撞機(jī)，在菌體濃度為50-500億/ml，工作壓力為800-1500kgf/cm2的條件下破碎，破碎后的菌體懸液在4℃-室溫下，6000-12000rpm離心30-150分鐘，棄上清，沉淀用無(wú)菌生理鹽水溶液洗滌0-5次后制成懸液，在60-65℃加溫0.5-2小時(shí)，無(wú)菌試驗(yàn)合格后合并，經(jīng)配制、分裝，分裝后安瓿在60±2℃加熱15-60分鐘，得到高質(zhì)量、粒度和均一性良好的目的產(chǎn)品。
本發(fā)明的NCP是將CP的細(xì)胞破碎至納米級(jí)，經(jīng)離心去除無(wú)效的上清部分，收集沉淀部分制備的，產(chǎn)品具有低熱原、無(wú)雜菌污染、無(wú)甲醛殘留，顆粒具有納米級(jí)，粒度均一，吸收度和擴(kuò)散度提高，有利于人體吸收并提高藥效；同時(shí)可減少發(fā)燒、胸痛，注射局部紅腫、硬結(jié)等副作用，是一種有前途的免疫制劑。
根據(jù)需要，本發(fā)明的NCP可以制成無(wú)菌生理鹽水的懸浮制劑，固體含量為1.0mg/ml或2.0mg/ml，也可以制成凍干粉針或適合藥用的其它劑型。
本發(fā)明的NCPP為免疫調(diào)節(jié)劑，可以用于癌性胸水、結(jié)合手術(shù)治療早、中期肺癌，乳腺癌、鼻咽癌、晚期肺癌、黑色素瘤以及癌癥體表轉(zhuǎn)移灶的治療，亦可用于牛皮癬、再生障礙性貧血、女陰白斑、感染性哮喘、結(jié)核病的治療或輔助治療，特別是在肌體的纖維化治療方面，例如抗肝纖維化、抗肺纖維化方面，有著很好的應(yīng)用；尤其是在抗肝纖維化方面，作用顯著。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，所述的實(shí)施例用于描述本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。


圖1是現(xiàn)有技術(shù)的CPP的電鏡照片。
圖2是本發(fā)明的NCP的電鏡照片。
具體實(shí)施例方式
下面是本發(fā)明的具體實(shí)施例，其中CP學(xué)名為粉刺丙酸桿菌(propionibacterium acnes)，菌號(hào)為65101(76-27)、65102(H-84)公開于1993版《中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種目錄》，北京理工大學(xué)出版社(ISBN7-81013-859-6/R.7)，65103(77-1或771)公開于2000版《中國(guó)生物制品規(guī)程》，化學(xué)工業(yè)出版社。
實(shí)施例1
參照2000版《中國(guó)生物制品規(guī)程》中描述的方法進(jìn)行細(xì)菌種子批的建立、檢定以及其它檢定。
本實(shí)施例中采用的培養(yǎng)基為北京三藥科技開發(fā)公司出品的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(不含瓊脂)，成分為胰酪胨15g/l，酵母浸粉5g/l，葡萄糖5g/l，氯化鈉2.5g/l，L-胱氨酸0.5g/l，硫乙醇酸鈉0.5g/l。使用前將培養(yǎng)基用0.22μm膜過(guò)濾。
啟開CP(學(xué)名粉刺丙酸桿菌，propionibacterium acnes)771(見《中國(guó)生物制品規(guī)程》)菌種管，每管含菌60億，用毛細(xì)管吸取約0.2-0.3ml硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(不含瓊脂)，加在菌種管底部使之完全溶解后吸出，加入中管(容量38ml)中，用上述培養(yǎng)基8-10ml混合，置37℃培養(yǎng)2天。取菌液用上述培養(yǎng)基(菌液∶培養(yǎng)基體積比＝1∶9)混合，置37℃培養(yǎng)2天。取上述培養(yǎng)的菌液用上述培養(yǎng)基(按1∶9)混合，置37℃培養(yǎng)3天，收獲菌液。逐瓶鏡檢，有雜菌污染者棄之。合并收集無(wú)雜菌污染的菌體加熱煮沸15分鐘，用超高壓射流對(duì)撞擊(日本Nanonizer Inc.產(chǎn)品，型號(hào)NMG-75-200)在1000kgf/cm2壓力下破碎菌體3次；破碎后的懸液在室溫、6000rpm離心90分鐘，收集沉淀，用無(wú)菌生理鹽水洗滌沉淀3次，無(wú)菌檢驗(yàn)(2000版《中國(guó)生物制品規(guī)程》)及熱原檢測(cè)(2000版《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》)合格后制成固體含量為0.5mg/ml的懸液，60℃加熱1小時(shí)，得到NCP。
其中CP，學(xué)名為粉刺丙酸桿菌65103(77-1)或771。
經(jīng)鱟試劑法(2000版《中華人民共和國(guó)藥典》)檢測(cè)(固體含量1mg/ml)，本發(fā)明的NCP熱原20EU/ml；考馬斯亮蘭法(《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法》，北京大學(xué)出版社)測(cè)定蛋白質(zhì)含量25％(g/g)；紫外法(2000版《中國(guó)生物制品規(guī)程》)260nm測(cè)定核酸含量10％(g/g)；蒽酮法(2000版《中國(guó)生物制品規(guī)程》)測(cè)定多糖含量為10％(g/g)?？紤]到蛋白質(zhì)和核酸的測(cè)定結(jié)果比較準(zhǔn)確，估計(jì)其余的多糖未測(cè)出。電鏡測(cè)定粒度為60-100nm。
分裝后，安瓿在60±2℃加熱20分鐘。
實(shí)施例2參照實(shí)施例1的方法，將CP(學(xué)名粉刺丙酸桿菌，propionibacterium acnes)65101(76-27)連續(xù)4次傳代后接種于營(yíng)養(yǎng)罐，在硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(不含瓊脂)(使用前將培養(yǎng)基用0.45μm膜過(guò)濾)中，36-37℃培養(yǎng)6天；逐瓶鏡檢，有雜菌污染者棄之；合并收集無(wú)雜菌污染的菌體加熱煮沸60分鐘，用超高壓射流對(duì)撞機(jī)在1500kgf/cm2壓力下破碎菌體5次；破碎后的懸液8000rpm離心1小時(shí)，用無(wú)菌生理鹽水洗滌沉淀5次，無(wú)菌檢驗(yàn)(2000版《中國(guó)生物制品規(guī)程》)及熱原檢測(cè)(2000版《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》)合格后制成固體含量為2.0mg/ml的懸液，65℃加熱60分鐘，得到NCP。
經(jīng)鱟試劑法(2000版《中華人民共和國(guó)藥典》)檢測(cè)(固體含量1mg/ml)，NCP熱原160EU/ml；考馬斯亮蘭法(《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法》，北京大學(xué)出版社)測(cè)定蛋白質(zhì)含量40％(g/g)；紫外法(2000版《中國(guó)生物制品規(guī)程》)260nm測(cè)定核酸含量5％(g/g)；蒽酮法(2000版《中國(guó)生物制品規(guī)程》)測(cè)定多糖含量為20％(g/g)?？紤]到蛋白質(zhì)和核酸的測(cè)定結(jié)果比較準(zhǔn)確，估計(jì)其余的多糖可能未測(cè)出。電鏡檢測(cè)粒度為10-50nm。參見圖2，粒度均勻。圖1為現(xiàn)有技術(shù)的CPP的電鏡照片。
分裝后，安瓿在60±2℃加熱30分鐘。
實(shí)施例3參照實(shí)施例1的方法，將CP(學(xué)名粉刺丙酸桿菌，propionibacterium acnes)65102(H-84)連續(xù)4次傳代后接種于營(yíng)養(yǎng)罐，在蛋白胨培養(yǎng)基中36-37℃培養(yǎng)7天；逐瓶鏡檢，有雜菌污染者棄之；合并收集無(wú)雜菌污染的菌體加熱煮沸30分鐘，用超高壓射流對(duì)撞機(jī)(日本Nanonizer Inc.產(chǎn)品，型號(hào)AQUA300)800kgf/cm2壓力下破碎菌體10次；破碎后的懸液12000rpm離心，用無(wú)菌生理鹽水洗滌沉淀4次，無(wú)菌檢驗(yàn)(2000版《中國(guó)生物制品規(guī)程》)及熱原檢測(cè)(2000版《中華人民共和國(guó)藥典》)合格后制成固體含量為1.0mg/ml的懸液，65℃加熱100分鐘，得到NCP。
經(jīng)鱟試劑法(2000版《中華人民共和國(guó)藥典》)檢測(cè)(固體含量1mg/ml)NCP熱原60EU/ml，考馬斯亮蘭法(《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法》，北京大學(xué)出版社)測(cè)定蛋白質(zhì)含量12％(g/g)，紫外法(2000版《中國(guó)生物制品規(guī)程》)260nm測(cè)定核酸含量25％(g/g)，蒽酮法(2000版《中國(guó)生物制品規(guī)程》)測(cè)定多糖含量為16％(g/g)，考慮到蛋白質(zhì)和核酸的測(cè)定結(jié)果比較準(zhǔn)確，估計(jì)其余的多糖未測(cè)出。電鏡檢測(cè)平均粒度為40-80nm，粒度均勻。分裝后，安瓿在60±2℃加熱30分鐘。
實(shí)施例4其它同實(shí)施例1，不同之處在于破碎后的懸液在8000rpm離心1小時(shí)后，用凍干機(jī)凍干，得到粉針劑。
比較例1采用2000版《中國(guó)生物制品規(guī)程》中描述的方法將CP(學(xué)名粉刺丙酸桿菌，propionibacterium acnes)771連續(xù)3次傳代后接種于營(yíng)養(yǎng)罐，在硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(不含瓊脂)中36-37℃培養(yǎng)5天；逐瓶鏡檢，有雜菌污染者棄之；合并收集無(wú)雜菌污染的菌體分別加熱煮沸30、60分鐘進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)，無(wú)菌試驗(yàn)合格的菌液經(jīng)離心后，用新鮮無(wú)菌生理鹽水溶液洗滌沉淀3次并制成懸液，60-65℃加熱1小時(shí)，無(wú)菌檢測(cè)合格后分裝，安瓿在60±2℃加熱30分鐘，經(jīng)檢測(cè)兩種樣品每瓶含菌為6.0×109。
比較例2其它同比較例1，不同之處在于采集之無(wú)雜菌污染的菌體加入甲醛溶液至最終濃度約為0.5％(ml/ml)殺菌48小時(shí)，經(jīng)檢測(cè)每瓶含菌為6.0×109，游離甲醛含量為0.06g/L。
實(shí)驗(yàn)例1由比較例2看出，CPP中殘留有微量的甲醛，甲醛能固定蛋白質(zhì)，殺死細(xì)菌，但對(duì)機(jī)體具有較強(qiáng)的刺激性。CPP中甲醛殘留量雖然很少(應(yīng)不高于0.06g/l)，但仍會(huì)對(duì)人體，尤其是對(duì)敏感的胸膜產(chǎn)生刺激性。
本發(fā)明中按照2000版《中國(guó)生物制品規(guī)程》中第240-241頁(yè)中CPP制造及檢定規(guī)程中規(guī)定的方法對(duì)比較例1、2制備的CPP的脾激活及抑瘤生物學(xué)活性進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果見表1。
同時(shí)，本發(fā)明中按照下述方法對(duì)本發(fā)明實(shí)施例1-4的NCP脾激活及抑瘤生物學(xué)活性進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果見表1。
脾激活試驗(yàn)用體重18-20g純種小鼠(C3H、615或C57BL)，試驗(yàn)組及對(duì)照組各10只，雌雄各半。試驗(yàn)組每只小鼠腹腔分別注射CPP 0.5ml(含菌1.5×109)及實(shí)施例1-3的NCP制劑0.5ml(1-3的NCP固體含量都調(diào)整到1mg/ml)，對(duì)照組注射同量生理氯化鈉溶液。14天處死小鼠，分別稱體重、脾重、計(jì)算脾指數(shù)，其指數(shù)應(yīng)不低于2.0。

抑瘤實(shí)驗(yàn)(艾氏腹水瘤)用體重18-20g純種小鼠(C3H、615、C57BL、K-LACA或昆明鼠)，試驗(yàn)組及對(duì)照組各10只，雌雄各半。每只小鼠腹腔注射活的瘤細(xì)胞(5.0×106/ml)0.2ml(用傳代5-8天非血性腹水)。試驗(yàn)組于注射瘤細(xì)胞前1天及注射后次日起，連續(xù)腹腔分別注射CPP 0.25ml(含菌1.5×109)及實(shí)施例1-3的NCP 0.25ml(1-3的NCP固體含量調(diào)整到2mg/ml)5次，每次間隔1天。對(duì)照組注射同量生理氯化鈉溶液。對(duì)照組小鼠全部因癌性腹水死亡為起點(diǎn)計(jì)算試驗(yàn)組小鼠存活率，觀察期30天，其存活率應(yīng)不低于70％。
表1


脾激活及抑瘤實(shí)驗(yàn)可說(shuō)明CPP或NCP的生物學(xué)活性及藥效。表1的結(jié)果表明，加熱煮沸30分鐘、加熱煮沸60分鐘、0.5％甲醛溶液滅活制備的CPP以及本發(fā)明的NCP，其小鼠脾激活及抑瘤實(shí)驗(yàn)效果相同，無(wú)明顯差異，說(shuō)明加熱煮沸滅活以及破碎提取對(duì)CPP及NCP的生物學(xué)活性及藥效無(wú)明顯影響。
實(shí)驗(yàn)例2本實(shí)驗(yàn)為人體對(duì)NCP、CPP、UCP吸收性能的比較內(nèi)容家兔CPP、UCP及NCP皮內(nèi)吸收實(shí)驗(yàn)。UCP為超聲波破碎細(xì)菌，在冰浴條件下，輸入高能超聲波破菌10次，每次30s，每次間歇30s；將超聲液8000rpm離心30min，取沉淀加N.S懸浮制成。
家兔1500-2000克，雌雄各半，分為CPP組、UCP組及NCP組，每組各4只。
給藥每只兔背部皮內(nèi)注射，對(duì)照組CPP組0.2ml/只(150億/ml，相當(dāng)于2.5mg/ml)，NCP組0.2ml/只(2.5mg/ml)，UCP組0.2ml/只(2.5mg/ml)。
方法觀察并測(cè)試注射局部，結(jié)果見表2

結(jié)論觀察72小時(shí)，NCP易于被吸收，未產(chǎn)生明顯紅腫、硬結(jié)，CPP、UCP不易被吸收，產(chǎn)生了明顯的紅腫、硬結(jié)反應(yīng)。此結(jié)果說(shuō)明將CPP的細(xì)胞破碎至納米級(jí)，制備NCP，更有利于機(jī)體的吸收，并能顯著減少副作用。
實(shí)驗(yàn)例3
小鼠一次肌注最大劑量的NCP 31.7mg/ml，小鼠未出現(xiàn)死亡，未發(fā)現(xiàn)與給藥有關(guān)的臨床表現(xiàn)，也未發(fā)現(xiàn)給藥對(duì)體重的影響，給藥劑量相當(dāng)臨床用藥量的452.9倍，說(shuō)明人臨床擬用劑量是一個(gè)安全劑量。
實(shí)驗(yàn)例4本實(shí)驗(yàn)例研究了NCPP對(duì)肝纖維化的影響，表明無(wú)細(xì)胞短棒狀桿菌納米級(jí)制劑(NCPP)作為一種具有抗病毒、抗腫瘤作用的免疫增強(qiáng)劑，對(duì)肝纖維化的形成過(guò)程起著重要的作用，為其制備抗纖維化藥物提供了依據(jù)。
材料C57/B6和615小鼠18-20g，雌雄各半；獼猴，年齡3-4歲，雌雄各12只，均由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；痤瘡丙酸桿菌(Ppropionibacterium acnes，P.acnes，ATCC12930)購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)，短棒狀桿菌(corynebacterium parvum，又名痤瘡丙酸桿菌，CPP，Propionibaterium acnes，CMCC65101)由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供或采用法國(guó)Merleux研究所生產(chǎn)的滅活菌苗；NCPP是由短棒狀桿菌(CMCC65101)破碎至納米級(jí)的無(wú)細(xì)胞制劑，參見實(shí)施例1。細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-αELISA檢測(cè)試劑盒為Pharmingen公司的產(chǎn)品。
方法1腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)將C57/B6小鼠30只隨機(jī)分3組痤瘡丙酸桿菌組、NCPP組、生理鹽水對(duì)照組。第1d，痤瘡丙酸桿菌組小鼠每只每次腹腔注射3×1010.mL-1痤瘡丙酸桿菌0.1ml；NCPP組小鼠每只每次腹腔注射5mg.mL-1NCPP0.1ml；對(duì)照組小鼠每只每次腹腔注射生理鹽水(NS)0.1mL。第7d再次注射，方法同初次。
初次注射后的第10d處死小鼠，置消毒液浸10min后，用不完全RPMI1640 5mL反復(fù)洗腹腔，取腹腔液，1500r.min-1離心15min，洗2次，加完全RPMI1640 1mL，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×106/ml。將細(xì)胞懸液加入24孔板每孔1mL，37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)2h。棄上清，每孔用含5％小牛血清的RPMI1640洗板3次；棄去未粘附細(xì)胞單層，貼壁細(xì)胞為巨噬細(xì)胞單層；將終濃度為10ug.mL-1LPS加入巨噬細(xì)胞單層，每孔1mL，培養(yǎng)至48h；收集上清液，置-20℃冰箱保存待測(cè)。
2.細(xì)胞因子的檢測(cè)取上述培養(yǎng)上清液檢測(cè)IFN-γ和TNF-α等各種細(xì)胞因子，按試劑盒說(shuō)明書操作。
3脾指數(shù)、脾臟病理檢查C57/B6小鼠，18-20g，雌雄各半，隨機(jī)分為3組(NCPP組、痤瘡丙酸桿菌組及對(duì)照組)，每組10只，腹腔注射1mg/mL-1NCPP 0.5mL和6×109.mL-1痤瘡丙酸桿菌0.5mL(1mg.mL-1NCPP相當(dāng)于每mL痤瘡丙酸桿菌含菌6.0×109)，對(duì)照組注射0.5mL生理氯化鈉溶液。14d處死小鼠，進(jìn)行脾指數(shù)測(cè)定，并做脾臟病理檢查。
4抑瘤試驗(yàn)615小鼠18-20g，雌雄各半，隨機(jī)分為3組(NCPP組、痤瘡丙酸桿菌組及對(duì)照組)，每組10只，試驗(yàn)組每只腹腔注射活的瘤細(xì)胞(5.0×106.mL-1)0.2mL，于注射癌細(xì)胞前1d及注射后次日起，連續(xù)(間隔1d)腹腔注射1mg.mL-1NCPP 0.5mL與6×109.mL-1痤瘡丙酸桿菌0.5mL 5次，計(jì)算小鼠存活率。
5猴肝病理檢查獼猴隨機(jī)分為4組，生理鹽水(NS)組作為陰性對(duì)照，NCPP設(shè)為3個(gè)給藥劑量組(9，3，1mg.mL-1)/只/次，每組6只，雌雄各半，后肢外側(cè)肌肉內(nèi)交替注射給藥，每周兩次，連續(xù)90d。于停藥次日，處死動(dòng)物。解剖取肝臟，生理鹽水洗凈，取材后固定于10％中性甲醛固定液，經(jīng)梯度乙醛脫水、二甲苯透明、臘塊包埋、切片(厚7um)及蘇木素伊紅(HE)染色等步驟。在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。
6結(jié)果1細(xì)胞因子IFN-γ的檢測(cè) NCPP組與痤瘡丙酸桿菌組比較，NCPP組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IFN-r的水平明顯高于痤瘡丙酸桿菌組，兩組有顯著差異(p＜0.05)；與生理鹽水組比較，NCPP組和痤瘡丙酸桿菌組均有顯著差異(p＜0.05)。見表7。
2細(xì)胞因子TNF-α的檢測(cè) NCPP與痤瘡丙酸桿菌組比較NCPP組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α的水平明顯低于痤瘡丙酸桿菌組，兩組有顯著差異(p＜0.05)；與生理鹽水組比較，NCPP組和痤瘡丙酸桿菌組均有顯著差異(p＜0.05)。見表7。
3脾指數(shù)、脾病理及抑瘤率NCPP組和痤瘡丙酸桿菌組均引起小鼠脾臟明顯增大，脾指數(shù)增高。痤瘡丙酸桿菌組與NCPP組脾臟病理結(jié)果相同與正常對(duì)照組比較，脾竇中單核細(xì)胞及多核巨細(xì)胞明顯增多，表明兩組均可刺激單核巨噬細(xì)胞增加。但NCPP組對(duì)小鼠艾氏腹水瘤有明顯的抑瘤作用，而痤瘡丙酸桿菌組抑瘤作用較差。見表8。
表7ELISA法檢測(cè)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中IFN-r和TNF-α的含量(n＝10)

*P＜0.01，compared with control group.
△P＜0.01，compared with P.acnes group.
表8NCPP與P.acnes脾激活(脾指數(shù))及抑瘤作用(存活率)

猴肝病理檢查結(jié)果形態(tài)學(xué)觀察判斷為陰性的標(biāo)準(zhǔn)肝臟病理檢查結(jié)果肝小葉、肝竇、肝板及肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝竇未見擴(kuò)張，肝細(xì)胞未見明顯變性。在肝組織中偶見肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，個(gè)別匯管區(qū)可見少量慢性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
鏡下觀察猴肝臟病理結(jié)果與正常對(duì)照組比較，NCPP高、中劑量組肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞濁腫，肝竇內(nèi)炎性細(xì)胞較多，杜氏細(xì)胞增多，竇內(nèi)皮細(xì)胞核增大，匯管區(qū)可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，散在肝細(xì)胞紅染，紅染肝細(xì)胞變小、固縮；低劑量組匯管區(qū)炎性細(xì)胞明顯少于高、中劑量組。NCPP無(wú)毒作用劑量介于1～3mg/只，在此劑量下，重復(fù)給藥安全；3個(gè)月長(zhǎng)期重復(fù)給藥，肝沒(méi)有明顯的纖維化現(xiàn)象。CPP具有類似的作用。
結(jié)論肝纖維化的發(fā)生機(jī)制比較復(fù)雜，是多種因素相互作用的結(jié)果。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，各種病因引起肝細(xì)胞(hepatic cell，HC)損傷，刺激庫(kù)普弗細(xì)胞，分泌多種細(xì)胞因子，與血小板、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(SEC)等細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，激活肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)，并引起大量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積，導(dǎo)致了肝纖維化的發(fā)生。這些細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、干擾素(IFN-α、IFN-γ)等，是一類由單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等分泌的多肽物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白的代謝有著重要的調(diào)控作用。Knittel、Friedman等學(xué)者認(rèn)為TGF-β是最主要的致肝纖維化的細(xì)胞因子，在肝臟內(nèi)主要由庫(kù)普弗細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌。TGF-β以激活HSC，使細(xì)胞表面的I型受體磷酸化，活化的I型受體可激活Smad2、Smad3(為受體激活的Smad亞類成員)，后者與Smad4結(jié)合成異二聚體并轉(zhuǎn)位至胞核，從而調(diào)節(jié)ECM等目的基因的轉(zhuǎn)錄；也可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶合成，促進(jìn)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)、纖溶酶原激活物抑制因子PAI-1生成，使ECM降解減少，最終引起大量ECM沉積。TNF-α是一類主要由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，可促進(jìn)肝內(nèi)HSC細(xì)胞及纖維母細(xì)胞的增殖，并促使HSC向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化。TNF-α在肝纖維化的形成過(guò)程中起著重要的促進(jìn)作用。干擾素是具有確切抗纖維化作用的細(xì)胞因子，目前已被美國(guó)肝病年會(huì)正式推薦使用。它的作用機(jī)機(jī)制可能是抑制HSC細(xì)胞增殖分化，減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成，促進(jìn)其降解；可以降低成纖維細(xì)胞I、III膠原mRNA水平，減少膠原合成；可以經(jīng)JAK1/STAT1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)激活抑制因子Smad7，抑制TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化因子Smad3/Smad4的磷酸化，從而抑制TGF-β的信息傳遞途徑，達(dá)到抗纖維化的作用。但是基因工程干擾素存在著半衰期短、易產(chǎn)生抗體、與靶器官以外的器官組織及細(xì)胞受體廣泛結(jié)合、大劑量應(yīng)用不良反應(yīng)明顯等缺點(diǎn)。
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，抗肝纖維化藥物的研究進(jìn)展較快?？垢卫w維化藥物包括細(xì)胞因子拮抗劑(如Decorin)、影響膠原合成代謝類藥物(如多聚不飽和卵磷脂)、中草藥(如丹參)及基因治療等。雖然目前抗肝纖維化研究的藥物種類繁多，它們?cè)隗w外試驗(yàn)及動(dòng)物模型均呈現(xiàn)一定的作用，但是臨床應(yīng)用尚無(wú)十分有效的藥物，有待于進(jìn)一步研究。
巨噬細(xì)胞(macrophage，Mφ)在肝纖維化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明痤瘡丙酸桿菌(ATCC12930)可能刺激單核巨噬細(xì)胞分化為炎癥Mφ，產(chǎn)生部分IFN-γ(抗纖維化因子)，具備一定抑瘤作用；而NCPP(來(lái)自短棒狀桿菌CMCC65101)可以刺激單核巨噬細(xì)胞分化為活化Mφ，可明顯促進(jìn)小鼠產(chǎn)生較高水平的IFN-γ，較低水平TNF-α，且具有明顯的抑瘤作用；NCPP高、中、低劑量長(zhǎng)期重復(fù)給藥，猴肝病理檢查沒(méi)有明顯的纖維化現(xiàn)象。即NCPP活化Mφ，不引起肝纖維化。
實(shí)驗(yàn)例5研究表明，肝纖維化的形成是一個(gè)緩慢復(fù)雜的過(guò)程，HSC的增生和激活在這一過(guò)程中處于中心環(huán)節(jié)，各種致肝纖維化因素都是通過(guò)這個(gè)環(huán)節(jié)，以HSC為靶細(xì)胞，造成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在肝臟沉積導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生。肝臟炎癥細(xì)胞中的巨噬細(xì)胞-庫(kù)普弗細(xì)胞(Kupffercell，KC)，在此過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。我們的研究顯示，無(wú)細(xì)胞短棒狀桿菌納米級(jí)制劑(NCPP)可以刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分化為活化Mφ，產(chǎn)生較高水平的IFN-γ和較低水平TNF-α，是一種具有抗病毒、抗腫瘤作用的免疫增強(qiáng)劑；獼猴3個(gè)月長(zhǎng)期重復(fù)給予NCPP，取各器官組織(包括肝臟)病理檢查，未見肝纖維化現(xiàn)象。為了研究CPP、NCPP是否具有抗纖維化作用，我們通過(guò)建立免疫損傷性肝纖維化大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?duì)其進(jìn)行了初步研究，結(jié)果報(bào)告如下
1材料與方法1.1材料健康雌性Wistar清潔級(jí)大鼠91只，體重150-200g，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。短棒狀桿菌(corynebacterium parvum，CP，CMCC65101或65102)由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供或采用英國(guó)Wellcome藥廠產(chǎn)品；NCPP是由短棒狀桿菌破碎至納米級(jí)的無(wú)細(xì)胞制劑，制備方法見實(shí)施例2。人血清白蛋白購(gòu)自上海新興血液制品研究所，批號(hào)20001067；弗氏佐劑為Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)為12K8930；無(wú)菌生理鹽水購(gòu)自北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為021120812；大鼠肝臟病理檢查由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理研究室完成。肝功能指標(biāo)采用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院完成。血清PIIINP、COL IV、HA、Laminin采用ELISA方法測(cè)定，試劑盒購(gòu)自大連泛邦化工技術(shù)開發(fā)有限公司(美國(guó)TPI公司產(chǎn)品)。血清IFN-γ、TNF-α、TGF-β1的含量的測(cè)定采用放免法，由北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司完成。
1.2方法1.2.1動(dòng)物模型的建立按王寶恩等在《實(shí)驗(yàn)性免疫性肝纖維化模型的研究》(Chin Med J(中華醫(yī)學(xué)雜志)，1989，69503)報(bào)道的方法建立大鼠免疫性肝纖維化模型。將人血清白蛋白用生理鹽水稀釋，與等量的不完全福氏佐劑乳化，每只大鼠兩側(cè)腹股溝皮下多點(diǎn)注射，每次注射0.5ml，含白蛋白5mg，致敏過(guò)程共注射3次，第1次注射間隔14天，第2次注射間隔10天。第3次注射10天后，經(jīng)大鼠尾靜脈攻擊注射人血清白蛋白0.5ml/只，含白蛋白5mg，每周2次，共注射8周。
1.2.2給藥治療于造模完成后，將大鼠分為五組，每組10只，肌肉注射給藥。正常對(duì)照組(未造模處理)無(wú)菌生理鹽水0.1ml/只；模型對(duì)照組無(wú)菌生理鹽水0.1ml/只；CP組、NCPP低劑量組NCPP 0.25mg/只；NCPP中劑量組NCPP0.5mg/只；NCPP高劑量組NCPP1mg/只。每周2次，持續(xù)3個(gè)月。
1.2.3標(biāo)本采集及統(tǒng)計(jì)分析于末次給藥后次日，將大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈采血，離心制備血清，分別測(cè)定肝腎功能、血清中PIIINP、COL IV、HA、Laminin以及IFN-γ、TNF-α、TGF-β1的含量；觀察肝臟的外觀，取出肝臟稱重并留取肝左葉做HE染色，鏡下觀察病理學(xué)改變。
統(tǒng)計(jì)分析定量資料數(shù)據(jù)用x±s表示，單因素方差分析；定性資料用頻數(shù)表記錄，秩和檢驗(yàn)分析；P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果2.1大鼠肝臟病理學(xué)檢查結(jié)果正常大鼠肝臟外觀為紫紅色，肝表面光滑有光澤。HE染色顯示肝小葉間無(wú)纖維間隔，沒(méi)有肝細(xì)胞變性、壞死；模型對(duì)照組中大鼠肝臟為淺紫色，表面粗糙無(wú)光澤，肝臟邊緣不齊，肝表面可見結(jié)節(jié)。病理檢查顯示匯管區(qū)及中央靜脈周圍可見結(jié)締組織增加，部分樣本存在肝細(xì)胞氣球樣變性、壞死，可見少量凋亡細(xì)胞，炎細(xì)胞散在或聚集呈灶狀分布；NCPP治療各組大鼠肝臟外觀大致正常，個(gè)別表面略顯粗糙。病理顯示肝臟結(jié)構(gòu)基本正常，匯管區(qū)結(jié)締組織增生，肝組織中纖維結(jié)締組織增生程度明顯減輕，少數(shù)可見假小葉形成，纖維間隔變細(xì)，肝細(xì)胞變性、壞死較輕。高劑量組對(duì)肝纖維化的改善明顯。具體分級(jí)結(jié)果見表9，經(jīng)秩和檢驗(yàn)得P＜0.005，各組的肝纖維化分級(jí)存在程度上的差別。
表9大鼠肝臟病理分級(jí)結(jié)果

2.2各組大鼠肝腎功能的測(cè)定結(jié)果模型對(duì)照組谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)明顯升高，而白蛋白(ALB)降低，與正常對(duì)照組有顯著差異；經(jīng)不同劑量的CP、NCPP治療后，肝功能明顯改善，NCPP中劑量組和高劑量組AST、ALT、TBIL甚至接近正常水平。見表10。
表10NCPP治療前后免疫損傷性肝纖維化大鼠肝腎功能的測(cè)定


**與模型對(duì)照組相比較，P＜0.01，*與模型對(duì)照組相比較，P＜0.05▲▲與空白對(duì)照相比較，P＜0.01，▲與空白對(duì)照相比較，P＜0.052.3各組大鼠血清學(xué)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果模型對(duì)照組血清PIIINP、COL IV、HA及Laminin的含量較正常對(duì)照組明顯增加(P＜0.01)，不同劑量CP、NCPP組各血清學(xué)指標(biāo)較模型對(duì)照組明顯下降，中、高劑量組作用顯著，各指標(biāo)幾乎恢復(fù)正常水平。見表11。
表11 NCPP治療前后免疫損傷性肝纖維化大鼠血清膠原水平的測(cè)定

**與模型對(duì)照組相比較，P＜0.01，*與模型對(duì)照組相比較，P＜0.05▲▲與空白對(duì)照相比較，P＜0.01，▲與空白對(duì)照相比較，P＜0.052.4各組大鼠血清中IFN-γ、TNF-α、TGF-β的測(cè)定結(jié)果，見表12。
表12 NCPP治療前后免疫損傷性肝纖維化大鼠血清細(xì)胞因子水平的測(cè)定

**與模型對(duì)照組相比較，P＜0.01，*與模型對(duì)照組相比較，P＜0.05▲▲與空白對(duì)照相比較，P＜0.01，▲與空白對(duì)照相比較，P＜0.05在我國(guó)，肝纖維化多見于慢性乙肝患者，其所造成的肝臟損傷主要為免疫性損傷，人血清白蛋白所致的大鼠肝纖維化與人類肝臟慢性損傷和纖維化過(guò)程相似，所以，免疫損傷性肝纖維化大鼠是較為理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br> 肝纖維化發(fā)生時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度增生、降解受阻，其主要成分是膠原蛋白，以I型和III型膠原為主，早期纖維化時(shí)III型膠原的比例大于I型，PIIINP可反映III型膠原合成的活性；HA是一種糖胺多糖，由間質(zhì)細(xì)胞合成，肝內(nèi)皮細(xì)胞攝取和降解，可反映肝纖維化和肝損傷；Laminin和COL IV都是構(gòu)成基底膜的主要成分，其水平的升高反映基底膜增生、肝血竇毛細(xì)血管化的情況。對(duì)上述四種血清指標(biāo)的聯(lián)合檢測(cè)，對(duì)肝纖維化的診斷具有一定的參考價(jià)值。
本發(fā)明的試驗(yàn)研究中，對(duì)模型對(duì)照組的病理檢查顯示該組大鼠有明顯的肝纖維化表現(xiàn)，肝功能損傷嚴(yán)重，與正常對(duì)照組比較有顯著差異，CP、NCPP的各個(gè)劑量組對(duì)大鼠肝纖維化模型的治療作用明顯，肝臟組織病理改變向良性方向發(fā)展，肝功能得到較好的改善；血清學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)也顯示NCPP各劑量組血清PIIINP、COL IV、HA及Laminin的含量均低于模型對(duì)照組，接近正常水平，表明肝內(nèi)ECM的合成受到抑制，或降解加速。上述研究提示，采用納米技術(shù)制備的NCPP作為一種非特異性免疫增強(qiáng)劑，對(duì)免疫損傷造成的大鼠肝纖維化具有明顯的治療作用。
目通常認(rèn)為，按免疫功能特性區(qū)分，巨噬細(xì)胞可分為定居巨噬細(xì)胞、炎癥巨噬細(xì)胞和活化巨噬細(xì)胞三類。在某些致炎物質(zhì)的刺激下，庫(kù)普弗細(xì)胞可轉(zhuǎn)化成炎癥巨噬細(xì)胞，分泌活性增強(qiáng)，分泌多種細(xì)胞因子，隨同血小板、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞等分泌的多種細(xì)胞因子及一些化學(xué)介質(zhì)如TGF-β1、TNF-α、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)等共同作用于肝星狀細(xì)胞(HSC)，使其激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)大量ECM的合成增加，降解減少，導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生。然而，當(dāng)巨噬細(xì)胞在某些細(xì)胞因子或其他刺激因素的的誘導(dǎo)下，成為活化巨噬細(xì)胞時(shí)，分泌功能減弱，吞噬功能明顯增強(qiáng)，同時(shí)分泌白介素-10(IL-10)、干擾素(IFN)等抗纖維化因子的能力也增強(qiáng)，有可能逆轉(zhuǎn)肝纖維化的過(guò)程。我們以往的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)給與小鼠不同刺激藥物其腹腔巨噬細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為炎癥巨噬細(xì)胞或活化巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生不同的效果，結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們初步分析，NCPP可能通過(guò)將庫(kù)普弗細(xì)胞轉(zhuǎn)化成活化巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)IFN-γ的分泌，抑制HSC的活化和增殖，繼而抑制ECM的合成或促進(jìn)其降解而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。
實(shí)驗(yàn)例61.短棒狀桿菌制劑(CPP)或無(wú)細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCP)對(duì)肺纖維化的治療。
特發(fā)性肺纖維化(IPF)，是指原因不明并以普通型間質(zhì)性肺炎(UIP)為特征性病理改變的一種慢性炎癥性間質(zhì)性肺疾病，它是嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一。目前，對(duì)IPF治療尚無(wú)確實(shí)、有效的方法。本發(fā)明研究了一種短棒狀桿菌制劑(CPP)或無(wú)細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCP)治療IPF的有效性。實(shí)驗(yàn)中，確診的IPF患者180例，診斷均符合2000年美國(guó)胸科學(xué)會(huì)/歐洲呼吸病學(xué)會(huì)(ATS/ERS)提出的IPF(UIP)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。入選患者按性別、入院順序編碼。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為常規(guī)治療組、CPP組和NCP組，常規(guī)治療組服用，潑尼松0.5mg/kg，每日1次口服，療程4周，CPP組注射規(guī)格為1mg/mL(6×109/mL)的痤瘡丙酸桿菌1.0mL，NCPP組注射規(guī)格為1mg/mL-1(6×109/mL)的本發(fā)明實(shí)施例3的NCPP 0.5mL，療程4周.治療三周后，NCP組組肺功能及血?dú)庵笜?biāo)較治療前有較明顯改善(P＜0.05)，CPP組有一定改善，NCP組有效率89.86％，CPP組有效率63.5％，比常規(guī)治療組明顯增高(P＜0.05)。
其它實(shí)施例的NCPP也具有基本相同的效果。
2.短棒狀桿菌制劑(CPP)或無(wú)細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCP)對(duì)心肌纖維化的治療心室重構(gòu)作為高血壓最常見的并發(fā)癥之一，是以心肌細(xì)胞增生及間質(zhì)膠原網(wǎng)絡(luò)數(shù)量、質(zhì)量發(fā)生改變?yōu)樘卣鞯淖兓?。尤其心肌間質(zhì)纖維化使心肌硬度增加，順應(yīng)性下降，導(dǎo)致心臟舒張功能障礙，是心力衰竭、心律失常發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。因此，早期有效地抑制心肌間質(zhì)纖維化、預(yù)防心室重構(gòu)有極其重要的臨床意義。原發(fā)性高血壓(EH)引起的左室肥厚(LVH)及心肌間質(zhì)纖維化，作為心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素已為人們重視。其代表了從高血壓到心衰或死亡過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，同時(shí)也有充分證據(jù)表明，LVH及心肌間質(zhì)纖維化是中風(fēng)、心肌梗死、猝死、心絞痛，心衰和腎衰竭的主要危險(xiǎn)因素。
本發(fā)明探討了上述實(shí)施例的短棒狀桿菌制劑(CPP)或無(wú)細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCP)對(duì)心肌纖維化的治療作用，實(shí)驗(yàn)中，原發(fā)性高血壓患者(1999年WHO^ISH診斷標(biāo)準(zhǔn))360例。男240例，女120例；年齡50～72歲，平均(60.5±3.5)歲。經(jīng)常規(guī)檢查排除繼發(fā)性高血壓，糖尿病及慢性肝、腎功能不全、肝纖維化等，并經(jīng)超聲心動(dòng)圖檢查證實(shí)室間隔或左室后壁厚度≥12mm。隨機(jī)分為兩組CPP組和NCP組，CPP組注射規(guī)格為1mg/mL(6×109/mL)的痤瘡丙酸桿菌1.0mL，NCPP組注射規(guī)格為1mg/mL-1(6×109/mL)的本發(fā)明實(shí)施例2的NCPP 0.5mL，療程8周.另選正常對(duì)照組50例(正常對(duì)照組應(yīng)該用什么？)，治療四周后應(yīng)用超聲心動(dòng)圖監(jiān)測(cè)治療前后左心室各項(xiàng)指標(biāo)，同時(shí)采用放射免疫法檢測(cè)血清 型前膠原、透明質(zhì)酸、血管緊張素。結(jié)果高血壓病組治療前與對(duì)照組比較， 型前膠原，透明質(zhì)酸，血管緊張素明顯升高，一氧化氮明顯下降，與治療前比兩組治療后收縮壓，舒張壓，血管緊張素(ng^L)， 型前膠原(Lg^L)，透明質(zhì)酸(Lg^L)，室間隔厚度(mm)，左室后壁厚度(mm)，左室舒張內(nèi)徑(mm)，左室重量(g)，左室重量指數(shù)(g/m2)均有一定的下降(P＜0.05)，一氧化氮(mmol/L)有明顯的升高(P＜0.05)說(shuō)明本發(fā)明的短棒狀桿菌制劑(CPP)或無(wú)細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCP)具有抑制心肌纖維化及左室肥大的作用。
3.本發(fā)明還通過(guò)臨床研究證明，本發(fā)明的上述實(shí)施例的短棒狀桿菌制劑(CPP)或無(wú)細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCP)在用量為對(duì)血管纖維化、腫瘤組織纖維化、腫瘤的放療、化療產(chǎn)生的纖維化病變、腎纖維化、骨髓纖維化以及老年性癡呆等均有一定的作用。
權(quán)利要求
1.一種短棒狀桿菌制劑或無(wú)細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備抗纖維化藥物方面的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抗纖維化包括抗肝纖維化、肺纖維化、心肌纖維化、血管纖維化、腫瘤組織纖維化、腫瘤的放療、化療產(chǎn)生的纖維化病變、腎纖維化、骨髓纖維化或者老年性癡呆。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的用途是在制備抗肝纖維化藥物方面的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的短棒狀桿菌制劑一種非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，由短棒狀桿菌經(jīng)甲醛滅活后制成的死菌苗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的短棒狀桿菌制劑為2000版《中國(guó)生物制品規(guī)程》。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的無(wú)細(xì)胞短棒狀桿菌制劑是由短棒狀桿菌經(jīng)破碎制備的無(wú)細(xì)胞制劑，粒度小于100nm；優(yōu)選所述無(wú)細(xì)胞短棒狀桿菌制劑的粒度為10-50nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的無(wú)細(xì)胞短棒狀桿菌制劑熱原小于160EU/ml，蛋白質(zhì)含量10-40％(g/g)，核酸含量3-25％(g/g)，其余為多糖；優(yōu)選，所述的無(wú)細(xì)胞短棒狀桿菌制劑熱原小于60EU/ml，蛋白質(zhì)含量20-30％(g/g)，核酸含量3-10％(g/g)，其余為多糖。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7任何一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述的短棒狀桿菌學(xué)為粉刺丙酸桿菌，菌號(hào)為76-27、H-84或77-1。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的短棒狀桿菌為粉刺丙酸桿菌77-1。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-8任何一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述的無(wú)細(xì)胞短棒狀桿菌制劑是通過(guò)下述步驟制備的1)CP工作種子批菌種連續(xù)2-4次傳代后接種于大瓶或營(yíng)養(yǎng)罐，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天；2)收集無(wú)雜菌污染的菌體，加熱煮沸15-60分鐘得到菌液；3)無(wú)菌試驗(yàn)合格的菌液經(jīng)洗滌后，用破碎裝置破碎菌體；4)菌體破碎后的懸液經(jīng)離心后收集沉淀，洗滌沉淀制成懸液；5)將懸液加熱滅菌，得到NCPP。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種無(wú)細(xì)胞短棒狀桿菌納米級(jí)制劑(NCPP)在制備抗纖維化藥物方面的用途，特別是在制備抗肝纖維化藥物方面的用途。所述的NCPP是由CP經(jīng)破碎制備的無(wú)細(xì)胞納米級(jí)制劑，其粒度小于100nm。具有低熱原、粒度均一、無(wú)甲醛殘留的特點(diǎn)。NCPP由于具有納米級(jí)，吸收度、擴(kuò)散度明顯提高，與全菌體制劑具有相同的脾激活及抑瘤等生物學(xué)活性，并可降低發(fā)燒、胸痛、注射局部紅腫、硬結(jié)等副作用。本發(fā)明的NCPP為免疫調(diào)節(jié)劑，在肌體的纖維化治療方面，例如抗肝纖維化、抗肺纖維化方面，有著很好的應(yīng)用；尤其是在抗肝纖維化方面，作用顯著。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1868487SQ200610076228
公開日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2006年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月19日
發(fā)明者高尚先, 李守悌 申請(qǐng)人:中國(guó)藥品生物制品檢定所